宋 宇

（遼東學(xué)院，遼寧 丹東 118003）

微生物是土壤腐殖質(zhì)的制造者和土壤形成過(guò)程中最活躍的因素[1]，可調(diào)控土壤生態(tài)平衡和養(yǎng)分物質(zhì)循環(huán)，在農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中起著非常重要的作用[2]。植物可與根際微生物相互作用，植物通過(guò)根系分泌物為根際微生物提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，根際微生物群落結(jié)構(gòu)變化又可影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)[3-5]。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中化肥與農(nóng)藥的使用會(huì)造成土壤酸化等一系列問(wèn)題，綠色生產(chǎn)作為新型農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方式正在廣大農(nóng)村示范與推廣。生物有機(jī)肥是有機(jī)肥料與功能性微生物相結(jié)合的肥料，研究表明，生物有機(jī)肥比化肥能保持更穩(wěn)定的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[6]。在稻米生產(chǎn)中，可通過(guò)施用無(wú)公害又具有一定殺蟲(chóng)能力的生物有機(jī)肥，或通過(guò)稻魚(yú)共作、稻蝦共作、稻鱉魚(yú)蝦共作等方式實(shí)現(xiàn)綠色生產(chǎn)[7-11]。在施用生物有機(jī)肥的稻田中引入河蟹，使稻蟹共生，有助于改善農(nóng)田環(huán)境、收獲河蟹，并可滿足人們對(duì)綠色稻米的需求。

隨著分子生物學(xué)和高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的研究也不斷深入。目前，對(duì)稻田與養(yǎng)殖動(dòng)物共生的根際土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及其多樣性的研究多是基于Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)的16S rRNA 基因測(cè)序分析[12]。廖詠梅等[13]通過(guò)比較稻鴨共育與常規(guī)管理種植水稻的根際土壤微生物種群多樣性發(fā)現(xiàn)，稻鴨共育的水稻根際土壤真菌的種群結(jié)構(gòu)更豐富。如今，基于Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)的宏基因組測(cè)序分析因其獲得的數(shù)據(jù)量更大、微生物信息更多而得到人們的廣泛關(guān)注，已成為各種環(huán)境中微生物功能和代謝通路研究的主要方式之一[14]。目前，有關(guān)稻蟹共生系統(tǒng)中水稻的根際土壤菌群組成及主要代謝通路分析未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，基于Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)，以水稻單作為對(duì)照，利用宏基因組雙端測(cè)序方法來(lái)分析稻蟹共生系統(tǒng)中水稻根際土壤細(xì)菌、古菌和真菌的種類(lèi)和豐度以及主要代謝通路差異，為水稻綠色栽培提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 處理設(shè)置和土壤樣品采集

試驗(yàn)地設(shè)在遼寧省丹東東港市北井子鎮(zhèn)蓋家壩有機(jī)種植農(nóng)場(chǎng)，水稻品種為越光。水稻單作對(duì)照（YJTCS，CK）施用的生物有機(jī)肥為日照益康有機(jī)農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司生產(chǎn)的海藻生物有機(jī)肥（內(nèi)含海藻生物菌），分別在2020 年3 月份和7 月份均按1.35 kg/hm2施用；稻蟹共生系統(tǒng)（HXTCS）中生物有機(jī)肥的施用量和時(shí)間同對(duì)照組，并在4 月末按0.5 kg/hm2投入河蟹苗，10 月初收蟹。于2020 年10 月15 日（水稻成熟期）利用5 點(diǎn)采樣法采集根際土壤。土壤樣品混勻后分成2 份，1 份用于土壤理化指標(biāo)測(cè)定，1 份用于DNA 提取和宏基因組測(cè)序。每個(gè)處理各設(shè)置3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 稻田土壤理化指標(biāo)測(cè)定

