鐘鎮(zhèn)康，周曉玲，王月明，吳 騰，陸世銀，沈新輝

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，廣西 南寧 530001；2.柳州市中醫(yī)醫(yī)院，廣西 柳州 545001）

肝纖維化（hepatic fibrosis，HF）是一種可由多類病因引起的細(xì)胞外基質(zhì)在肝組織中過度積累導(dǎo)致肝組織結(jié)構(gòu)及功能發(fā)生異常的病理變化，是眾多慢性肝病的共同病理改變，也是發(fā)展至肝硬化的必經(jīng)過程，其實(shí)質(zhì)是一種可逆的肝組織損傷的過度修復(fù)［1-5］。目前肝纖維化的西醫(yī)治療方式主要以祛除病因及對(duì)癥治療為主，但由于其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及多個(gè)細(xì)胞、細(xì)胞因子、蛋白及信號(hào)通路等，單一靶標(biāo)干預(yù)往往療效欠佳，例如使用核苷類似物抗病毒治療，即便已獲得滿意的病毒學(xué)效應(yīng)，肝臟炎癥得到有效改善，卻仍然有一部分患者不能完全逆轉(zhuǎn)肝纖維化，且病情仍可呈進(jìn)行性發(fā)展［6］，對(duì)于病因尚不明確的肝纖維化治療顯得更為棘手，肝纖維化如進(jìn)展至肝硬化失代償期或肝癌等將嚴(yán)重威脅患者生命健康［7］，故在病因治療的基礎(chǔ)上，積極有效地抗肝纖維化是阻斷疾病進(jìn)展不可或缺的環(huán)節(jié)［8］。

中醫(yī)藥治療具有多靶點(diǎn)、多層次、整體調(diào)控作用及不良反應(yīng)相對(duì)較少的優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)而成為抗肝纖維化藥物研究的熱點(diǎn)［9-11］。筆者所在團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究中表明了濟(jì)生腎氣湯可促進(jìn)移植后干細(xì)胞向肝臟歸巢，從而發(fā)揮治療肝硬化作用［12］，在臨床研究中也證實(shí)了此方聯(lián)合干細(xì)胞治療可降低肝硬化患者的臨床癥狀積分，改善患者肝功能及肝纖維化指標(biāo)［13］。在前期研究成果的基礎(chǔ)上，筆者發(fā)現(xiàn)采用濟(jì)生腎氣湯加上具有活血化瘀消癥散結(jié)功效的三七與鱉甲具有顯著的抗肝纖維化作用，但具體作用機(jī)制尚未明確，故本研究建立CCI4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型，予中藥灌胃治療，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，觀察治療后肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化，探討其具體干預(yù)通路，從而為濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲抗肝纖維化提供更多科學(xué)理論依據(jù)。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級(jí)雌雄各半SD 大鼠54 只，3~4 周齡，體質(zhì)量（140±10）g，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0014。所有大鼠置養(yǎng)于柳州市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，室溫保持在20~25 ℃，濕度保持在50%~65%，處于自然光照，予普通飼料及正常飲水適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周。實(shí)驗(yàn)大鼠的飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過程遵循了國家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例。

1.2 藥物

濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲（熟地黃40 g、山茱萸20 g、山藥20 g、澤瀉15 g、茯苓15 g、丹皮15 g、肉桂5 g、附子5 g、車前子10 g、牛膝10 g、三七3 g、鱉甲15 g）。以上藥物為農(nóng)本方顆粒制劑，由培力（南寧）藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，將以上藥物顆粒制劑加入純水配制成1.56、3.11、6.22 g/mL 的低、中、高濃度中藥混懸液，放置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

