李靜 盧峰 穆懷彬 李燕 (唐山市工人醫(yī)院心內(nèi)科，河北 唐山 063000)

丹參酮ⅡA磺酸鈉(STS)是從丹參中提取的二萜醌類化合物，具有擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗炎抗氧化等藥理作用，常用于治療心腦血管疾病〔1〕。心肌缺血/再灌注損傷是指心肌組織在急性缺血后恢復(fù)血流供應(yīng)時(shí)，出現(xiàn)損傷加重現(xiàn)象〔2〕，內(nèi)皮缺氧/復(fù)氧(H/R)是缺血-再灌注損傷的主要后果，它可以引發(fā)氧化應(yīng)激，引起多種器官組織損傷，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和內(nèi)皮功能障礙〔3〕。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(CMECs)H/R模型，觀察STS對(duì)CMECs的保護(hù)作用與機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠30只，體重(180～220)g，購(gòu)于濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁育有限公司，實(shí)驗(yàn)單位使用許可證號(hào)SCXK(魯)20190003。

1.2主要試劑 DMEM培養(yǎng)基(上海吉至生化科技有限公司)；胎牛血清(FBS，廣州柏賽柯生物技術(shù)有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)試劑盒、β-actin單克隆抗體(上海恒斐生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS)、RNaseA、碘化丙啶(PI)、胰酶、電化學(xué)(ECL)發(fā)光液(北京伊塔生物科技有限公司)；膜聯(lián)蛋白(Annexin)V-異硫氰酸熒光素(FITC)/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(上海經(jīng)科化學(xué)科技有限公司)；酶切含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-3多克隆抗體、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2相關(guān)X蛋白(Bax)多克隆抗體(武漢亞科因生物技術(shù)有限公司)；p-促分裂原活化蛋白激酶(MEK)單克隆抗體(上海鈺博生物科技有限公司)；p-細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)1/2(上海翔升生物科技有限公司)；基質(zhì)膠(北京索萊寶科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1CMECs的分離與培養(yǎng) 出生4 d以內(nèi)的SD大鼠，全身用75%乙醇進(jìn)行2次全身消毒后，仰臥位固定于超凈臺(tái)中的操作臺(tái)上。開(kāi)胸取心室肌，在37℃的條件下用眼科剪剪碎，并在0.1%的胰蛋白酶消化2～3次，每次消化5 min。隨后在4℃、1 000 r/min條件下離心10 min，棄上清，內(nèi)皮細(xì)胞重懸于含10% FBS DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行鑒定及傳代培養(yǎng)，傳代4次后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2CMECs細(xì)胞H/R模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組 用缺氧液潤(rùn)洗離體培養(yǎng)的細(xì)胞3次(缺氧液預(yù)先用高純氮?dú)怙柡?0 min)，根據(jù)培養(yǎng)皿大小換用不同體積的缺氧液，在1%O2、 5%CO2、95%N2，37℃條件下制作缺氧模型，復(fù)氧實(shí)驗(yàn)時(shí)立即換用正常培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)箱(5%CO2、95%空氣、37℃)條件下培養(yǎng)，制作H/R模型〔4〕。實(shí)驗(yàn)分組為對(duì)照組：除正常培養(yǎng)外不做其他處理；H/R組：構(gòu)建的H/R模型細(xì)胞；低劑量STS組：除培養(yǎng)基外加入12.5 μg/ml STS；中劑量STS組：除培養(yǎng)基外加入25.0 μg/ml STS；高劑量STS組：除培養(yǎng)基外加入50.0 μg/ml STS。

1.3.3MTT比色法檢測(cè)CMECs細(xì)胞活力 CMECs細(xì)胞以2 000個(gè)/孔的密度接種于96孔培養(yǎng)板，給予相應(yīng)處理后，繼續(xù)培養(yǎng)96 h后，每組做3個(gè)復(fù)孔。向每孔加入MTT 10 μl(5 mg/ml)，37℃孵育4 h后，去除培養(yǎng)基，并加入二甲基亞砜(DMSO)150 μl。將96孔培養(yǎng)板置于酶標(biāo)儀上讀數(shù)，設(shè)置波長(zhǎng)490 nm，記錄數(shù)據(jù)〔5〕。

1.3.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 通過(guò)Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞的凋亡率。將細(xì)胞用0.25%胰酶消化，5 min后吸出消化液，用預(yù)冷的PBS洗滌，轉(zhuǎn)移至離心管，離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清。用PBS重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml。隨后加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl PI至100 μl的細(xì)胞懸液中。在室溫下避光孵育5～15 min，然后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，膠質(zhì)瘤細(xì)胞核呈現(xiàn)紅色熒光，即細(xì)胞呈晚期凋亡現(xiàn)象〔6〕〔細(xì)胞凋亡率(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%〕。

1.3.5Western印跡 吸出細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS清洗3次，6孔板每孔中加120 μl放射免疫沉淀試驗(yàn)(RIPA)裂解液，置于冰上裂解20 min，將細(xì)胞裂解物收集到離心管中，離心提取上清液，即為細(xì)胞總蛋白。蛋白經(jīng)沸水變性后冷卻至常溫，在10%的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)。電泳結(jié)束后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，使用聚偏氟乙烯(PVDF)膜恒流轉(zhuǎn)膜2 h；將轉(zhuǎn)膜完畢的PVDF膜取出，浸泡于5%脫脂奶粉配制的封閉液中，37℃封閉1 h后洗膜。洗膜后，分別加Bax多克隆抗體、酶切caspase-3多克隆抗體、p-MEK多克隆抗體、p-ERK2多克隆抗體，一抗稀釋比例為1∶1 000，4℃孵育過(guò)夜；回收一抗，洗滌后加入適量的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h。滴加適量的ECL底物液，孵育數(shù)分鐘，使用凝膠圖像分析系統(tǒng)觀察〔7〕。

