張維芯，周 青，戴國梁，鄒建東，寇建秋

江蘇省中醫(yī)院，江蘇 南京 210029

世界衛(wèi)生組織對此次新型冠狀病毒肺炎（Corona Virus Disease 2019，COVID-19）疫情在全球的風(fēng)險評估為：非常高。通過全基因組比對，郝沛等［1］發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2是通過S-蛋白與人血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（Angiotensin-converting enzyme 2，ACE2）互作的分子機制感染人呼吸道上皮細(xì)胞。JAMES DIAZ［2］也證明 了ACE2 通過SARS-CoV-2 進入宿主細(xì)胞的表面受體，是病毒能否成功感染的關(guān)鍵因子。

目前，中草藥憑借其“多有效成分-多作用靶點-多信號通路”的特性較西藥的“直線-單靶點”特性，在多種病毒性疾病的治療中占有一定優(yōu)勢。本研究以SARS-CoV-2 感染過程關(guān)鍵靶蛋白ACE2為靶點，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法進行中藥及其單體化合物的篩選；并從主治癥候群、配伍角度，多層次、多角度探討中草藥治療COVID-19 的相關(guān)機制及潛在可能性，希望為后期藥物研發(fā)及COVID-19的治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 ACE2 三維結(jié)構(gòu)確定與疾病相關(guān)蛋白分子作用構(gòu)建基于建勛課題組解析SARS-CoV-2 S 蛋白RBD 端與人細(xì)胞受體ACE2 蛋白復(fù)合體2.5 分辨率晶體結(jié)構(gòu)、青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室（http://ncovtarget.qnlm.ac/web/mg/hm）提供的COVID-19 藥物靶標(biāo)結(jié)構(gòu)信息共享平臺系統(tǒng)，以及美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）和德州大學(xué)奧斯汀分校（UT Austin）研究成果，構(gòu)建ACE2 三維結(jié)構(gòu)（圖1）［3-4］。將其帶入在線網(wǎng)站String 11.0（https//string-db.org），分別從生物化學(xué)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和遺傳網(wǎng)絡(luò)角度研究ACE2 蛋白與疾病相關(guān)蛋白分子間的關(guān)系。

圖1 ACE2三維結(jié)構(gòu)

1.2 “葛根-柴胡”作用靶點獲取

1.2.1 “葛根-柴胡”活性成分及靶標(biāo)蛋白篩選借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺TCMSP（http://tcmspw.com/tcmsp.php），以“ACE2”為關(guān)鍵詞，搜索作用于ACE2的中草藥及活性成分（圖2）。結(jié)合COVID-19的臨床特征［5］——發(fā)熱，選擇具有解肌退熱、和解少陽的“葛根-柴胡”作為潛在藥物。以口服生物利用度（OB）≥24%，生物活性分子的類藥性（DL）≥0.20 作為“柴胡-葛根”活性成分篩選標(biāo)準(zhǔn)，并得到相關(guān)標(biāo)靶蛋白。

圖2 作用于ACE2的中草藥及其活性成分

1.2.2 “葛根-柴胡”活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建借助Uniprot（https://www.uniprot.org）、PubMed（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）和GeneCards（https://www.genecards.org/）在線數(shù)據(jù)庫，根據(jù)活性成分和靶標(biāo)蛋白的中心度值（Betweenness Centrality）、親中心度（Closeness Centrality）、度值（degree）查詢“葛根-柴胡”活性成分靶標(biāo)蛋白對應(yīng)基因名，使用Cytoscape 3.7.2（http://www.cytoscape.org/）軟件構(gòu)建活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)，進行“葛根-柴胡”活性成分-靶標(biāo)蛋白網(wǎng)絡(luò)可視化構(gòu)建。

1.2.3 “葛根-柴胡”活性成分靶點通路可視化分析將“葛根-柴胡”活性成分作用靶點導(dǎo)入DAVID 6.7（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫，通過輸入靶基因名稱列表并限定物種為人，將所有靶基因名稱校正為官方名稱（official gene symbol），進行GO（Gene Ontology）生物學(xué)過程富集分析；設(shè)定閾值P＜0.05，進行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）信號通路富集分析；使用在線繪圖網(wǎng)站Omishare Tools（http://www.omicshare.com/tools/index.php/）將結(jié)果可視化。

1.2.4 “葛根-柴胡”活性成分-ACE2 靶點分子對接依據(jù)青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室共享的COVID-19 藥物靶標(biāo)，選取其中Spike-RBD，ACE2 蛋白和Mpro 蛋白，采用Swiss-Model 同源模建方法，經(jīng)力場限制性優(yōu)化后的分子結(jié)構(gòu)，將“葛根-柴胡”活性成分的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Chem3D 獲取其3D 結(jié)構(gòu)，進行去氫離子化并使其能量最小化。使用Ledock（http://www.lephar.com/）進行小分子與蛋白對接，取打分最高的構(gòu)想運用PyMOL 2.3.0分析并作圖。