試劑：果爾特級(jí)初榨橄欖油（西班牙，GB/T23347）；CCl4（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，GB/T688-2011）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson 三色染色試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)分別為：G1337、G1080、G1100）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）試劑盒購于南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為C009-2-1、 C010-2-1。 Rat （TGF-β、 Ang-Ⅱ 、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α）ELISA Kit 購自武漢貝茵萊生物科技有限公司，批號(hào)：RA20599、RA20075、RA20662、RA20020、RA20607、RA20035；RNA 提取試劑盒Trizol（Invitrogen，批號(hào)：15596026），購自賽默飛世爾科技有限公司。MonScript RTllI All-in One Mix with dsDNase、MonAmp SYBR Green qPCR Mix（莫納生物科技有限公司，批號(hào)：MR05101、MQ10101）。主要儀器：高速冷凍離心機(jī)（長沙湘銳離心機(jī)有限公司，TGD-20MC），超速低溫離心機(jī)（美國Sigma 公司），光學(xué)顯微鏡Olympus-BH2（日本Olympus 公司），全自動(dòng)生化分析儀（日本日立7170S），全波長酶標(biāo)儀（賽默飛世爾科技有限公司，型號(hào)：1510），核酸蛋白定量檢測(cè)儀（美國Eppendorf公司，型號(hào)：6133），S1000TMTHermal Cycler 基因擴(kuò)增儀（美國BIO RAD 公司），7500 Real PCR System（美國ABI 公司，型號(hào)：4345241）。

1.4 方法

1.4.1 分組與造模 將適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后的大鼠隨機(jī)取出10 只作為對(duì)照組，其余44 只大鼠采用腹腔注射40%CCl4橄欖油溶液（CCl4與橄欖油體積按2∶3 配備），每周2 次，持續(xù)8 周的方法制作肝纖維化大鼠模型。造模結(jié)束后隨機(jī)取4 只大鼠進(jìn)行肝組織活檢，如出現(xiàn)肝細(xì)胞壞死，炎癥細(xì)胞浸潤，膠原纖維形成，肝組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，提示肝纖維化模型制作成功。將造模成功后的大鼠40 只隨機(jī)分為模型組、中藥治療（低、中、高濃度）組，每組10 只。

1.4.2 給藥 藥物劑量根據(jù)人與大鼠體表面積換算法計(jì)算，藥物溶液體積按1 mL/100 g 給予，中藥治療（低、中、高濃度）組分別予濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲混懸液15.6、31.1、62.2 g/kg 灌胃。對(duì)照組及模型組均予等體積蒸餾水灌胃。每天給藥1 次，共4周。灌胃期間不限制大鼠飲食及飲水。

1.4.3 采集標(biāo)本 灌胃結(jié)束后，隔夜禁食12 h，不限飲水，予10%水合氯醛，按0.5 mL/100 g 劑量予腹腔注射麻醉，經(jīng)腹主動(dòng)脈采血后靜置1 h，用離心機(jī)3 000 r/min 離心10 min，獲得上層血清，?80℃保存?zhèn)溆?。采血結(jié)束后，迅速取出肝臟，采集0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm 組織標(biāo)本，一部分予液氮速凍后置于?90℃冰箱保存，用于RT-PCR 檢測(cè)；一部分用10%甲醛固定后，自動(dòng)脫水機(jī)逐級(jí)脫水，浸蠟包埋，作0.3 μm 厚度切片，用于染色后肝組織病理形態(tài)學(xué)的觀察。

1.4.4 肝組織病理形態(tài)學(xué)觀察 將“1.4.3”所得的各組大鼠肝組織切片分別行HE、Masson 染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織炎癥及膠原纖維沉積情況。1.4.5 肝功能檢測(cè) 將“1.4.3”所采集的血清采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組大鼠ALT、AST 含量。

1.4.6 TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α含量測(cè)定 采用ELISA 法，將“1.4.3”所采集的血清按試劑盒說明書步驟嚴(yán)格進(jìn)行操作，運(yùn)用酶標(biāo)儀在450 nm 吸光處讀取OD450值并計(jì)算TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1、IL-1、IL-6、TNF-α 含量。

