丁錦榮 劉小江 李軍 管義祥 (南通大學(xué)附屬海安醫(yī)院神經(jīng)外科，江蘇 南通 226600)

膠質(zhì)瘤是最常見的顱內(nèi)惡性腫瘤，它起源于膠質(zhì)細(xì)胞，是人類腫瘤死亡的主要原因之一〔1,2〕。根據(jù)報(bào)道，腦腫瘤的發(fā)病率為21/100 000，約占人類所有癌癥的2%，其中，膠質(zhì)瘤的發(fā)病率約占腦腫瘤的60%〔3〕。盡管膠質(zhì)瘤的治療發(fā)展迅速，其預(yù)后和生存率仍面臨著挑戰(zhàn)。因此，迫切需要探索膠質(zhì)瘤進(jìn)展的確切分子機(jī)制，開發(fā)新的有效治療策略，以改善患者預(yù)后。長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)是一類長(zhǎng)度超過200核苷酸的非編碼RNA，最初被認(rèn)為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，是RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)品，沒有生物學(xué)功能〔4,5〕。研究表明，LncRNA廣泛參與許多重要的調(diào)控過程，可能可以作為膠質(zhì)瘤等多種人類癌癥的治療靶點(diǎn)〔6〕。LncRNA MIR4697 host gene(MIR4697HG)與肺腺癌臨床特征相關(guān)〔7〕，MIR4697HG在卵巢癌中高表達(dá)，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移〔8〕。而尚未對(duì)膠質(zhì)瘤中的MIR4697HG進(jìn)行研究。微小RNA(miRNA/miR)是一類小的非編碼RNA，其異常表達(dá)對(duì)于各種癌癥的發(fā)生發(fā)展有重要意義〔9〕。結(jié)直腸癌中miR-193a-3p下調(diào)表達(dá)，上調(diào)其表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和發(fā)展〔10〕。但目前miR-193a-3p在膠質(zhì)瘤中的生物學(xué)功能尚未明確。高遷移率族蛋白(HMG)A2被發(fā)現(xiàn)在膠質(zhì)瘤中過表達(dá)，促膠質(zhì)瘤的侵襲和不良預(yù)后〔11〕，F(xiàn)oxD2-AS1通過miR-185-5P靶向調(diào)控HMGA2表達(dá)，促進(jìn)膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展〔12〕?；诖?，本研究對(duì)LncRNA MIR4697HG影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，并結(jié)合miR-193a-3p和HMGA2初步探討其潛在的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA、膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、HMGA2、細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、MMP-9蛋白抗體購(gòu)自美國(guó)Cellular Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；miR-con、miR-193a-3p、si-con、si-MIR4697HG、anti-miR-con、anti-miR-193a-3p、熒光素酶報(bào)告載體購(gòu)自上海Gene Pharma公司；噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) HA、U-251MG細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2、飽和濕潤(rùn)的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞密度達(dá)約70%，使用胰酶消化、傳代。

1.3qPCR檢測(cè)LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA表達(dá) 選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的HA、U-251MG細(xì)胞，接入TRIzol試劑提取總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以合成的cDNA為模板，按照qPCR試劑盒的說明進(jìn)行反應(yīng)。LncRNA MIR4697HG正向引物序列為5′- TTCCCCAGGAGGGACTTTGA-3′，反向引物序列為5′-GTGTGTCCTCAGACCACCAG-3′。miR-193a-3p引物序列參照王培蓓等〔13〕的報(bào)道，HMGA2正向引物序列為5′-AAAGCAGCTCAAAAGAAAGCA-3′，反向引物序列為5′-TGTTGTGGCCATTTCCTAGGT-3′。LncRNA MIR4-697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA表達(dá)量依照2-ΔΔCt法計(jì)算。

1.4Western印跡檢測(cè)HMGA2蛋白表達(dá) 使用放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液提取HA、U-251MG細(xì)胞蛋白，吸取適量蛋白進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，分離蛋白樣品，并轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜(PVDF)，之后用5%脫脂奶粉封閉1 h，加入HMGA2一抗4℃孵育過夜，同時(shí)以β-actin作為對(duì)照，經(jīng)Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液(TBST)漂洗10 min，重復(fù)3次后，加入二抗孵育2 h，TBST漂洗，曝光顯影，分析HMGA2蛋白條帶灰度值。

1.5細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h，在6孔板中接種U-251MG細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞達(dá)約70%密度時(shí)，按照Lipofectamine 2000試劑說明書指示，將miR-193a-3p、si-MIR4697HG、anti-miR-193a-3p及其陰性對(duì)照轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)-251MG細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，收集U-251MG細(xì)胞，參照1.3、1.4所述方法檢測(cè)LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p、HMGA2 mRNA和HMGA2蛋白、CyclinD1、MMP-2、MMP-9表達(dá)，并進(jìn)行其他指標(biāo)檢測(cè)。

