王紅坤，王藝樺，周丹銀，董 坤，張 炫

（云南農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術學院，云南 昆明 650201）

2006 年，蜂群崩潰綜合癥（Colony collapse disorder，CCD）在全球范圍暴發(fā)，使蜜蜂病毒的危害引起人們的高度重視[1]，蜜蜂病毒與其他病原的聯(lián)合侵害導致蜜蜂種群數(shù)量持續(xù)減少[2]。其中，蜜蜂殘翅病毒（Deformed wing virus，DWV）因其導致典型的發(fā)病癥狀，被作為蜜蜂病毒病研究的主要對象。DWV 可以侵染所有蜜蜂種群和性別（蜂王、工蜂和雄蜂）以及蜜蜂所有發(fā)育階段的個體[3]。病毒有著長期共生和應急性侵染2 種生存策略，可通過調(diào)節(jié)病毒顆粒數(shù)量達到長期潛伏和急性致死的目的[4]。目前，低水平的DWV 感染非常普遍[5]。DWV 易變異、多因素聯(lián)合致病[6]，是全球蜜蜂種群中最流行的病毒，也是寄主范圍最廣的蜜蜂病毒[7]。由于缺乏病毒傳播動力學、發(fā)病機制、流行病學和寄主免疫學等方面的知識及相關數(shù)據(jù)，蜜蜂病毒病的流行與傳播機制仍未得到完全揭示，所以對其進行有效防控成為養(yǎng)蜂業(yè)的一大難點[8]。

對長期呈隱性感染的DWV 進行有效防控的基礎是建立高靈敏度的診斷技術，實時熒光定量PCR技術診斷病毒病具有快速、靈敏度高、特異性強的特點，是DWV 診斷中運用最為廣泛的技術[9]。實時熒光定量PCR 技術主要有TaqMan 探針法和SYBR Green Ⅰ染料法，有研究報道了采用TaqMan-MGB探針熒光定量RT-PCR 法檢測DWV 感染情況[10]，采用TaqMan 探針熒光定量PCR 方法檢測DWV 和急性蜜蜂麻痹病毒（ABPV）感染情況[11]，以及檢測DWV、ABPV、蜜蜂黑蜂王臺病毒（BQCV）、慢性蜜蜂麻痹病毒（CBPV）、囊狀幼蟲腐臭病毒（SBV）和狄斯瓦螨病毒1（VDV1）等6 種主要蜜蜂病毒的感染情況[12]。目前多采用TaqMan探針法進行DWV 病原監(jiān)測、流行病學調(diào)查和病毒定量分析研究。TaqMan探針法需要特異性探針，費用相對染料法更加昂貴，且探針的保守性及設計要求相對染料法更加苛刻；而染料法在靈敏度及特異性方面與探針法無明顯差異，適用于科研及臨床應用[13]。

實時熒光定量PCR 檢測技術分為一步法和兩步法。有文獻報道了采用一步法熒光定量RT-PCR檢測技術研究西方蜜蜂[14]和東方蜜蜂[15]、蜂蛹[16]、糞便[17]、瓦螨[18]的DWV 感染。一步法熒光定量PCR 檢測和兩步法熒光定量PCR 檢測均可快速、有效地診斷蜜蜂病毒，其中一步法熒光定量PCR 檢測的cDNA 合成和PCR 反應在一個管中完成，縮短了反應時間，更快速、簡便；但兩步法熒光定量PCR 檢測的靈敏度更高，運用兩步法熒光定量PCR 檢測以色列急性麻痹病毒（IAPV）、DWV、ABPV、BQCV 的靈敏度均高于一步法熒光定量PCR[19]。目前，對DWV的實時熒光定量PCR 檢測多采用一步法熒光定量RT-PCR 檢測技術，且多為探針法，還未見兩步法（染料法）熒光定量PCR 檢測技術的報道。為此，通過對DWV 保守基因片段設計特異性引物，建立基于染料法的DWV 兩步法實時熒光定量PCR 檢測方法，旨在為DWV 的診斷、檢疫及監(jiān)測提供一種高靈敏度、高適用性的精準檢測方法。

