張艷秋 翟鐵 劉丹 郝鳳杰 王曉軍 (承德市中心醫(yī)院，河北 承德 067000)

足細胞在糖尿病腎病(DN)的發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用，高糖可誘導(dǎo)足細胞凋亡和脫落，最終導(dǎo)致腎小球硬化〔1〕。研究足細胞凋亡和損傷機制有助于治療DN。核因子(NF)-κB相關(guān)長鏈非編碼RNA(lncRNA NKILA)在10 mg/脂多糖( LPS)誘導(dǎo)8 h的膿毒癥腎損傷的HK-2細胞中表達顯著升高〔2〕。而本研究通過StarBase預(yù)測顯示，miR-22-3p可能是lncRNA NKILA的靶基因。miR-22-3p在腎小管損傷模型細胞〔3〕和膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷〔4〕中表達下調(diào)。且有研究表明miR-22-3p可通過磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)途徑影響腎癌細胞活力和遷移〔5〕。根據(jù)上述研究結(jié)論和預(yù)測結(jié)果本研究假設(shè)，在高糖誘導(dǎo)的人足細胞HPC中，lncRNA NKILA靶向miR-22-3p通過PI3K/AKT途徑影響高糖誘導(dǎo)的人足細胞HPC增殖和凋亡，并對此假設(shè)進行驗證。

1 材料與方法

1.1材料 人永生性腎臟足細胞系HPC購自北京北納生物；McCoy 5a培養(yǎng)基和胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司；胰蛋白酶Trypsin購自Sigma-Aldrich公司；細胞周期蛋白(cyclin)D1抗體、cleaved-caspase-3抗體、磷酸化(p)-PI3K、p-AKT抗體和β-actin抗體購自英國Abcam公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、總RNA提取試劑Trizol、 real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)購自美國Invitrogen公司；流式細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；lncRNA NKILA抑制劑(anti-lncRNA NKILA)、lncRNA NKILA過表達載體(pcDNA-NKILA)、miR-22-3p mimics、miR-22-3p抑制物(anti-miR-22-3p)、陰性對照(si-NC、pcDNA-NC、miR-NC和anti-miR-NC)、lncRNA NKILA的野生型(WT-NKILA)和突變型(MUT-NKILA)雙熒光報告載體購自上海吉瑪基因；雙熒光素酶報告系統(tǒng)購自美國Promega公司；流式細胞儀購自美國BD公司，real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)、分化和分組〔6〕細胞培養(yǎng)和分化：將HPC培養(yǎng)在含10%FBS、100 U/ml青霉素和100 mg/ml鏈霉素的McCoy 5a培養(yǎng)基中，置37℃ 5%CO2、濕度95%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 d傳代一次，細胞傳代時將細胞培養(yǎng)于33℃ 5%CO2培養(yǎng)箱中，細胞基本融合為一層時，將傳代的HPC細胞轉(zhuǎn)入37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)10～14 d，細胞分化成熟。

實驗分組：正常對照(NC)組：McCoy 5a培養(yǎng)基+D-葡萄糖11.1 mmol/L培養(yǎng)48 h；高糖刺激(HG)組：McCoy 5a培養(yǎng)基+D-葡萄糖25 mmol/L培養(yǎng)48 h；高糖刺激+轉(zhuǎn)染(HG+轉(zhuǎn)染)組：轉(zhuǎn)染48 h后用McCoy 5a培養(yǎng)基+D-葡萄糖25 mmol/L處理48 h。

1.2.2細胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前24 h將HPC以5×105個細胞/孔接種于6孔板中，培養(yǎng)至細胞融合度為50%～60%時根據(jù)轉(zhuǎn)染說明書進行轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染分組：lncRNA NKILA低表達組(轉(zhuǎn)染si-NKILA，以si-NC為對照)，miR-22-3p高表達組(轉(zhuǎn)染miR-22-3p，以miR-NC為對照)，lncRNA NKILA和miR-22-3p雙抑制組(轉(zhuǎn)染si-NKILA+anti-miR-22-3p，以si-NKILA+anti-miR-NC為對照)。將無血清培養(yǎng)液稀釋的等體積脂質(zhì)體和各組載體混合，室溫孵育20 min，加入到培養(yǎng)好的HPC細胞中，培養(yǎng)6 h，棄無血清培養(yǎng)液，加入McCoy 5a完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h，收集細胞。