土壤pH 值采用酸度計(jì)測(cè)定；速效磷采用碳酸氫鈉浸提-鉬銻抗比色法測(cè)定；速效鉀采用氯化鈣浸提-火焰光度計(jì)法測(cè)定；全氮采用凱氏定氮法測(cè)定；有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀氧化-分光光度法測(cè)定[15]。

1.3 DNA提取、建庫(kù)與宏基因組測(cè)序

利用E.Z.N.A.?Soil DNA Kit（Omega Biotek，美國(guó)）試劑盒進(jìn)行樣品DNA 抽提。完成基因組DNA抽提后，利用TBS-380 微型熒光計(jì)檢測(cè)DNA 濃度，利用NanoDrop 2000 分光光度計(jì)檢測(cè)DNA 純度，利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA 完整性。利用Covaris M220 超聲波破碎儀將DNA 片段化，篩選約400 bp 的片段，使用NEXTflexTMRapid DNA-Seq（Bioo Scientific，美國(guó)）試劑盒構(gòu)建PE 文庫(kù)。使用Illumina NovaSeq 測(cè)序平臺(tái)委托上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行宏基因組測(cè)序。

1.4 宏基因組測(cè)序分析

使 用fastp（https://github.com/OpenGene/fastp，version 0.20.0）對(duì)reads 3′端和5′端的adapter 序列進(jìn)行質(zhì)量剪切[16]；使用基于succinct de Bruijn graphs 原理的拼接軟件MEGAHIT（https://github.com/voutcn/megahit，version 1.1.2）對(duì)優(yōu)化序列進(jìn)行拼接組裝，在拼接結(jié)果中篩選≥300 bp 的contigs 作為最終的組裝結(jié)果[17]；使用MetaGene（http://metagene.cb.k.u-tokyo.ac.jp/）對(duì)拼接結(jié)果中的contigs 進(jìn)行ORF 預(yù)測(cè)[18]。選擇核酸長(zhǎng)度≥100 bp 的基因，并將其翻譯為氨基酸序列；使用CD-HIT（http://www.bioinformatics.org/cdhit/，version 4.6.1）對(duì)所有樣品預(yù)測(cè)出來(lái)的基因序列進(jìn)行聚類(lèi)（參數(shù)為90%identity、90%coverage），每類(lèi)取最長(zhǎng)的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集[19]；使用SOAPaligner 軟件（http://soap.genomics.org.cn/，version 2.21），分別將每個(gè)樣品的高質(zhì)量reads 與非冗余基因集進(jìn)行比對(duì)（95%identity），統(tǒng)計(jì)基因在對(duì)應(yīng)樣品中的豐度信息[20]；使用Diamond（http://www.diamondsearch.org/index.php，version 0.8.35）將非冗余基因集的氨基酸序列與NR 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)（BLASTp 比對(duì)參數(shù)設(shè)置期望值e-value 為1e-5），并通過(guò)NR 庫(kù)對(duì)應(yīng)的分類(lèi)學(xué)信息數(shù)據(jù)庫(kù)獲得物種注釋?zhuān)缓笫褂梦锓N對(duì)應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度[21]。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同稻田根際土壤樣品理化指標(biāo)分析

如表1所示，河蟹引入生物有機(jī)肥稻田后，成熟期稻田根際土壤的pH 值、速效磷和速效鉀含量均有所提升，其中pH 值和速效磷含量與對(duì)照相比差異顯著。HXTCS 的pH 值為6.69，比YJTCS（5.94）高12.63%。有機(jī)質(zhì)和全氮含量降低，但與對(duì)照相比差異不顯著。

表1 不同稻田根際土壤理化指標(biāo)Tab.1 Physichemical indexes of rhizosphere soil in different paddy fields