1.6生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和雙熒光素酶活性檢測(cè) StarBase網(wǎng)站(http://starbase.sysu.edu.cn/)對(duì)MIR4697HG與miR-193a-3p、miR-193a-3p與HMGA2的靶向結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MIR4697HG與miR-193a-3p、miR-193a-3p與HMGA2有部分核苷酸序列可分別形成互補(bǔ)配對(duì)。構(gòu)建含有miR-193a-3p結(jié)合位點(diǎn)的LncRNA MIR4697HG-3′野生型(MIR4697HG-3′WT)及突變型(MIR4697HG-3′MUT)報(bào)告基因載體，在U-251MG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-193a-3p和LncRNA MIR4697HG WT及MUT報(bào)告基因載體。構(gòu)建含有miR-193a-3p結(jié)合位點(diǎn)的HMGA2-3′非編碼區(qū)(3′UTR)HMGA2-3′UTR-WT及HMGA2-3′UTR-MUT報(bào)告基因載體，在U-251MG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-193a-3p mimics和HMGA2-3′UTR WT及MUT報(bào)告基因載體。之后，進(jìn)行雙熒光素酶活性檢測(cè)。

1.7MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 收集U-251MG細(xì)胞，在96孔板中接種1×104個(gè)/ml，培養(yǎng)48 h，添加100 μl MTT溶液，37℃孵育4 h，加入200 μl二甲基亞砜，37℃振蕩培養(yǎng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后置酶標(biāo)儀檢測(cè)U-251MG細(xì)胞的吸光(OD)值，檢測(cè)波長(zhǎng)設(shè)為490 nm。細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%

1.8Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 檢測(cè)U-251MG細(xì)胞遷移和侵襲時(shí)，用無血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，加入Transwell上室(檢測(cè)細(xì)胞遷移不加基質(zhì)膠。檢測(cè)細(xì)胞侵襲時(shí)，事先在Transwell上室涂布與無血清培養(yǎng)基充分混合的基質(zhì)膠，靜置3～4 h)，并在下室加入500 μl包含10%胎牛血清的培養(yǎng)基。孵育24 h后，無菌棉簽擦除多余細(xì)胞，甲醛和結(jié)晶紫分別進(jìn)行固定與染色，顯微鏡下觀察、統(tǒng)計(jì)。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LncRNA MIR4697HG、miR-193a-3p和HMGA2表達(dá) 與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞HA比較，膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG中LncRNA MIR4697-HG、HMGA2 mRNA和HMGA2蛋白表達(dá)量明顯升高，而miR-193a-3p表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。見圖1，表1。

圖1 Western印跡檢測(cè)HMGA2蛋白的表達(dá)

表1 膠質(zhì)瘤細(xì)胞中LncRNA MIR4697HG、HMGA2和 miR-193a-3p表達(dá)量

2.2LncRNA MIR4697HG靶向miR-193a-3p，miR-193a-3p靶向HMGA2 StarBase在線預(yù)測(cè)軟件顯示，miR4697HG與miR-193a-3p、miR-193a-3p與HMGA2具有靶向結(jié)合位點(diǎn)(圖2)。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，相比于miR-con與MIR4697HG-3′WT報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，miR-193a-3p與MIR4697HG-3′WT共轉(zhuǎn)染顯著抑制熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，而miR-con或miR-193a-3p與MIR4697HG-3′MUT共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶相對(duì)活性無明顯影響(P>0.05)，見表2。同時(shí)，相較于miR-con與HMGA2-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染，miR-193a-3p與HMGA2-3′UTR-WT共轉(zhuǎn)染明顯降低熒光素酶相對(duì)活性(P<0.05)，miR-con或miR-193a-3p與HMGA2-3′UTR-MUT共轉(zhuǎn)染對(duì)熒光素酶相對(duì)活性無明顯影響(P>0.05)，見表3。

2.3低表達(dá)LncRNA MIR4697HG抑制膠質(zhì)瘤U-251MG細(xì)胞增殖、遷移和侵襲，影響miR-193a-3p和HMGA2的表達(dá) 在U-251MG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染si-MIR4697HG，發(fā)現(xiàn)MIR4697HG mRNA表達(dá)量明顯低于si-con組，說明轉(zhuǎn)染有效。與si-con組比較，低表達(dá)LncRNA MIR4697HG miR-193a-3p表達(dá)量明顯增加(P<0.05)。而HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。低表達(dá)LncRNA MIR4697HG的U-251MG細(xì)胞存活率明顯低于si-con組(P<0.05)。相較于si-con組，低表達(dá)LncRNA MIR4697HG細(xì)胞遷移數(shù)量和細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少(P<0.05)，見圖3，表4。

A StarBase對(duì)miR-193a-3p和LncRNA MIR4697HG結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意；B StarBase對(duì)HMGA2和miR-193a-3p結(jié)合進(jìn)行預(yù)測(cè)示意圖2 miR-193a-3p靶向LncRNA MIR4697HG， HMGA2靶向miR-193a-3p

表2 雙熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)

表3 miR-con或miR-193a-3p與HMGA2-3′UTR WT及MUT報(bào)告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染U-251MG細(xì)胞后 雙熒光素酶活性檢測(cè)