1.2.3real-timePCR檢測lncRNA NKILA和miR-22-3p 的表達 收集NC組、HG組或轉(zhuǎn)染的各組HPC細胞，按照總RNA提取試劑盒的說明書提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA為模板按照 real-time PCR的說明書進行反應(yīng)合成lncRNA NKILA和miR-22-3p，反應(yīng)程序為：95℃ 2 min；95℃30 s、60℃ 40 s、72℃ 45 s，40個循環(huán)；72℃ 5 min。用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4CCK-8實驗檢測細胞存活率 收集轉(zhuǎn)染后和(或)高糖處理的HPC細胞，消化并稀釋，以2×103個細胞/孔(100 μl細胞/孔)接種于96微孔板中，在細胞培養(yǎng)至48 h進行 CCK-8實驗，每孔加入10 μl CCK-8溶液，置于37℃繼續(xù)培養(yǎng)2 h，酶標儀檢測450 nm 處的吸光度(A)值。細胞存活率(%)=實驗組A值/陰性對照組A值×100%。

1.2.5Western印跡檢測蛋白表達 收集各組HPC細胞，裂解破碎細胞，收集細胞中的蛋白，測定蛋白濃度。將蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，轉(zhuǎn)聚偏氟乙烯(PVDF)膜，封閉2 h，加入稀釋的各個一抗(cyclinD1抗體1∶2 000、cleaved-caspase-3抗體1∶1 000、p-PI3K抗體1∶1 000、p-AKT抗體1∶1 000、和β-actin抗體1∶4 000)，4℃過夜孵育，洗膜2次，加入稀釋的酶標記二抗，室溫孵育2 h，以β-actin為內(nèi)參，分析蛋白表達水平。

1.2.6流式細胞術(shù)測定細胞凋亡率 收集經(jīng)高糖或(和)轉(zhuǎn)染后各組HPC細胞，胰酶消化，離心收集細胞，按照膜聯(lián)蛋白(Annexin)V/碘化丙啶(PI)試劑盒說明書進行操作，Annexin V-FITC和PI各5 μl，混勻，室溫避光15 min，流式細胞儀檢測凋亡率。

1.2.7雙熒光素酶報告實驗 根據(jù)1.2.2進行HPC細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的WT-NKILA和MUT-NKILA雙熒光素酶報告載體分別與miR-NC或miR-22-3p共轉(zhuǎn)染HPC細胞，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h，收集細胞并進行裂解，離心收集上清，根據(jù)試劑盒說明書進行操作，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，檢測分析相對螢火蟲熒光素酶活性。

1.3統(tǒng)計學處理 采用SPSS21.0軟件進行單因素方差分析和t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1NC組和HG組中l(wèi)ncRNA NKILA和miR-22-3p表達情況 與NC組相比，HG組的HPC細胞lncRNA NKILA含量顯著升高(P<0.05)，miR-22-3p顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 NC組和HG組中l(wèi)ncRNA NKILA和 miR-22-3p表達情況

2.2低表達NKILA對高糖處理的HPC增殖和凋亡影響 與NC組相比，HG組的HPC細胞存活率和cyclinD1含量降低，凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白含量上升，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與HG+si-NC組相比，HG+si-NKILA組HPC細胞中NKILA含量降低，細胞存活率和cyclinD1含量升高，凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白含量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1、圖2和表2。

圖1 Western印跡檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3 蛋白表達

圖2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

表2 低表達NKILA對高糖誘導(dǎo)的HPC增殖和凋亡影響

2.3高表達miR-22-3p對HPC增殖和凋亡的影響 與HG+miR-NC組相比，HG+miR-22-3p組HPC細胞中miR-22-3p含量、細胞存活率和cyclinD1含量升高，凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白含量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3和表3。

2.4lncRNA NKILA靶向調(diào)控miR-22-3p的表達 通過StarBase預(yù)測顯示，miR-22-3p序列中含有與lncRNA NKILA互補的位點，見圖4。與miR-NC組相比，miR-22-3p組WT-NKILA的螢火蟲熒光素酶相對活性顯著降低(P<0.05)，而MUT-NKILA的熒光素酶相對活性無明顯變化(P>0.05)。見表4。qRT-PCR結(jié)果表明，si-NC組、si-NKILA組、pcDNA-NC組、pcDNA-NKILA組miR-22-3p分別為：1.02±0.11、2.69±0.27、1.05±0.10、0.42±0.04。抑制lncRNA NKILA可上調(diào)miR-22-3p含量，過表達lncRNA NKILA可下調(diào)miR-22-3p含量(F=353.702，P<0.001)。