2.2 不同稻田根際土壤宏基因組測(cè)序結(jié)果分析

2 種稻田根際土壤宏基因組測(cè)序結(jié)果見(jiàn)表2。由表2 可知，基因長(zhǎng)度平均為383.59 bp；有效讀長(zhǎng)平均為51 313 204.33 bp，占平均原始讀長(zhǎng)（52 401 028.34 bp）的97.92%；有效堿基數(shù)平均為7 736 219 405.67 bp，占平均原始?jí)A基數(shù)（7 912 555 278.34 個(gè)）的97.77%。相比16S 多樣性測(cè)序的序列長(zhǎng)度（約200 bp）和有效數(shù)據(jù)量（10～70 M）[22]，宏基因組測(cè)序基因長(zhǎng)度較長(zhǎng)且可產(chǎn)生的有效數(shù)據(jù)量較大（6 G），文庫(kù)覆蓋度更高，可獲得樣品中更多微生物信息。本研究共獲得1 594 699 個(gè)非冗余基因用于生物信息學(xué)分析。

表2 不同稻田根際土壤微生物宏基因組測(cè)序結(jié)果Tab.2 Result of metagenome sequencing for microorganisms in rhizosphere soil of different paddy fields

2.3 不同稻田根際土壤樣品細(xì)菌種群組成分析

2.3.1 細(xì)菌宏基因組測(cè)序結(jié)果 宏基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示，土壤樣品中細(xì)菌界占98.09%。細(xì)菌種群 分 成149 個(gè) 門(mén)、240 個(gè) 綱、408 個(gè) 目、791 個(gè) 科、2 980 個(gè) 屬、19 162 個(gè) 種。YJTCS 有17 669 個(gè) 種，HXTCS 中 有17 777 個(gè) 種。YJTCS、HXTCS 共 有 種16 284 個(gè)，特 有 種2 878 個(gè)。其 中，YJTCS 特 有 種1 385 個(gè)，HXTCS 特有種1 493 個(gè)?？梢?jiàn)，與YJTCS相比，HXTCS的細(xì)菌種群更豐富。

2.3.2 細(xì)菌門(mén)水平的組成及相對(duì)豐度 如圖1 所示，在細(xì)菌門(mén)水平上，YJTCS 和HXTCS 中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)一致，相對(duì)豐度前4 個(gè)門(mén)依次是變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）。4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)在2 種稻田土壤中的相對(duì)豐度為90.86%，在2 種稻田土壤中占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中，YJTCS 中的變形菌門(mén)相對(duì)豐度為43.29%，略高于HXTCS（40.37%）；YJTCS 中的放線菌門(mén)相對(duì)豐度是27.86%，是HXTCS（23.11%）的1.21 倍。HXTCS 中的綠彎菌門(mén)相對(duì)豐度為16.18%，是YJTCS（13.26%）的1.22 倍；HXTCS 中的酸桿菌門(mén)相對(duì)豐度為10.29%，是YJTCS（7.37%）的1.40 倍；HXTCS 中的芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes_d_Bacteria）的相對(duì)豐度是2.19%，是YJTCS（1.10%）的1.99 倍；HXTCS 中的擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度是1.11%，略高 于YJTCS（0.89%）；HXTCS 中 的 疣 微 菌 門(mén)（Verrucomicrobia）的 相 對(duì) 豐 度 是1.14%，高 于HXTCS（0.75%）。

圖1 不同稻田根際土壤細(xì)菌門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.1 Relative abundance of bacteria on phylum level in rhizosphere soil of different paddy fields

2.3.3 細(xì)菌屬水平的組成及相對(duì)豐度 如圖2 所示，在細(xì)菌屬水平上，2種稻田土壤中相對(duì)豐度前十的屬隸屬于4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其中位居前四的菌屬為

圖2 不同稻田根際土壤細(xì)菌屬水平相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of bacteria on genus level in rhizosphere soil of different paddy fields