1 材料和方法

1.1 樣品采集及保存

2020 年10—12 月于云南農(nóng)業(yè)大學東方蜜蜂研究所校內(nèi)實驗蜂場，分別選取東方蜜蜂實驗蜂群和西方蜜蜂實驗蜂群各4 群，每群每月在蜂箱巢門口隨機采集無癥狀蜜蜂樣品10 只，共計240 份樣品，分別按群按月標記，置于-80 ℃保存。

BQCV 及IAPV 陽性樣品，由云南農(nóng)業(yè)大學東方蜜蜂研究所蜜蜂保護學實驗室提供。

1.2 主要試劑及儀器

TRIzolTMReagent 購自Invitrogen 公司；限制性內(nèi)切酶（HindⅢ、EcoRⅠ）購自Thermo Fisher Scientific公司；EastepTMGel and PCR Clean-up System 試劑盒購自Promega 公司；一步法反轉(zhuǎn)錄RT-PCR 試劑盒、cDNA 第一鏈合成試劑盒、熒光定量預混試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒、DNA MarkerⅡ、RNase-free H2O均購自天根生化科技有限公司；pUC57 質(zhì)粒、DL3000 Marker、即用型無縫克隆試劑盒和TOP10 感受態(tài)細胞購自生工生物（上海）股份有限公司；低熔點瓊脂糖粉、固體及液體培養(yǎng)基購自北京索萊寶公司。

超微量核酸測定儀購自Implen 公司；普通PCR儀和熒光定量PCR儀均購自BIO-RAD公司。

1.3 引物設計與合成

根據(jù)GenBank 公布的DWV 參考序列（NC_004830.2），應用Primer Premier 5.0 軟件，針對其保守基因片段設計實時熒光定量PCR 特異性引物，DWVF （5′-TGTGGTGTAGTAAGCGTCGT-3′ ） 、DWVR（5′-TCATCCGTAGAAAGCCGAGT-3′），預期擴增片段長度為121 bp。引物由生工生物（上海）股份有限公司合成。用RNase-free H2O 溶解至10μmol/L，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 核酸提取

按照TRIzolTMReagent 操作說明，將蜜蜂樣品從-80 ℃冰箱中取出磨碎，在無菌工作臺內(nèi)加入細胞裂解劑，漩渦振蕩、室溫孵育后，加入氯仿混勻，再次孵育；使用臺式高速冷凍離心機在4 ℃下12 000 r/min 離心，使樣品總RNA 與氯仿等分離；將上清水溶液（含樣品總RNA）移入新的離心管中，加入異丙醇，混勻后室溫靜置，再次離心使RNA 沉淀于離心管壁內(nèi)側(cè)；倒掉離心管內(nèi)溶液，加入75%乙醇清洗RNA 沉淀，倒掉乙醇溶液，并用高壓滅菌濾紙吸去剩余乙醇；最后加入100μL RNase-free H2O溶解RNA 沉淀，用超微量核酸測定儀測定，所有樣品OD260/OD280均高于1.9。將RNA 于-80 ℃冰箱暫存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 反應條件的優(yōu)化及RT-PCR檢測

根據(jù)一步法反轉(zhuǎn)錄RT-PCR試劑盒操作說明對提取的RNA 進行擴增，反應體系：RNase-free H2O 9.2 μL，2×FastKing One Step RT-PCR Master Mix 12.5 μL，25×RT-PCR Enzyme Mix 1 μL，上、下游特異性引物（DWVF、DWVR）各0.65 μL，RNA 模板1μL。根據(jù)普通PCR 儀梯度自動設置，選擇55.0、55.7、57.0、59.0、61.4、63.3、64.5、65.0 ℃這8 個梯度對退火溫度進行優(yōu)化，確定最適退火溫度[20]。正式試驗中，采用1 μL RNase-free H2O 替換1 μL RNA模板設置為陰性對照組，對6 個蜜蜂樣品進行RTPCR 擴增，使用1.5% 瓊脂糖凝膠電泳和DNA MarkerⅡ進行檢測，用EastepTMGel and PCR Cleanup System試劑盒對目的片段進行純化回收。