A：Transwell檢測(cè)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×10)；B：Western印跡檢測(cè)HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 1～3：NC組，si-con組，si-MIR4697HG組

表4 低表達(dá)LncRNA MIR4697HG抑制膠質(zhì)瘤U-251MG細(xì)胞增殖、遷移和侵襲， 影響miR-193a-3p和HMGA2的表達(dá)

2.4高表達(dá)miR-193a-3p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG增殖、遷移和侵襲，影響HMGA2的表達(dá) 在U-251MG細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后miR-193a-3p表達(dá)量明顯高于miR-con組(P<0.05)，表明轉(zhuǎn)染成功。與miR-con組比較，高表達(dá)miR-193a-3p HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)量和細(xì)胞侵襲數(shù)量明顯減少(P<0.05)，見圖4、表5。

A：Transwell檢測(cè)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×10)；B：Western印跡檢測(cè)HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 1～3:NC組，miR-con組，miR-193a-3p組

表5 高表達(dá)miR-193a-3p抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞U-251MG增殖、遷移和侵襲，影響HMGA2的表達(dá)

2.5敲減miR-193a-3p可部分逆轉(zhuǎn)MIR4697HG低表達(dá)對(duì)U-251MG細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-MIR4697HG+anti-miR-con組比較，si-MIR4697HG與anti-miR-193a-3p共轉(zhuǎn)染顯著提高CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)量和細(xì)胞侵襲數(shù)量(P<0.05)，見表6、圖5。

2.6高表達(dá)HMGA2可部分逆轉(zhuǎn)MIR4697HG低表達(dá)對(duì)U-251MG細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響 與si-MIR4697HG+pcDNA-con組比較，si-MIR4697HG與pcDNA-HMGA2共轉(zhuǎn)染顯著提高HMGA2、CyclinD1、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)量、細(xì)胞存活率、細(xì)胞遷移數(shù)量和細(xì)胞侵襲數(shù)量(P<0.05)，見圖6、表7。

表6 敲減miR-193a-3p可部分逆轉(zhuǎn)MIR4697HG低表達(dá)對(duì)U-251MG細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

A：Transwell檢測(cè)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×10)；B：Western印跡檢測(cè)CyclinD1、MMP2和MMP9蛋白表達(dá)； 1～2：si-MIR 4697HG+pcDNA-con組，si-MIR 4697HG+anti-miR-193a-3p組

A：Transwell檢測(cè)膠質(zhì)瘤的遷移和侵襲(結(jié)晶紫染色，×10)；B：Western印跡檢測(cè)HMGA2、CyclinD1、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)； 1～2：si-MIR 4697HG+pcDNA-con組，si-MIR 4697HG+pcDNA-HMGA2組

表7 高表達(dá)HMGA2可部分逆轉(zhuǎn)MIR4697HG低表達(dá)對(duì)U-251MG細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

3 討 論

膠質(zhì)瘤是成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中發(fā)病率和死亡率最高的腫瘤。雖然治療膠質(zhì)瘤的方法有所進(jìn)步，但由于治療方案有限，患者的總體生存中值在診斷后往往低于12～18個(gè)月〔14〕。研究證實(shí)LncRNA在膠質(zhì)瘤形成中的功能作用〔15〕。例如，抑制lncRNA ZEB1-AS1可抑制U87MG膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16〕。lncRNA GAS5的過表達(dá)抑制了膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔17〕。本研究結(jié)果與Zhang等〔8〕報(bào)道一致。作為一種高度保守的內(nèi)源性非編碼RNA，miRNA通過與靶基因的3′UTR結(jié)合，調(diào)控靶基因表達(dá)，在包括發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化在內(nèi)的多種生物學(xué)事件中發(fā)揮重要作用。miR-193a-3p在大多數(shù)癌癥中充當(dāng)抑癌基因，如胰腺導(dǎo)管腺癌〔18〕、胃癌〔19〕、前列腺癌〔20〕等。miR-193a-3p在結(jié)直腸癌組織中下調(diào)，并與患者的預(yù)后密切相關(guān)〔21〕。本研究qPCR結(jié)果與miR-193a-3p過表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞增殖和遷移的研究相符〔22〕，提示在膠質(zhì)瘤中，miR-193a-3p可能扮演著抑癌基因的角色，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。HMGA2被證明在膠質(zhì)瘤中促進(jìn)增殖、侵襲、遷移和不良預(yù)后〔23〕。本研究結(jié)果表明LncRNA MIR4697HG可能通過靶向miR-193a-3p并調(diào)控HMGA2表達(dá)，從而影響膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上，LncRNA MIR4697HG在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著上調(diào)，抑制其表達(dá)則明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其作用機(jī)制與靶向miR-193a-3p調(diào)控HMGA2表達(dá)有關(guān)。另外，miR-193a-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中明顯下調(diào)，上調(diào)其表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的抑制。本研究對(duì)膠質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制進(jìn)行初步探索，為膠質(zhì)瘤提供了潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。