Unclassified_p_Chloroflexi、 Unclassified_c_Actinobacteria、 Unclassified_p_Acidobacteria、Unclassified_c_Deltaproteobacteria。 上 述 菌 屬 在HXTCS 的相對(duì)豐度分別為13.17%、10.36%、8.30%、6.61%，分別高于YJTCS 的10.52%、7.67%、5.94%、6.33%。而YJTCS 的類(lèi)諾卡氏菌屬（Nocardioides）、脫5 荒 桿 菌 屬（Desulfobacca）、海 草 球 菌 屬（Phycicoccus）和鏈霉菌屬（Streptomyces）的相對(duì)豐度分別為3.57%、1.96%、1.77%、1.37%，分別高于HXTCS 的2.70%、0.95%、0.76%、0.49%。慢生型大豆根瘤菌屬（Bradyrhizobium）也是2 種稻田土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬之一。

2.4 不同稻田根際土壤樣品古菌種群組成分析

2.4.1 古菌宏基因組測(cè)序結(jié)果 宏基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示，土壤樣品中古菌界占1.76%。古菌種群可分成20 個(gè)門(mén)、37 個(gè)綱、57 個(gè)目、88 個(gè)科、184 個(gè)屬、669 個(gè)種。2 種樣品共有種為528 個(gè)，特有種為141 個(gè)。其中，YJTCS 特有種58 個(gè)，HXTCS 特有種83 個(gè)。由此可見(jiàn)，與YJTCS 比較，HXTCS 中的古菌種群更為豐富。

2.4.2 古菌門(mén)水平的組成及相對(duì)豐度 據(jù)圖3，相對(duì)豐度＞1.00%的古菌菌門(mén)只有4 個(gè)，相對(duì)豐度由大到小依次是廣古菌門(mén)（Euryarchaeota）、Unclassified_d_Archaea、深古菌門(mén)（Candidatus_Bathyarchaeota）、奇古菌門(mén)（Thaumarchaeota）。4 個(gè)古菌門(mén)中，廣古菌門(mén)在2 種稻田土壤中相對(duì)豐度為83.68%，處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。其中，廣古菌門(mén)在YJTCS 的相對(duì)豐度為86.12%，高 于HXTCS（79.13%）。Unclassified_d_Archaea 在YJTCS 的相對(duì)豐度為8.76%，是HXTCS（7.24%）的1.21 倍。而深古菌門(mén)在HXTCS 的相對(duì)豐度是6.70%，是YJTCS（3.40%）的1.97 倍。奇古菌門(mén)在HXTCS 的相對(duì)豐度是4.41%，是YJTCS（0.48%）的9.19倍。

圖3 不同稻田根際土壤古菌門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.3 Relative abundance of archaea on phylum level in rhizosphere soil of different paddy fields

2.4.3 古菌屬水平的組成及相對(duì)豐度 根據(jù)測(cè)序 結(jié)果，將相對(duì)豐度＜1.00%的古菌屬歸到其他類(lèi)，具體見(jiàn)圖4。共有17 個(gè)古菌屬的相對(duì)豐度＞1.00%，其中甲烷螺菌屬（Methanospirillum）和甲烷絲菌屬（Methanothrix）共占53.63%，是樣品中的主要菌屬。相對(duì)豐度排名前十的古菌屬中，甲烷螺菌屬在YJTCS的相對(duì)豐度是35.16%，是HXTCS（31.94%）的1.10 倍；YJTCS 中甲烷絲菌屬的相對(duì)豐度是21.96%，是HXTCS（15.13%）的1.45 倍；Unclassified_d_Archaea 在YJTCS 中的相對(duì)豐度是8.76%，是HXTCS（7.24%）的1.21倍；HXTCS中Unclassified_p_Candidatus_Bathyarchaeota 的相對(duì)豐度為7.00%，是YJTCS（3.40%）的2.06 倍；HXTCS 中Unclassified_p_Euryarchaeota 的相對(duì)豐度為3.57%，是YJTCS（2.30%）的1.55 倍；HXTCS 中 產(chǎn) 甲 烷 孢 菌 屬（Methanocella）的相對(duì)豐度為2.97%，是YJTCS（2.15%）的1.38 倍。其余菌屬的相對(duì)豐度在2 種稻田土壤中相差無(wú)幾。