1.6 標準陽性質(zhì)粒模板的制備

利用即用型無縫克隆試劑盒將pUC57 質(zhì)粒DNA 與經(jīng)純化回收后的目的片段連接構(gòu)建重組質(zhì)粒，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細胞TOP10 中，挑取單菌落過夜培養(yǎng)，經(jīng)菌落PCR 初步鑒定，并用內(nèi)切酶HindⅢ和EcoRⅠ對陽性質(zhì)粒進行酶切鑒定，進行1%瓊脂糖凝膠電泳。用質(zhì)粒小提試劑盒提取陽性質(zhì)粒，使用超微量核酸測定儀對陽性質(zhì)粒標準品的濃度和純度進行測定，分裝后置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 標準曲線的建立

根據(jù)熒光定量預混試劑盒操作說明，擴增體系：2×SuperReal PreMix Plus 12.5 μL，上、下游特異性引物（DWVF、DWVR）各0.75 μL，質(zhì)粒標準品1μL，RNase-free H2O 10 μL。將陽性質(zhì)粒標準品10 倍梯度稀釋，以6.58×101～6.58×108拷貝/μL 質(zhì)粒標準品作為模板，每個稀釋梯度設3個重復，使用熒光定量PCR 儀進行熒光定量PCR 試驗。根據(jù)預試驗，選擇最佳的擴增程序：95 ℃15 min；95 ℃10 s，59 ℃30 s，40 個循環(huán)。反應結(jié)束后，繪制標準曲線[21]。

1.8 特異性試驗

以云南大學東方蜜蜂研究所蜜蜂保護學實驗室保存的BQCV、IAPV 質(zhì)粒為模板，進行兩步法熒光定量PCR，反應體系和條件參照1.7。

1.9 敏感性試驗

分別以6.58×100～6.58×107拷貝/μL 的DWV 陽性質(zhì)粒標準品為模板進行普通PCR 反應；同時，按1.7中反應體系和條件進行熒光定量PCR，確定反應的最低檢出量，并比較兩者的敏感性[22]。

1.10 重復性試驗

分 別 以6.58×102、6.58×103、6.58×104、6.58×105拷貝/μL 的DWV 陽性質(zhì)粒標準品為模板，每個梯度設置3個重復，進行兩步法熒光定量PCR檢測，計算組內(nèi)標準差和變異系數(shù)[23]。在3 個不同時間進行熒光定量PCR 檢測，根據(jù)Ct 值計算組間變異系數(shù)，評價建立檢測方法的重復性和穩(wěn)定性[24]。

1.11 蜜蜂樣品的檢測

對收集于云南農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)蜂場的無癥狀東方蜜蜂和西方蜜蜂樣品各120 份提取RNA，使用cDNA 第一鏈合成試劑盒將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。先去除基因組DNA 污染，反應體系：5×gDNA Buffer 2 μL，Total RNA 1 μL，RNase-free H2O 7 μL。42 ℃孵育3 min，然后進行反轉(zhuǎn)錄。將配制好的混合液加入去除基因組DNA的反應液中，混合液體系：10×King RT Buffer 2μL，F(xiàn)astKing RT Enzyme Mix 1μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-free H2O 5 μL。反應程序：42 ℃15 min，95 ℃3 min。用RNase-free H2O將上述反應液稀釋，再加入熒光定量預混試劑，反應體系和條件參照1.7，并與常規(guī)PCR 方法檢測結(jié)果進行比較。將檢出的部分陽性樣品送生工生物（上海）股份有限公司測序，驗證所建立檢測方法的可行性，并調(diào)查云南農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)蜂場DWV 的流行情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 蜜蜂樣品中DWV的RT-PCR檢測結(jié)果

引物退火溫度為59.0 ℃時，條帶亮度最佳。該條件下的6個蜜蜂樣品均僅在120 bp長度附近出現(xiàn)1 個特異性條帶，與預期相符（圖1），表明引物對DWVF、DWVR特異性好。

圖1 蜜蜂樣品中DWV的普通RT-PCR 擴增結(jié)果Fig.1 Results of conventional RT-PCR amplification of DWV in honeybee samples

2.2 DWV陽性質(zhì)粒標準品的制備

利用DWVF、DWVR 引物對構(gòu)建的重組質(zhì)粒過夜培養(yǎng)后進行酶切鑒定，可看到2 個條帶，2.4 kb 的片段和121 bp的PCR 產(chǎn)物片段，與預期相符（圖2）?？梢?，重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，能夠作為標準陽性質(zhì)粒模板使用，計算出DWV 陽性質(zhì)粒標準品濃度為6.58×109拷貝/μL。

