劉華 馮玉 楊靜 張瑞城

(1?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院腎內(nèi)科，海南 海口 571100；2海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科)

腎癌是臨床常見的一種泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤，臨床主要采用手術(shù)治療腎癌，但患者預(yù)后較差〔1，2〕。目前腎癌發(fā)病機(jī)制尚未闡明，因而尋找影響腎癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的基因有助于提高腎癌治療效果及改善患者預(yù)后。研究表明一些長(zhǎng)鏈非編碼RNA(LncRNA)可調(diào)控腎癌細(xì)胞增殖及侵襲等生物學(xué)行為〔3，4〕。LncRNA LINC00342在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)上調(diào)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移〔5〕。但LINC00342在腎癌發(fā)生及發(fā)展過(guò)程中的作用機(jī)制尚未可知。研究表明LncRNA對(duì)微小RNA(miRNA)具有海綿吸附作用，LncRNA通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA并抑制miRNA表達(dá)參與腫瘤發(fā)展過(guò)程〔6〕。生物信息學(xué)分析顯示LINC00342與miR-384可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，研究表明miR-384可抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲〔7〕。但LINC00342是否通過(guò)調(diào)控miR-384表影響腎癌進(jìn)展尚未可知。本研究主要探討LINC00342在腎癌中的表達(dá)及其對(duì)腎癌細(xì)胞惡性生物行為的影響，并探究其對(duì)miR-384的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 腎癌786-O細(xì)胞購(gòu)自上海匹拓生物科技有限公司；杜氏改良培養(yǎng)基(DMEM)購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；0.25%胰蛋白酶購(gòu)自廣州市達(dá)暉生物技術(shù)有限公司；LINC00342小干擾RNA(si-LINC00342)、亂序無(wú)意義陰性序列(si-NC)、miR-384模擬物(mimics)及陰性對(duì)照(miR-NC)、miR-384特異性寡核苷酸抑制劑(anti-miR-384)及其陰性對(duì)照(anti-miR-NC)均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；pcDNA3.1購(gòu)自上海北諾生物科技有限公司；Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Transwell小室、基質(zhì)膠購(gòu)自上海宇進(jìn)生物科技有限公司；放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗人B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購(gòu)自合肥康源生物科技研究所；兔抗人P21抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、上皮型鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體購(gòu)自武漢菲恩生物科技有限公司；辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔二抗購(gòu)自北京博爾西科技有限公司。

腎癌組織與癌旁組織標(biāo)本來(lái)源：收集2017年6月至2018年3月?？谑械谒娜嗣襻t(yī)院收治的33例腎癌患者，男20例，女13例，平均年齡(56.57±9.48)歲，所有患者經(jīng)病理證實(shí)為腎癌，術(shù)前均未接受化療或放療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情且簽署同意書。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 采用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)腎癌786-O細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)到70%時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。將si-NC、si-LINC0034轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞，記為si-NC組、si-LINC00342組；將si-LINC0034分別與anti-miR-NC、anti-miR-384共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞，記為si-LINC00342+anti-miR-NC組、si-LINC00342+anti-miR-384組。

1.2.2實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)檢測(cè)LINC00342、miR-384的表達(dá)水平 提取腎癌組織、癌旁組織及各組786-O細(xì)胞總RNA，取2 μg RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，LINC00342以GAPDH為內(nèi)參，miR-384以U6為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算LINC00342、miR-384相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞增殖抑制率 收集各組786-O細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處相對(duì)吸光度值(OD)，計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率〔(空白組-實(shí)驗(yàn)組)/空白組×100%〕。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組786-O細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明操作，置于FACS Calibur流式細(xì)胞儀及應(yīng)用Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡。

1.2.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 遷移：收集各組對(duì)786-O細(xì)胞，取200 μl細(xì)胞懸液加入Transwell小室上室，下室加600 μl含血清培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h，依次采用多聚甲醛固定(20 min)與0.1%結(jié)晶紫染液染色(10 min)，擦拭未遷移細(xì)胞，顯微鏡(200倍)下觀察計(jì)數(shù)。侵襲：稀釋基質(zhì)膠，取40 μl稀釋液加入Transwell小室上室，然后按遷移操作進(jìn)行。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)LINC00342與miR-384的靶向關(guān)系 StarBase預(yù)測(cè)顯示miR-384可能是LINC00342的靶基因，構(gòu)建野生型和突變型報(bào)告基因載體WT-LINC00342和MUT-LINC00342，將其分別與miR-NC、miR-384共轉(zhuǎn)染至786-O細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后檢測(cè)各組相對(duì)熒光素酶活性。為探討LINC00342對(duì)miR-384表達(dá)水平的影響，將786-O細(xì)胞隨機(jī)分成4組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1-LINC00342組、si-NC組、si-LINC00342組，通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)miR-384表達(dá)水平。

1.2.7Western印跡檢測(cè)Bcl-2、P21、Bax、MMP-2、E-cadherin蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞總蛋白，沸水煮10 min變性；進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，80 V 30 min，120 V 90 min)；電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫下用5%脫脂奶粉封閉2 h，4℃條件下孵育蛋白一抗稀釋液，24 h后加入二抗稀釋液，室溫孵育1 h，曝光，顯影，應(yīng)用ImageJ軟件分析各條帶灰度值。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1LINC00342在腎癌組織和癌旁組織中的表達(dá) 腎癌組織中LINC00342的表達(dá)水平(2.14±0.23)顯著高于癌旁組織(1.01±0.13,P<0.05)。