圖4 不同稻田根際土壤古菌屬水平相對(duì)豐度Fig.4 Relative abundance of archaea on genus level in rhizosphere soil of different paddy fields

2.5 不同稻田根際土壤樣品真菌種群組成分析

2.5.1 真菌宏基因組測(cè)序結(jié)果 宏基因組測(cè)序分析結(jié)果顯示，土壤樣品中真菌界和其他占0.15%。真菌種群可分成6 個(gè)門(mén)、29 個(gè)綱、60 個(gè)目、94 個(gè)科、114 個(gè)屬、147 個(gè)種。YJTCS 有124 個(gè)種，HXTCS 有129個(gè)種，2種稻田土壤共有種106個(gè)，特有種41個(gè)。其中，YJTCS 特有種18 個(gè)，HXTCS 特有種23 個(gè)，說(shuō)明河蟹引入生物有機(jī)肥稻田后，真菌物種也略有增加。

2.5.2 真菌門(mén)水平的組成及相對(duì)豐度 如圖5 所示，在真菌門(mén)水平上共注釋出6個(gè)，其相對(duì)豐度大小依次為子囊菌門(mén)（Ascomycota）、擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、毛霉門(mén)（Mucoromycota）、捕蟲(chóng)霉門(mén)（Zoopagomycota）、壺菌門(mén)（Chytridiomycota）和芽枝霉門(mén)（Blastocladiomycota）。子囊菌門(mén)和擔(dān)子菌門(mén)在2 種稻田土壤中的相對(duì)豐度為85.43%，其中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，在2 種稻田土壤的相對(duì)豐度為68.70%，處于絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。HXTCS中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐 度 為72.58%，是YJTCS（64.81%）的1.12 倍。YJTCS 中擔(dān)子菌門(mén)的相對(duì)豐度為19.71%，是HXTCS（13.59%）的1.45 倍。毛霉門(mén)在HXTCS 的相對(duì)豐度為7.57%，低于YJTCS（8.46%）。捕蟲(chóng)霉門(mén)在HXTCS的相對(duì)豐度為2.97%，低于YJTCS（3.73%）。壺菌門(mén)在HXTCS 的相對(duì)豐度為2.21%，略高于YJTCS（1.82%）。芽枝霉門(mén)在HXTCS 的相對(duì)豐度為1.09%，略低于YJTCS（1.47%）。

圖5 不同稻田根際土壤真菌門(mén)水平相對(duì)豐度Fig.5 Relative abundance of fungi on phylum level in rhizosphere soil of different paddy fields

2.5.3 真菌屬水平的組成及相對(duì)豐度 在真菌屬水平上，HXTCS 注釋出100 個(gè)，YJTCS 注釋出97 個(gè)，相對(duì)豐度＞1.00%的共有39個(gè)屬，占72.25%，相對(duì)豐度＜1.00%歸到其他類(lèi)，占27.75%。如圖6 所示，相對(duì)豐度排名前十的真菌屬中，HXTCS 中毛殼菌屬（Chaetomium）的相對(duì)豐度為23.62%，是YJTCS（11.88%）的1.99 倍。木霉菌屬（Trichoderma）在HXTCS 中 的 相 對(duì) 豐 度 為 2.56%，是 YJTCS（0.92%）的2.78 倍。Fibularhizoctonia是擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）、傘菌綱（Agaricomycetes）、阿太菌目（Atheliales）、阿太菌科（Atheliaceae）的新屬，在YJTCS 的相對(duì)豐度為3.93%，是HXTCS（0.46%）的8.54 倍。大團(tuán)囊菌屬（Elaphomyces）在YJTCS 的相對(duì)豐度為6.53%，是HXTCS（4.30%）的1.52 倍。其余真菌屬的相對(duì)豐度在2種稻田土壤中差異不大。