1.3.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用胰酶消化，消化4 min后吸出消化液，離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清，加入PBS輕輕吹打重懸，使用移液槍將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)至流式管內(nèi)，離心棄去上清；用PBS洗滌3次，用事先-20℃預(yù)冷的75%乙醇1 ml重懸細(xì)胞，封閉流式管口，-20℃保存過(guò)夜。加入PBS洗滌1遍，離心(1 000 r/min，5 min)后棄去上清；加入100 μl的RNaseA，37℃水浴30 min，加入400 μl的PI溶液并充分混勻，4℃避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，保存數(shù)據(jù)〔8〕。

1.3.7光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)CMECs細(xì)胞血管形成能力 提前1 d把基質(zhì)膠置于冰上4℃融化。在無(wú)菌條件下，將200 μl基質(zhì)膠迅速鋪到-20℃預(yù)冷的6孔板中，使基質(zhì)膠均勻鋪滿整個(gè)板孔，確保膠完全覆蓋孔底，并且無(wú)氣泡，將其放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中至凝固后待用。消化收集細(xì)胞，取2×105個(gè)細(xì)胞均勻接種到有基質(zhì)膠的6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。在光學(xué)顯微鏡下觀察CMECs血管形成情況〔9〕。血管形成率=(血管形成后的細(xì)胞數(shù)量-血管形成前的細(xì)胞數(shù)量)/血管形成前的細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1STS對(duì)CMECs細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組細(xì)胞活力均顯著增高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表1。表明STS可增加H/R誘導(dǎo)后CMECs細(xì)胞活力。

表1 STS對(duì)CMECs細(xì)胞活力、凋亡及細(xì)胞周期的影響

2.2STS對(duì)CMECs細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組相比，H/R組細(xì)胞凋亡率、Bax、酶切caspase-3水平顯著升高(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組細(xì)胞凋亡率、Bax、酶切caspase-3水平均顯著降低，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表1、圖1、圖2。表明STS可抑制H/R誘導(dǎo)的CMECs細(xì)胞凋亡。

2.3STS對(duì)CMECs細(xì)胞周期進(jìn)程的影響 與對(duì)照組比較，H/R組G0/G1期比例明顯升高(P<0.05)，S期明顯降低(P<0.05)，提示，細(xì)胞周期被阻滯在G0/G1期。與H/R組比較，低、中、高劑量STS組細(xì)胞G0/G1期比例依次降低，S期依次升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，G2/M期細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比變化不大，表明STS處理后G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，阻滯解除。見(jiàn)表1、圖3。

2.4STS對(duì)CMECs細(xì)胞血管形成能力的影響 與對(duì)照組相比，H/R組管的形成顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組管的形成均顯著升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)圖4、表2。表明STS可促進(jìn)H/R誘導(dǎo)的血管形成能力。

1～5:對(duì)照組，H/R組，低劑量STS組，中劑量STS組，高劑量STS組，圖5同圖1 Western印跡檢測(cè)Bax、酶切caspase-3水平

圖2 STS對(duì)CMECs細(xì)胞凋亡的影響

圖3 STS對(duì)CMECs細(xì)胞周期的影響

圖4 STS對(duì)CMECs細(xì)胞血管形成能力的影響(×200)

2.5STS對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組相比，H/R組p-MEK、p-ERK2水平顯著降低(P<0.05)；與H/R組比較，低、中、高劑量STS組p-MEK、p-ERK2水平均顯著升高，且呈劑量依賴性(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖5。表明STS可通過(guò)激活MEK/ERK信號(hào)通路抑制H/R誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和血管形成能力。

表2 STS對(duì)CMECs細(xì)胞血管形成能力及MEK/ERK 信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

圖5 STS對(duì)MEK/ERK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討 論

MEK/ERK信號(hào)通路是多種細(xì)胞因子調(diào)控細(xì)胞凋亡和增殖的關(guān)鍵，MEK/ERK信號(hào)通路是血管生成最為重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，MEK/ERK信號(hào)通路的激活能夠促進(jìn)正常內(nèi)皮血管的生成，改善血管內(nèi)皮功能〔10〕。ERK是絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族中重要的成員之一。其中ERK能夠被上游分子MEK的磷酸化激活，進(jìn)入細(xì)胞核，作用于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子及核蛋白，參與血管的調(diào)控，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和分化等作用〔11〕。caspase-3、Bax蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控因子，可反映細(xì)胞凋亡狀態(tài)〔12〕。本研究結(jié)果提示STS使MEK/ERK信號(hào)被激活，凋亡受到抑制。這與前人研究〔13〕發(fā)現(xiàn)的MEK/ERK信號(hào)通路的激活可保護(hù)人CMECs免受H/R誘導(dǎo)的損傷一致。

細(xì)胞周期是指細(xì)胞從一次分裂完成開(kāi)始到下一次分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過(guò)程，分為分裂間期與分裂期2個(gè)階段，并嚴(yán)格按照G0/G1期、S期、G2期、M期的順序進(jìn)行〔14〕。ERK信號(hào)通路在血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及新血管生成過(guò)程中發(fā)揮重要作用，持續(xù)性激活的ERK信號(hào)通路可正向調(diào)控細(xì)胞周期，推動(dòng)細(xì)胞由G1期進(jìn)入S期，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞異常增殖與分化。本研究結(jié)果說(shuō)明STS可以促進(jìn)CMECs細(xì)胞周期進(jìn)展，增強(qiáng)血管形成能力。

綜上，STS對(duì)H/R CMECs損傷的保護(hù)作用與其激活MEK/ERK信號(hào)通路有關(guān)。