1.4.7 Col-Ⅰ mRNA、Col-Ⅲ mRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)水平測(cè)定 采用RT-PCR 法測(cè)定，取“1.4.3”中肝組織30 mg，Trizol 一步法提取總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)定所總RNA 濃度，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)成cDNA，隨后以cDNA 為模板進(jìn)行擴(kuò)增。qPCR 反應(yīng)體系：SYBR Green qpcr Mix 10 μL，正 反 向 引 物 個(gè) 各0.4 μL，cDNA 2 μL，Nuclease-Free Water 7.2 μL。反應(yīng)條件：采用三步法，預(yù)變性95 ℃、30 s，變性95 ℃、10 s，退火55～65 ℃、10 s，延伸72 ℃、30 s，共41 個(gè)循環(huán)。以β-actin為 內(nèi) 參 基 因，采 用2-△△Ct法 計(jì) 算Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表 達(dá) 水 平。根 據(jù)Genebank 已 知 序 列 進(jìn) 行Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 引物設(shè)計(jì)，引物由擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列號(hào)如表1。

表1 各基因引物序列Tab 1 Primer sequences of each gene

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，作圖使用GraphPad Prism 5，計(jì)量資料以（±s）表示，多個(gè)樣本間比較采用單因素方差分析，方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，若方差不齊則采用非參數(shù)檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCl4致肝纖維化大鼠肝功能的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠ALT、AST 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功；與模型組對(duì)比，中藥各組ALT、AST 水平均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），其中以中藥高劑量組效果最為明顯。見表2。

表2 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠肝功能指標(biāo)的影響（U/L，n=10，±s）Tab 2 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on liver function（ALT and AST）of rats with CCI4-induced liver fibrosis（U/L，n=10，±s）

表2 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠肝功能指標(biāo)的影響（U/L，n=10，±s）Tab 2 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on liver function（ALT and AST）of rats with CCI4-induced liver fibrosis（U/L，n=10，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，##P＜0.01。

組別對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組AST 13.28±4.57 69.54±12.26**55.72±12.29##49.24±13.28##27.73±11.62##39.844 P＜0.01 FP ALT 21.72±7.21 139.00±20.21**108.36±18.83##92.35±22.80##53.08±20.62##60.448 P＜0.01

2.2 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCl4致肝纖維化大鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)的影響

大鼠經(jīng)腹腔注射40%CCL 48 周后，肝組織病理切片HE、Masson 染色結(jié)果見圖1、2。圖1A 及圖2A 顯示：對(duì)照組肝小葉結(jié)構(gòu)正常，肝細(xì)胞索以中央靜脈呈放射狀均勻緊密排列，肝組織未見炎癥及纖維化改變。與對(duì)照組相比，圖1B 及圖2B 顯示：模型組大部分肝細(xì)胞發(fā)生明顯變性壞死，肝細(xì)胞排列紊亂，壞死的肝細(xì)胞形成纖維間隔將肝實(shí)質(zhì)分成大小不一的肝細(xì)胞團(tuán)，形成假小葉，提示造模成功。與模型組相比，圖1（C、D、E）及圖2（C、D、E）顯示中藥低、中、高劑量組大鼠炎癥及纖維化程度均有不同水平減輕。

圖1 肝組織HE 染色（×10）Fig 1 HE staining of liver tissue（×10）

圖2 肝組織Masson 染色（×10）Fig 2 Masson staining of liver tissue（×10）

2.3 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCl4致肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1的影響

與對(duì)照組相比，模型組肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示造模成功。與模型組相比，中藥各劑量組IL-1、IL-6、TNF-α、TGF-β、CHI3L1 水 平 均 有 明 顯 下 降，差 異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中以中藥中、高劑量組干預(yù)效果最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；對(duì)于Ang-Ⅱ而言，中藥中、高劑量組Ang-Ⅱ水平明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而中藥低劑量組治療效果不明顯（P＞0.05）。見表3、4。

表3 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 的影響（n=10，±s）Tab 3 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and trionyx sinensis on serum IL-1，IL-6 and TNF-α in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表3 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠血清IL-1、IL-6、TNF-α 的影響（n=10，±s）Tab 3 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and trionyx sinensis on serum IL-1，IL-6 and TNF-α in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