圖6 不同稻田根際土壤真菌屬水平相對(duì)豐度Fig.6 Relative abundance of fungi on genus level in rhizosphere soil of different paddy fields

2.6 不同稻田根際土壤樣品主要代謝通路分析

將非冗余基因集與京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，共有1 594 699個(gè)非冗余基因注釋到KEGG 的代謝通路中，分屬于421 類(lèi)代謝通路。代謝通路中非冗余基因相對(duì)豐度較高的前20 類(lèi)代謝通路如表3所示。基因注釋相對(duì)豐度最高的代謝通路是次生代謝產(chǎn)物的生物合成，在YJTCS 和HXTCS 中各占6.05%和6.73%，該通路共包含類(lèi)黃酮生物合成，異喹啉生物堿生物合成，青霉素、鏈霉素等抗生素的生物合成等21 個(gè)代謝通路。在氨基酸生物合成途徑中共發(fā)現(xiàn)14個(gè)氨基酸代謝通路，其中有8 個(gè)是人體必需氨基酸。三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、戊糖磷酸和糖酵解異生等途徑是碳水化合物的主要代謝通路，可通過(guò)代謝過(guò)程中產(chǎn)生的中間產(chǎn)物為許多物質(zhì)的合成提供原料。從表3 可以看出，HXTCS 在這些代謝通路的基因注釋相對(duì)豐度值均高于對(duì)照組YJTCS。

表3 不同稻田根際土壤樣品主要代謝通路Tab.3 Main metabolic pathways of rhizosphere soil samples in different paddy fields

3 結(jié)論與討論

對(duì)施入生物有機(jī)肥的水稻單作稻田和稻蟹共生系統(tǒng)稻田的成熟期根際土壤樣品進(jìn)行宏基因組測(cè)序分析后發(fā)現(xiàn)，變形菌門(mén)、放線菌門(mén)、綠彎菌門(mén)和酸桿菌門(mén)4 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)相對(duì)豐度達(dá)到90.86%，占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。研究表明，變形菌門(mén)和放線菌門(mén)為富營(yíng)養(yǎng)菌，適宜在有機(jī)碳和有機(jī)氮含量較高的土壤中增殖[23]。而酸桿菌門(mén)是寡營(yíng)養(yǎng)細(xì)菌，其相對(duì)豐度與土壤有機(jī)質(zhì)和氮量呈負(fù)相關(guān)[24]。YJTCS 的有機(jī)質(zhì)含量為26.61 g/kg、全氮量為1.49 g/kg，HXTCS 的有機(jī)質(zhì)含量為20.48 g/kg、全氮量為1.15 g/kg。YJTCS 中的變形菌門(mén)和放線菌門(mén)相對(duì)豐度偏高，而HXTCS中酸桿菌門(mén)的相對(duì)豐度則偏高，這與FIERER 等[24]的研究一致。有研究表明，綠彎菌門(mén)與pH 值呈正相關(guān)[25]。本 研 究 中，HXTCS 的pH 值 為6.69，高 于YJTCS 的5.94，而HXTCS 中綠彎菌門(mén)的相對(duì)豐度也高于YJTCS，這與黃博聰?shù)萚25]的研究結(jié)果一致。

相對(duì)豐度前四的細(xì)菌屬在HXTCS 中的豐度值均高于YJTCS，分別隸屬于前述的四大優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，但尚未有明確的分類(lèi)。類(lèi)諾卡氏菌屬、慢生型大豆根瘤菌屬也是2種稻田土壤中的優(yōu)勢(shì)菌屬。類(lèi)諾卡氏菌屬具有溶磷、產(chǎn)鐵載體及固氮作用[26]。慢生型根瘤菌近期被發(fā)現(xiàn)可調(diào)控稻田中N2O 的排放[27]，對(duì)環(huán)保具有現(xiàn)實(shí)意義。