圖2 DWV陽性質(zhì)粒標準品的酶切鑒定Fig.2 Enzyme digestion identification of DWV positive plasmid standard

2.3 兩步法實時熒光定量PCR標準曲線的建立

將2.2 中的陽性質(zhì)粒標準品進行10 倍梯度稀釋，根據(jù)優(yōu)化后的反應條件，用建立的兩步法實時熒光定量PCR 檢測方法對不同濃度（6.58×101～6.58×108拷貝/μL）的質(zhì)粒標準品進行檢測，繪制標準曲線，y=-3.301 9x+37.439，R2為0.999 7，擴增效率為100.8%（圖3）。表明梯度稀釋的陽性質(zhì)粒標準品與Ct值之間具有良好的線性關系。

圖3 DWV兩步法實時熒光定量PCR標準曲線Fig.3 DWV standard curve of two-step real-time fluorescence quantitative PCR

2.4 兩步法實時熒光定量PCR方法的特異性試驗結(jié)果

應用建立的兩步法實時熒光定量PCR 方法對蜜蜂保護學實驗室提供的BQCV、IAPV 樣品進行檢測，結(jié)果顯示，除DWV 在Ct 值約為21 時起峰，BQCV、IAPV 在Ct 值 為37.439 之 后 起 峰 或 無 峰（圖4），證明該方法特異性較好。

圖4 DWV兩步法實時熒光定量PCR特異性試驗結(jié)果Fig.4 Results of specificity test of DWV two-step realtime fluorescence quantitative PCR

2.5 兩步法實時熒光定量PCR方法的敏感性試驗結(jié)果

用建立好的兩步法實時熒光定量PCR 方法對10 倍倍比稀釋為6.58×100～6.58×107拷貝/μL 的陽性質(zhì)粒標準品進行敏感性試驗，結(jié)果顯示，最低檢出限為6.58 拷貝/μL（圖5），當循環(huán)數(shù)≤34.73 時即可判定為陽性，且能夠準確定量；而普通PCR 最低檢出量為6.58×104拷貝/μL（圖6），證明該方法靈敏性較好。

圖5 DWV兩步法實時熒光定量PCR靈敏性試驗結(jié)果Fig.5 Sensitivity test results of DWV two-step real-time fluorescence quantitative PCR

圖6 DWV陽性質(zhì)粒標準品的普通RT-PCR 擴增結(jié)果Fig.6 Results of ordinary RT-PCR amplification of DWV positive plasmid standard

2.6 兩步法實時熒光定量PCR方法的重復性試驗結(jié)果

建立的兩步法實時熒光定量PCR 方法的組內(nèi)變異系數(shù)為0.20%～0.66%，組間變異系數(shù)為0.08%～0.98%（表1）?？梢姡狙芯拷⒌臋z測方法具有良好的穩(wěn)定性。

表1 DWV兩步法實時熒光定量PCR組內(nèi)和組間重復性試驗結(jié)果Tab.1 Repeatability test results of DWVtwo-step real-time fluorescence quantitative PCR in and between groups

2.7 樣品檢測結(jié)果

表2結(jié)果顯示，西方蜜蜂的DWV 陽性檢出率普遍高于東方蜜蜂；另外，在采用相同模板RNA 的前提下，采用兩步法實時熒光定量PCR 方法檢測時，總樣本量的陽性檢出率和不同蜂種的陽性檢出率均明顯高于普通PCR。同時，對兩步法實時熒光定量PCR 及普通PCR 陽性產(chǎn)物各隨機挑選12 份東方蜜蜂樣品和12 份西方蜜蜂樣品，經(jīng)測序證實均為DWV基因組片段。以上結(jié)果表明，云南農(nóng)業(yè)大學校內(nèi)蜂場的東、西方蜜蜂DWV 感染率較高，尤其是西方蜜蜂DWV感染率高達100.0%。

表2 普通PCR與兩步法實時熒光定量PCR對蜜蜂樣品DWV感染率檢測結(jié)果Tab.2 Detection of DWV infection rate in bee samples by conventional PCR and two-step real-time fluorescence quantitative PCR