2.2抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞增殖、凋亡的影響 si-LINC00342組786-O細(xì)胞中LINC00342的表達(dá)水平顯著低于si-NC組(P<0.001)，提示成功降低786-O細(xì)胞中LINC00342的表達(dá)。與si-NC組相比，si-LINC00342組786-O細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著升高，P21、Bax蛋白表達(dá)量顯著升高，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著降低(均P<0.001)，見表1、圖1、圖2。

表1 抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞增殖、凋亡的影響

圖1 抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞凋亡的影響

圖2 抑制LINC00342對(duì)細(xì)胞786-O增殖、凋亡 蛋白表達(dá)的影響

2.3抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞遷移、侵襲的影響 相較于si-NC組，si-LINC00342組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)均顯著減少，MMP-2蛋白表達(dá)量顯著降低，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著升高(均P<0.001)，見表2、圖3、圖4。

表2 抑制LINC00342對(duì)細(xì)胞786-O遷移、侵襲的 影響

圖3 786-O細(xì)胞遷移、侵襲(結(jié)晶紫，×200)

圖4 Western印跡檢測(cè)遷移、侵襲相關(guān)蛋白的表達(dá)

2.4LINC00342靶向、調(diào)控miR-384 StarBase預(yù)測(cè)顯示LINC00342與miR-384有互補(bǔ)的核苷酸序列，見圖5。WT-LINC00342與miR-384共轉(zhuǎn)染的786-O細(xì)胞熒光素酶活性顯著降低(P<0.001)，見表3。pcDNA3.1-LINC00342組miR-384表達(dá)水平(0.26±0.03)顯著低于pcDNA3.1組(0.99±0.09，P<0.05)；與si-LINC00342組miR-384表達(dá)水平(2.04±0.21)顯著高于si-NC組(0.98±0.08，P<0.05)。

圖5 LINC00342靶向miR-384

表3 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

2.5抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞增殖、凋亡的影響 si-LINC00342+anti-miR-384組786-O細(xì)胞中miR-384的表達(dá)水平顯著低于si-LINC00342+anti-miR-NC組(P<0.001)。提示成功降低786-O細(xì)胞中miR-384的表達(dá)。與si-LINC00342+anti-miR-NC組相比，si-LINC00342+anti-miR-384組786-O細(xì)胞增殖抑制率和凋亡率顯著降低，Bcl-2蛋白表達(dá)量顯著升高，P21、Bax蛋白表達(dá)量降低(均P<0.001)，見圖6、圖7、表4。

圖6 抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O 細(xì)胞增殖、凋亡的影響

1，2:si-LINC00342+anti-miR-NC組、si-LINC00342+anti-miR-384組，圖9同圖7 抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O 細(xì)胞增殖、凋亡蛋白表達(dá)的影響

表4 抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞增殖、凋亡的影響

2.6抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O細(xì)胞遷移、侵襲的影響 與si-LINC00342+anti-miR-NC組比較，si-LINC00342+anti-miR-384組遷移與侵襲細(xì)胞數(shù)顯著增多，MMP-2蛋白表達(dá)量顯著升高，E-cadherin蛋白表達(dá)量顯著降低(均P<0.001)，見表5、圖8、圖9。

表5 抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)細(xì)胞786-O 遷移、侵襲的影響

圖8 抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O 細(xì)胞遷移、侵襲的影響(結(jié)晶紫，×200)

圖9 抑制miR-384能逆轉(zhuǎn)抑制LINC00342對(duì)786-O 細(xì)胞遷移、侵襲蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

LncRNA在腎癌轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，下調(diào)或上調(diào)LncRNA可影響腎癌細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為〔8～10〕。LINC00342高表達(dá)量可促進(jìn)嬰兒血管瘤的生長(zhǎng)〔11〕。研究表明LINC00342在非小細(xì)胞肺癌中呈高表達(dá)并可作為患者預(yù)后不良的重要標(biāo)志物〔12，13〕。本研究結(jié)果提示LINC00342表達(dá)量升高可能促進(jìn)腎癌的發(fā)生。本研究結(jié)果提示抑制LINC00342可抑制腎癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明P21蛋白表達(dá)水平升高可抑制腎癌細(xì)胞生長(zhǎng)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯〔14〕。Bcl-2屬于抗凋亡蛋白，Bax屬于抗凋亡蛋白，研究表明腎癌細(xì)胞中Bcl-2表達(dá)水平降低，Bax表達(dá)水平升高并可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔15〕。本研究結(jié)果提示抑制LINC00342表達(dá)可能通過(guò)調(diào)控相關(guān)蛋白表達(dá)從而抑制腎癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明MMP-2可通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)散及轉(zhuǎn)移，同時(shí)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)可促進(jìn)腫瘤浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移，EMT上皮型標(biāo)志物E-cadherin表達(dá)下調(diào)可增強(qiáng)遷移及侵襲能力〔16〕。本研究結(jié)果提示抑制LINC00342表達(dá)可抑制腎癌細(xì)胞遷移及侵襲。

LncRNA TSIX可通過(guò)充當(dāng)miR-384的海綿分子從而促進(jìn)胰腺癌增殖〔17〕。研究表明miR-384可分別通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控Smad核內(nèi)相關(guān)蛋白(SNIP)1、多效生長(zhǎng)因子(PTN)的表達(dá)從而抑制腫瘤細(xì)胞進(jìn)展〔18，19〕。相關(guān)報(bào)道指出miR-384通過(guò)靶向AKT3抑制大腸癌細(xì)胞增殖〔20〕。本研究證實(shí)LINC00342可靶向結(jié)合并負(fù)向調(diào)控miR-384的表達(dá)，抑制miR-384表達(dá)聯(lián)合抑制LINC00342表達(dá)可明顯降低腎癌細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞凋亡率，減弱細(xì)胞遷移及侵襲能力。提示抑制LINC00342表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)miR-384表達(dá)而減弱腎癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。