宏基因組測(cè)序結(jié)果表明，2 種稻田土壤中的真菌門(mén)有6 個(gè)，其中子囊菌門(mén)的相對(duì)豐度最高，2 種稻田土壤中占比68.70%，且其在HXTCS 中的相對(duì)豐度是YJTCS 的1.12 倍。研究證實(shí)，該真菌門(mén)的大量存在可將木質(zhì)素和角質(zhì)素等難分解的物質(zhì)分解成稻田可以吸收利用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[28]，利于稻田養(yǎng)分循環(huán)，從而提升稻田土壤品質(zhì)。最近，SPATAFORA等[29]根據(jù)基因組數(shù)據(jù)對(duì)傳統(tǒng)接合菌門(mén)（Zygomycota）重新劃分，將其歸到毛霉門(mén)和捕蟲(chóng)霉門(mén)2個(gè)真菌門(mén)。擔(dān)子菌門(mén)和傳統(tǒng)的接合菌門(mén)可與植物共生形成菌根，有些可引起植物病害[30]。壺菌門(mén)多為腐生性，可降解角蛋白和甲殼素等難降解材料[13]。在HXTCS中相對(duì)豐度最高的是毛殼菌屬，具有分解纖維素的能力[31]。

2 種稻田土壤中的古菌門(mén)中廣古菌門(mén)占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，其中YJTCS 中廣古菌門(mén)的相對(duì)豐度高于HXTCS，這可能與YJTCS 中的有機(jī)質(zhì)含量高于HXTCS 有關(guān)。有研究報(bào)道，施入有機(jī)肥會(huì)增加有機(jī)質(zhì)含量，增加廣古菌門(mén)的相對(duì)豐度，使稻田中甲烷的排放量增加[32-36]。另有研究表明，利用稻鴨生態(tài)種養(yǎng)可增加田面水溶解氧濃度，促進(jìn)甲烷氧化，從而降低甲烷的排放量[37]。而本研究中為稻蟹共生，可能河蟹在稻田中爬行時(shí)增加了土壤氧濃度，因此抑制了厭氧菌廣古菌門(mén)的生長(zhǎng)，降低了相對(duì)豐度值。但是這種共生模式能否降低甲烷的排放量還有待于深入研究。奇古菌門(mén)在HXTCS 中的相對(duì)豐度是YJTCS 的9.19 倍。有研究報(bào)道，該菌門(mén)是一類(lèi)可同時(shí)參與自然界碳、氮循環(huán)的古菌[38]，因此，該菌門(mén)在HXTCS 中的相對(duì)豐度值高更有利于降解土壤中的有機(jī)物，能更好地促進(jìn)水稻生長(zhǎng)。

對(duì)2 種稻田土壤中的1 594 699 個(gè)非冗余基因進(jìn)行代謝通路分析，共發(fā)現(xiàn)421類(lèi)代謝途徑，包括三羧酸循環(huán)、丙酮酸代謝、戊糖磷酸、糖酵解異生等途徑。三羧酸循環(huán)可利用糖類(lèi)、脂類(lèi)、氨基酸并可以產(chǎn)生大量的ATP 供微生物的生長(zhǎng)。糖酵解異生是微生物對(duì)碳水化合物進(jìn)行代謝的主要方式，是厭氧微生物獲取能量的主要方式[14]。戊糖磷酸途徑不僅可以為微生物提供能量，還可以為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原力，其中間產(chǎn)物也為許多物質(zhì)的合成提供原料。HXTCS 中這些代謝通路的基因注釋相對(duì)豐度值均高于對(duì)照組YJTCS，說(shuō)明河蟹引入生物有機(jī)肥稻田后不僅豐富了微生物的物種組成，還加強(qiáng)了物種代謝能力，有利于降解土壤中的有機(jī)物，為提升生物有機(jī)肥稻田水稻產(chǎn)量、發(fā)展生態(tài)農(nóng)業(yè)打下基礎(chǔ)。