1.3 “葛根-柴胡”臨床數(shù)據(jù)篩選參考《中醫(yī)方劑大辭典》，檢索以“葛根”“柴胡”為君藥治療外感、溫病、瘟疫的中醫(yī)方劑，建立方劑數(shù)據(jù)庫，運用SPSS Modeler 14.1 網(wǎng)絡(luò)模型，統(tǒng)計上述方劑主治的臨床證候及中草藥配伍關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 “葛根-柴胡”活性成分通過TCMSP檢索到“葛根-柴胡”活性成分367個，其中18個來自葛根，349個來自柴胡。以O(shè)B≥24%、DL≥0.20篩選出活性成分28個，其中5個來源葛根，23個來源柴胡。見表1。

表1 “葛根-柴胡”活性成分基本信息

2.2 “葛根-柴胡”活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)“葛根-柴胡”活性成分-靶點網(wǎng)絡(luò)共包含270個節(jié)點（19個化合物節(jié)點、251個靶點節(jié)點）和527條邊，平均每個活性成分與27.7個靶點相互作用，每個靶點平均與2.1個活性成分相互作用；其中52.6%的活性成分作用靶點≥12個，其中靶點≥30個的活性成分有7個，排名前5 位的活性成分分別是槲皮素quercetin MOL000098、葛根素puerarin MOL012297、山柰酚kaempferol MOL000422、芒柄花黃素formononetin MOL000392、β-谷甾醇beta-sitosterol MOL000358，分別能與147、103、60、37、36個靶點蛋白發(fā)生相互作用；從靶點角度，排名前5位的是PTGS2、PPARG、PTGS1、AR、NOS2，分別能與11、10、10、9、9個化合物發(fā)生相互作用。方形代表葛根中化合物，六邊形代表柴胡中化合物，圓形代表靶點，每條邊表示活性成分與靶點之間的相互作用關(guān)系。見圖3。

圖3 葛根-柴胡藥對中化合物-靶點網(wǎng)絡(luò)

2.3 “葛根-柴胡”活性成分與ACE2蛋白的核心網(wǎng)絡(luò)(PPICN)構(gòu)建將ACE2帶入String 11.0進行分析，得出ACE2的PPICN，得到ACE2的直接/間接作用蛋白共11個。通過在線韋恩圖求得“葛根-柴胡”活性成分作用靶點與ACE2的交集基因共3個，分別為DPP4、ACE2、AGTR1。見圖4—5、表2。

表2 “葛根-柴胡”活性成分與ACE2直接/間接作用蛋白的交集基因

圖4 ACE2蛋白相互作用核心網(wǎng)絡(luò)（PPICN）

2.4 “葛根-柴胡”活性成分靶點通路分析DAVID中GO功能富集分析得到GO條目2097個（P＜0.05），其中生物過程（BP）條目1684個，細(xì)胞組成（CC）條目116個，分子功能（MF）條目297個，生物過程、細(xì)胞成分和分子功能分別占80.31%、14.16%和5.53%。KEGG通路富集篩選得到25條信號通路（P＜0.05），涉及非小細(xì)胞肺癌和小細(xì)胞肺癌信號通路等，其中非小細(xì)胞肺癌通路涉及PRKCA-E2F1-EGFR-PIK3CGE2F2-RXRA-ERBB2-TP53-AF1-RB1-BAD-PRKCB-AKT1-MAPK1-CCND1-CASP9-RASSF1-EGF；小細(xì)胞肺癌通路涉及E2F1-PIK3CG-E2F2-PTGS2-RXRA-RELA-TP53-NFKBIA-RB1-BCL2L1-CDK2-AKT1-CCND1-CDKN1BCASP9-BCL2-NOS2-IKBKB-MYC-CHUK（圖6—7）。

圖6 “葛根-柴胡”活性成分作用靶點KEGG富集分析

圖5 與ACE2直接/間接作用蛋白的交集基因

圖7 “葛根-柴胡”活性成分靶標(biāo)GO富集分析

2.5 “葛根-柴胡”活性成分與Spike-RBD、ACE2和Mpro分子對接結(jié)果將“葛根-柴胡”排名前5位的化合物槲皮素、葛根素、山奈酚、芒柄花黃素和β-谷甾醇化合物離子化單體與Spike-RBD、ACE2和Mpro進行分子對接，結(jié)果顯示葛根素與Spike-RBD、ACE2的結(jié)合性最好，槲皮素與Mpro的結(jié)合性最好。見表3及圖8—9。

圖8 槲皮素、葛根素、山柰酚、芒柄花黃素和β-谷甾醇化合物離子化

表3 槲皮素、葛根素、山柰酚、芒柄花黃素和β-谷甾醇作用于Spike-RBD、ACE2和Mpro的結(jié)合效能

圖9 “葛根-柴胡”活性成分與Spike-RBD、ACE2和Mpro的分子對接結(jié)果

2.6 “葛根-柴胡”方劑數(shù)據(jù)挖掘結(jié)果共收錄“葛根”“柴胡”治療外感、溫病、瘟疫、疫病的方劑110首，涉及方書44本，其臨床癥候包括惡寒、發(fā)熱、骨節(jié)疼痛、心煩、口渴、項強等，惡寒、頭痛、身熱頻次最高；臨床配伍中，與“葛根-柴胡”配伍頻次最高的其他藥物為生石膏、黃芩、知母、甘草。見表4及圖10—11。