3 結(jié)論與討論

DWV 是一種會導致寄主表現(xiàn)典型發(fā)病癥狀的蜜蜂病毒[25]，感染力強，在狄斯瓦螨的媒介作用下，可進行多寄主跨種傳播[26]；其宿主涵蓋了68 種節(jié)肢動物的10 個目，其中64 種屬于昆蟲綱，4 種屬于蛛形綱[27]；蜂巢內(nèi)儲存的花粉和蜂蜜中的DWV可以保持感染能力6 個月[28]。DWV 一般情況下呈隱性感染，在蜂群受到特定生物壓力或不良環(huán)境條件時，迅速表現(xiàn)發(fā)病癥狀，造成蜂群的衰弱甚至消亡[29]。目前，主要根據(jù)臨床癥狀來檢測和診斷DWV。建立新的高靈敏、特異性強、費用適宜的蜜蜂RNA 病毒定量檢測方法和病毒病診斷技術是進行蜜蜂病毒病研究的必要手段，用以對野生或飼養(yǎng)蜂群病毒載量進行監(jiān)測，掌握蜂群健康動態(tài)，并及時制定有效的病毒病防治措施。實時熒光定量PCR 技術因其簡單、穩(wěn)定、快速以及準確的特點[30]，已成為蜜蜂病毒檢測較為成熟可靠的方法之一。

在選擇實時熒光定量PCR 檢測方法時，與探針法相比，染料法特異性略顯不足，且容易受引物二聚體影響。本研究基于DWV 衣殼蛋白基因保守序列設計的引物特異性強，能夠彌補染料法的缺陷，滿足檢測要求。在此基礎上建立的兩步法實時熒光定量PCR 方法靈敏度高，可達到6.58 拷貝/μL，較WU等[31]建立的拷貝數(shù)為101～109的染料法熒光定量PCR 檢測方法靈敏度更高，且與本研究檢測的BQCV 和IAPV 無交叉反應，特異性良好。重復性試驗結(jié)果表明，組內(nèi)、組間變異系數(shù)均小于0.98%，具有良好的穩(wěn)定性。本研究中，cDNA 第一鏈合成試劑盒在將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA 的過程中，可高效、穩(wěn)定、快速去除基因組DNA 干擾，且其反轉(zhuǎn)錄效率高，通讀二級結(jié)構(gòu)復雜的RNA 模板，適用于易變異的蜜蜂RNA 病毒檢測。本研究建立的兩步法實時熒光定量PCR 檢測方法對蜜蜂樣品的檢測結(jié)果顯示，蜜蜂樣品總數(shù)中DWV 陽性檢出率、東方蜜蜂樣品和西方蜜蜂樣品中DWV 陽性檢出率均明顯高于普通PCR 的檢測結(jié)果。另外，西方蜜蜂的DWV 陽性檢出率普遍高于東方蜜蜂，這與前人的研究成果一致[32]。王蕾等[15]對昆明地區(qū)東方蜜蜂DWV 的檢出率為54.0%。檢出率不同的主要原因可能是采樣蜂群狀態(tài)不同，本研究采集的蜂群群勢均相對較弱，可能已經(jīng)受到DWV 的侵襲或者蜂群狀態(tài)不佳，更易受到DWV 的侵害，而后者樣本主要采自強群蜂群，不帶毒或者病毒含量低。此外，還有可能跟采樣時間、地點及檢測方法有關，尤其是檢測方法，本研究建立的檢測方法靈敏度較高，不易漏檢。本研究中，云南農(nóng)業(yè)大學實驗蜂場DWV 隱性感染率較高，雖未引起大量東方蜜蜂蜂群損失，但是導致東方蜜蜂群勢較弱以及西方蜜蜂蜂群大量損失。因此，提高對DWV 的認識，加強監(jiān)測和防控，切實維護養(yǎng)蜂業(yè)綠色、健康發(fā)展迫在眉睫。

綜上，本研究成功建立了一種靈敏度高、能夠滿足臨床檢測需求的DWV 兩步法實時熒光定量PCR 檢測方法，可為我國蜜蜂殘翅病的診斷、防治、檢疫提供準確、簡便、實惠的檢測方法，為蜜蜂殘翅病的流行病學調(diào)查、疫情監(jiān)測和預警機制的構(gòu)建提供新的技術支持，為有效防治蜜蜂殘翅病提供技術保障。