TNF-α組別IL-1 IL-6 29.49±3.88 107.25±13.76**94.64±14.81#79.27±13.55##68.89±17.77##48.004 P＜0.01對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FP 53.51±6.50 111.45±20.18**98.82±14.77#84.97±12.58##78.48±9.96##25.977 P＜0.01 75.69±11.10 129.62±19.12**114.90±14.71#104.16±12.58##89.59±15.45##20.145 P＜0.01

表4 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠血清TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 的影響（n=10，±s）Tab 4 Effects of Jisheng Shenqi Decoction on serum TGF-β，Ang-Ⅱand CHI3L1 in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表4 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠血清TGF-β、Ang-Ⅱ、CHI3L1 的影響（n=10，±s）Tab 4 Effects of Jisheng Shenqi Decoction on serum TGF-β，Ang-Ⅱand CHI3L1 in rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

CHI3L1 97.10±10.41 418.90±46.80**334.50±57.33#312.80±59.59##259.20±50.94##60.854 P＜0.01組別對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FP TGF-β 92.16±15.52 229.69±26.43**206.07±29.50#190.01±24.98##171.24±21.26##47.711 P＜0.01 Ang-Ⅱ19.13±2.34 178.34±21.43**171.61±22.01 141.36±19.75##125.96±25.10##104.511 P＜0.01

2.4 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCl4致肝纖維化大鼠 肝 組 織Col-ⅠmRNA、Col-Ⅲ mRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)的影響

與對(duì)照組相比，模型組大鼠肝組織中Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。與模型組相比，中 藥 中、高 劑 量 組Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)均明顯降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；除TGF-β mRNA 外，中藥低劑量組中Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA 表達(dá)也有不同程度降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠肝組織Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)的影響（n=10，±s）Tab 5 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on the expression of Col-ⅠmRNA，Col-ⅢmRNA and TGF-β mRNA in liver tissue of rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

表5 濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲對(duì)CCI4致肝纖維化大鼠肝組織Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)的影響（n=10，±s）Tab 5 Effects of Jisheng Shenqi Decoction plus Panax notoginseng and bionyx sinensis on the expression of Col-ⅠmRNA，Col-ⅢmRNA and TGF-β mRNA in liver tissue of rats with CCI4-induced liver fibrosis（n=10，±s）

注：與對(duì)照組相比，**P＜0.01；與模型組相比，#P＜0.05，##P＜0.01。

組別Col-ⅠmRNA Col-ⅢmRNA TGF-β mRNA 1.014±0.119 2.491±0.204**2.331±0.280 2.140±0.203##2.088±0.217##74.846 P＜0.01對(duì)照組模型組中藥低劑量組中藥中劑量組中藥高劑量組FP 0.989±0.229 2.992±0.291**2.697±0.376#2.596±0.392##2.127±0.312##58.073 P＜0.01 0.922±0.146 1.975±0.223**1.756±0.2871#1.668±0.249##1.516±0.273##27.081 P＜0.01