2.5低表達miR-22-3p可以部分逆轉(zhuǎn)NKILA低表達對HPC增殖和凋亡的影響 與HG+si-NKILA+anti-miR-NC組相比，HG+si-NKILA+anti-miR-22-3p組HPC細胞中miR-22-3p、細胞存活率和cyclinD1含量均降低，凋亡率和cleaved-caspase-3蛋白含量升高，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖5和表5。

A：流式細胞儀檢測細胞凋亡；B：Western印跡檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白的表達圖3 高表達miR-22-3p對HPC的增殖和凋亡的影響

表3 高表達miR-22-3p對HPC的增殖和凋亡的影響

圖4 通過Starbase預(yù)測miR-22-3p和 NKILA結(jié)合示意圖

表4 miR-NC或miR-22-3p與報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HPC 細胞后雙熒光素酶活性檢測

A：流式細胞儀檢測細胞凋亡；B：Western印跡檢測cyclinD1和cleaved-caspase-3蛋白的表達；1、2：HG+si-NKILA+anti-miR-NC組、HG+si-NKILA+anti-miR-22-3p組圖5 低表達miR-22-3p可以部分逆轉(zhuǎn)NKILA低表達對HPC增殖和凋亡的影響

表5 低表達miR-22-3p可以部分逆轉(zhuǎn)NKILA低表達對HPC增殖和凋亡的影響

2.6PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達 與HG+si-NC組相比，HG+si-NKILA組HPC細胞中p-PI3K和p-AKT含量均顯著升高(P<0.05)；與HG+si-NKILA+anti-miR-NC組相比，HG+si-NKILA+anti-miR-22-3p組p-PI3K和p-AKT含量均顯著下降(P<0.05)，見圖6和表6。

1～4:HG+si-NC組、HG+si-NKILA組、HG+si-NKILA+anti-miR-NC組、HG+si-NKILA+anti-miR-22-3p組圖6 Western印跡檢測p-PI3K、p-AKT蛋白的表達

表6 PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的表達

3 討 論

大量lncRNA在DN中表達失調(diào)，可能通過轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/NF-κB/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白(STAT)3/糖原合成酶激酶(GSK)-3β信號通路參與DN的發(fā)展和進展，可能是疾病的早期診斷或預(yù)后的標志物或作為減緩DN進展的治療靶點〔7，8〕。

lncRNA NKILA通過抑制NF-κB活動，使T細胞對活化誘導(dǎo)的細胞死亡(AICD)敏感而促進腫瘤免疫逃避〔9〕。NKILA在非小細胞肺癌(NSCLC)〔10〕、惡性黑色素瘤〔11〕、乳腺癌〔12〕和食管鱗狀細胞癌(ESCC)〔13〕中均可通過阻斷NF-κB信號通路抑制癌細胞的遷移、侵襲或上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。目前針對NKILA的主要研究集中腫瘤等方面，還有研究表明，lncRNA NKILA對膿毒癥腎損傷后自噬具有調(diào)節(jié)作用〔2〕。本研究說明抑制lncRNA NKILA對足細胞具有潛在的保護作用。

本研究通過StarBase預(yù)測顯示，miR-22-3p與lncRNA NKILA存在結(jié)合位點，可能參與lncRNA NKILA對足細胞凋亡和增殖的調(diào)控。miR-22-3p在糖尿病心肌病(DCM)大鼠模型中表達下調(diào)，通過MIAT/miR-22-3p/DAPK2信號通路調(diào)控心肌細胞的凋亡〔10，14〕。且miR-22-3p在膿毒癥急性腎損傷中表達下調(diào)〔4〕，在草酸鈣誘導(dǎo)腎結(jié)石模型中參與腎小管上皮細胞的凋亡〔3〕。但其對DN足細胞中的表達和作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明低表達miR-22-3p可部分逆轉(zhuǎn)抑制lncRNA NKILA對高糖誘導(dǎo)的HPC增殖和凋亡的作用。

PI3K/Akt/NF-κB軸可能在足細胞損傷中起關(guān)鍵作用，PI3K/AKT途徑的激活可阻止高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡〔15，16〕。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制lncRNA NKILA表達可激活PI3K/AKT信號通路，下調(diào)miR-22-3p則逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA NKILA對高糖誘導(dǎo)的HPC細胞PI3K/AKT信號通路的激活作用。說明lncRNA NKILA靶向miR-22-3p可能通過PI3K/AKT信號通路發(fā)揮對足細胞的保護作用。

綜上，在高糖誘導(dǎo)的HPC細胞中，lncRNA NKILA通過調(diào)控miR-22-3p激活PI3K/AKT信號通路，抑制高糖誘導(dǎo)的足細胞凋亡，提高細胞存活率。lncRNA NKILA可能是DN潛在的靶點。