圖10 “葛根-柴胡”主治癥候群

表4 “葛根-柴胡”方劑涉及方書基本信息

圖11 “葛根-柴胡”藥物核心配伍

3 討論

疫病是指感受疫癘之氣造成的一時一地大規(guī)模流行的急性傳染病總稱，又稱瘟疫［6］。東漢時期張仲景在《傷寒雜病論》自序中稱：“余宗族素多，向余二百，建安紀(jì)年以來猶未十稔，其死亡者，三分有二，傷寒十居其七?！睆?0%的死亡率看，疫病流行在當(dāng)時相當(dāng)猖獗。元代王履《醫(yī)經(jīng)溯洄集》中指出［7］，瘟疫，乃感天地惡毒異氣；治療原則吸取劉河間清熱瀉火思想，主張溫病“治以辛涼占寒”，其疾病的轉(zhuǎn)機為“熱自內(nèi)達(dá)外”。明代龔?fù)①t《壽世保元》中云：“瘟疫之病，皆是大熱之癥，不町妄用熱藥。”［8］明代吳又可《溫疫論》中指出［9］：“夫瘟疫之為病，非風(fēng)、非寒、非暑、非濕，乃天地間別有一種異氣所感?！睆娬{(diào)需進行病因治療，提出了“一病只須一藥之治”的設(shè)想，為傳染病的專病專治開創(chuàng)了思路。COVID-19 屬中醫(yī)“疫病”范疇［10-12］，其主癥為：發(fā)熱、乏力、咳嗽；病位在半表半里之間；對于以發(fā)熱為主癥的，國醫(yī)大師熊繼柏推薦輕清宣透療法，如小柴胡湯或者小柴胡湯合桑菊飲。

最新基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)表明，ACE2 是COVID-19 病毒S 蛋白的細(xì)胞受體；COVID-19 的S 蛋白可能通過結(jié)合細(xì)胞受體ACE2 引導(dǎo)病毒進入宿主細(xì)胞，且冠狀病毒RBD 端與ACE2 的結(jié)合親和力越高，病毒的感染性和致病性越強。SARS-CoV-2 感染患者出現(xiàn)多臟器損傷，推測其機制可能為SARS-CoV-2結(jié)合ACE2，下調(diào)ACE2 的表達(dá)，使ACE-Ang Ⅱ軸和ACE2-Ang-（1-7）軸平衡失調(diào)，促炎因子表達(dá)升高，誘發(fā)炎癥風(fēng)暴，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)［13］。據(jù)中國中醫(yī)研究院吳文清對中國疫病的統(tǒng)計［14］，從西漢到清末，中國至少發(fā)生過321 次大型瘟疫，在有限的時間和區(qū)域內(nèi)，中醫(yī)藥一次又一次與各種疫病展開了生死對決，并控制了疫情蔓延。TANG S 等［15］在Lancet 雜志上發(fā)表文章指出，中醫(yī)藥在控制疫情大規(guī)模爆發(fā)方面具有重要作用。

本研究基于青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點國家實驗室提供的COVID-19 藥物靶標(biāo)信息，針對SARSCoV-2感染過程關(guān)鍵靶蛋白ACE2進行中草藥及其有效活性成分的篩選，并基于中醫(yī)經(jīng)典醫(yī)籍，分別從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、經(jīng)典醫(yī)籍方面，多層次、多維度對“葛根-柴胡”治療COVID-19 進行了探索性研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示，“葛根-柴胡”藥對較高的活性成分均可作用于ACE2，分子對接結(jié)果顯示槲皮素、葛根素與ACE2 的結(jié)合能力高于洛匹那韋和利托那韋，同時槲皮素、葛根素、山柰酚與Mpro 結(jié)合能力也高于洛匹那韋和利托那韋。通過對經(jīng)典醫(yī)籍的數(shù)據(jù)整理，我們可以看出“葛根-柴胡”治療外感、溫病、疫病的最主要癥候為：惡寒、身熱、頭痛。溯源文獻，明代《本草正》［16］：葛根，其性涼散，其氣輕，善達(dá)諸陽經(jīng)，且以陽明為最，善解表發(fā)汗，善解溫?zé)釙r行疫疾，凡熱而兼渴者，此為最良，當(dāng)以為君，而佐以柴?！侗静菡罚翰窈?，其性涼，其性散，味微苦，屬足少陽膽經(jīng)藥，治寒熱往來，療瘧疾，除潮熱，為和解要劑。“葛根-柴胡”藥對具有確切的解肌退熱、和解少陽功效，與目前報道的SARS-CoV-2 臨床癥狀較為吻合，具有潛在的治療COVID-19功效，為深層次探索中醫(yī)藥治療COVID-19 提供了依據(jù)。