3 討論

肝纖維化根據(jù)其病理特點(diǎn)及臨床表現(xiàn)，隸屬于中醫(yī)學(xué)“脅痛”、“積聚”、“臌脹”等范疇?！夺t(yī)宗必讀》曰：“積之成也，正氣不足，而后邪氣踞之”，《內(nèi)經(jīng)》曰：“溫氣不行，凝血蘊(yùn)里而不散”，肝纖維化為慢性疾病，病程漫長，久病入絡(luò)，此病基本病機(jī)應(yīng)為虛損生積、正虛血瘀［10］，治療總則應(yīng)以補(bǔ)虛扶正，活血化瘀消積為主。仲景提出“血不利則為水”一說，“血不利”主要體現(xiàn)在瘀血狀態(tài)，“水不利”主要體現(xiàn)在水液停聚，此論述內(nèi)涵體現(xiàn)在血與水生理上同源互化，病理上互為因果，交結(jié)為患的密切關(guān)系?！堆C論》：“水病而累血，血病而兼水”、“瘀血化水，亦是血瘀而兼水也”，由此可知，治瘀血亦可從利水調(diào)氣入手。濟(jì)生腎氣湯出自宋代醫(yī)家嚴(yán)用和《濟(jì)生方》，由仲景金匱腎氣丸中桂枝改為肉桂，干地黃改為熟地黃，加車前子、牛膝組合而成，此方具有溫陽化氣，利水消腫之功，主治腎虛腰重水腫，小便不利。此方內(nèi)寓三補(bǔ)三瀉之法，三補(bǔ)以滋補(bǔ)腎陰為主，有“補(bǔ)腎生髓以生肝”之意，大劑滋陰之藥中少佐桂附之品，意在少火生氣，陽得陰助則生化無窮，溫腎補(bǔ)陽化氣以助活血利水，“三瀉”則為澤瀉、車前子、茯苓等滲泄水濕，調(diào)節(jié)氣機(jī)，唐容川：“治氣即是治水，治水亦即治氣”、“治血者必調(diào)氣”，故予本方溫補(bǔ)陽氣、益火之源，以施化氣利水，調(diào)暢三焦氣機(jī)之效，氣機(jī)疏暢，血脈自通，加三七、鱉甲既可消癥散結(jié)，又化瘀不傷正，全方共奏溫陽活血利水，化瘀消癥散結(jié)之功。

ALT、AST 在肝臟中含量最多，主要存在于肝細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，是反映肝細(xì)胞損傷的靈敏指標(biāo)，本研究結(jié)果顯示，相比對(duì)照組而言，模型組大鼠在肝細(xì)胞發(fā)生損傷壞死形成肝纖維化時(shí)，ALT、AST 在血清中顯著升高（P＜0.01），予濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲干預(yù)后，ALT、AST 顯著降低（P＜0.01），表明濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲可以發(fā)揮保護(hù)肝細(xì)胞的作用。肝組織病理活檢為診斷肝纖維化的金標(biāo)準(zhǔn)［14］，因其屬于有創(chuàng)操作，具有潛在感染、出血、可重復(fù)性差、操作誤差等特點(diǎn)而未能廣泛用于臨床，肝臟瞬時(shí)彈性成像技術(shù)也可因膽汁淤積、肝臟炎癥、脂肪變性及進(jìn)食等方面而存在一定的檢測(cè)誤差，同樣傳統(tǒng)肝纖4 項(xiàng)檢查結(jié)果往往也容易受肝臟炎癥的影響［10］。殼多糖酶3 樣蛋白1（CHI3L1），又稱幾丁質(zhì)酶3 樣蛋白1，是一種與多種肝臟疾病密切相關(guān)的新型血清學(xué)標(biāo)志物，其在肝臟中表達(dá)最為豐富，具有高度特異性［15-18］。CHI3L1 與肝纖維化程度呈正相關(guān)，參與肝纖維化的形成主要通過炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖分化，抗細(xì)胞凋亡及促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑等病理過程［19，20］。在評(píng)估肝纖維化程度評(píng)估方面，CHI3L1 優(yōu)于透明質(zhì)酸（HA）、Ⅲ型前膠原（PⅢNP）、層黏連蛋白（LN）、Ⅳ型膠原（CⅣ），擁有較高的肝纖維化診斷價(jià)值［21-24］。因此，測(cè)量CHI3L1 對(duì)于評(píng)估肝纖維化療效有一定指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，中藥各劑量組CHI3L1 水平顯著降低，表明濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲可有效改善肝纖維化。繼發(fā)于肝細(xì)胞變性壞死的肝細(xì)胞再生及纖維組織增生進(jìn)一步導(dǎo)致血管新生、血栓形成，加重肝細(xì)胞損傷及肝臟血液循環(huán)障礙［25］，肝竇血管病變及細(xì)胞外基質(zhì)在肝臟中過度沉積表現(xiàn)符合中醫(yī)“瘀血”本質(zhì)特點(diǎn)［10］，本方所加三七、鱉甲兩者合用具有活血化瘀、軟堅(jiān)散結(jié)之效，兩者可通過抑制HSC 活化、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解等多種途徑發(fā)揮顯著抗肝纖維化作用［26-29］。

研究表明，人體肝臟中也存在腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RASS），RASS 可參與肝纖維化的發(fā)生發(fā)展［30］，其中ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 軸是促進(jìn)肝纖維化形成的重要傳導(dǎo)通路，當(dāng)肝臟受損時(shí)，RASS中如Ang-Ⅱ、AT1R 等成分會(huì)上調(diào)或重新分布，例如在肝纖維化時(shí)，Ang-Ⅱ含量明顯增多［31］，且與肝纖維化程度呈正相關(guān)。ACE 將Ang-Ⅰ裂解成Ang-Ⅱ，Ang-Ⅱ作為RASS 中最重要的活性物質(zhì)之一，具有顯著的促炎及促纖維化作用，既參與炎癥反應(yīng)，又 能激活HSC 促進(jìn)TGF-β、TNF-α、IL 等細(xì)胞因子釋放［32，33］，上述細(xì)胞因子反過來又可持續(xù)刺激HSC 增 殖活化并增 加ECM 的生成［34-40］，HSC 活化作為肝纖維化形成的中心環(huán)節(jié)，HSC 大量增殖，發(fā)生表型轉(zhuǎn)變分化為肌成纖維細(xì)胞，分泌ECM，ECM 生成過多，降解相對(duì)較少，在肝組織中過度沉積而導(dǎo)致肝纖維化形成。此外，Ang-Ⅱ還可通過AT1R 激活HSC，上調(diào)Ⅰ、Ⅲ型膠原、TGF-β mRNA的表達(dá)［41，42］。有 研究表明，通過使 用AT1R 拮抗藥或ACE 抑 制 劑 可 發(fā) 揮 抑 制 肝 纖 維 化 作 用［30，43］。TGF-β 是調(diào)節(jié)ECM 生成與沉積最重要的細(xì)胞因子之一，其可促使HSC 活化，并能促進(jìn)Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)，具有明顯的促肝纖維化作用［44，45］。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肝纖維化大鼠血 清 中 的Ang-Ⅱ、TGF-β、IL-1、IL-6、TNF-α 水 平均顯著升高（P＜0.01），經(jīng)予濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲干預(yù)后，Ang-Ⅱ、TGF-β、IL-1、IL-6、TNF-α 水平均發(fā)生降低，表明濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲可作用于ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 軸，降 低Ang-Ⅱ、TGF-β 含量，進(jìn)而減少IL-1、IL-6、TNF-α 等相關(guān)細(xì)胞因子的生成。Ⅰ、Ⅲ型膠原作為ECM 主要成分參與肝臟纖維組織結(jié)構(gòu)的形成，本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，模型組肝纖維化大鼠肝組織中的Col-ⅠmRNA、Col-ⅢmRNA、TGF-β mRNA 表達(dá)明顯上升（P＜0.01），經(jīng)予濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲干預(yù)后，以上基因表達(dá)均有不同程度水平下降，表明濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲可調(diào)節(jié)ECM 生成與降解的平衡，抑制ECM 沉積，促進(jìn)ECM 降解從而減輕肝纖維化。

綜上所述，濟(jì)生腎氣湯加三七、鱉甲可改善肝臟纖維化，其具體作用機(jī)制可能與改善肝臟炎癥壞死，調(diào)控ACE-Ang-Ⅱ-AT1R 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路后使相關(guān)細(xì)胞因子水平下降，HSC 活化增殖減少，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、TGF-β 等基因表達(dá)發(fā)生下調(diào)，減少ECM 在肝組織中的過度生成與堆積等方面有關(guān)。

作者貢獻(xiàn)度說明：

鐘鎮(zhèn)康：設(shè)計(jì)及完成實(shí)驗(yàn)、指標(biāo)檢測(cè)、論文撰寫、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析；王月明、吳騰、沈新輝：協(xié)助完成實(shí)驗(yàn)；周曉玲、陸世銀：實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)及論文修改。

本文作者均聲明不涉及相關(guān)利益沖突。