李向輝 吳艷玲 崔振宇

(1延邊大學(xué)藥學(xué)院 朝藥研究國家民委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 延吉 133002；2中國人民武裝警察部隊(duì)吉林省總隊(duì)醫(yī)院藥劑科)

近年肝損傷發(fā)病率呈上升趨勢，其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，尚未闡述明晰，氧化應(yīng)激和炎癥刺激是肝臟損傷主要病理特征〔1〕。氧化應(yīng)激是機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化動態(tài)平衡被打破的主要狀態(tài)，一旦氧化應(yīng)激形成，不僅是體內(nèi)氧化與抗氧化的失衡，更重要的是由于失衡所造成的諸多穩(wěn)態(tài)失衡，如中性粒細(xì)胞炎性浸潤，氧化中間產(chǎn)物增多誘發(fā)的炎癥因子、細(xì)胞因子等。脂多糖(LPS)是革蘭陰性菌胞壁內(nèi)毒素主要成分，而肝臟是腸源性LPS攻擊主要靶器官。LPS通過Th1細(xì)胞因子導(dǎo)致肝臟損傷，其誘導(dǎo)小鼠模型可以較好地模擬人肝炎發(fā)病的病理過程。

靈芝為多孔菌科真菌赤芝，是一種珍貴的藥食兩用菌。由于靈芝的營養(yǎng)成分豐富且營養(yǎng)價(jià)值高，靈芝保健品已在我國甚至國外逐步興起。靈芝多糖(GLP)是靈芝中最有效的成分之一，已分離出200多種，多為β-葡聚糖，多糖鏈呈螺旋立體狀，以氫鍵連接，分子量由幾百至數(shù)十萬〔2〕。GLP在熱水中的溶解性極佳，所以能發(fā)揮促進(jìn)血液循環(huán)保健功能〔3〕。GLP具有廣泛的藥理作用，可提高機(jī)體免疫力和耐缺氧能力。此外，GLP還具有降血糖、降血脂、抗腫瘤等生理功能〔4～6〕。本研究主要探討GLP對LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷的保護(hù)效應(yīng)機(jī)制。

1 材料及方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物 30只雄性C57L/6小鼠購于長春憶斯動物有限公司〔動物許可證號：SYXK(吉)2020-0010〕。小鼠分組單籠飼養(yǎng)，溫度控制于(25±2)℃，濕度控制為(45±5)%，自由飲食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境明暗12/12 h循環(huán)。動物實(shí)驗(yàn)相關(guān)操作均遵循延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w，分為正常組、模型組、GLP低劑量(GLP-L)組(3.75 g/kg GLP)、GLP中劑量(GLP-M)組(7.50 g/kg GLP)、GLP高劑量(GLP-H)組(11.25 g/kgGLP)，分組后每天給藥1次，連續(xù)給藥4 w。末次給藥24 h后腹腔注射LPS(10 mg/kg)誘導(dǎo)小鼠急性肝損傷，12 h后麻醉采血，室溫下放置2 h，血清分層后低溫離心，4 000 r/min離心10 min，收集上清保存于-80℃冰箱中備用。收集肝臟組織，-80℃冰箱保存以備后續(xù)檢查。

1.2藥材與試劑 GLP制備：靈芝菌絲體100 g，先用乙醇預(yù)處理，去除脂類物質(zhì)，并使糖苷酶失活，防止多糖降解。隨后加入總重量20倍體積的95℃熱水浸提60 min，連續(xù)浸提3次，合并3次浸提液，減壓濃縮，加入3倍體積的95%乙醇，靜置12 h，離心，加入75%乙醇反復(fù)洗滌，沉淀多糖，獲得粗多糖。采用sevage法去蛋白質(zhì)，再經(jīng)硼酸型deae纖維素柱層析法純化。蒽酮-硫酸法測定GLP含量為1.5 mg/g。

1.3主要儀器 電子天平(賽多利斯)；離心機(jī)(Sigma)；-80℃冰箱(Haier)；酶標(biāo)儀(Bio Tek)；臺式高速離心機(jī)(德國Sigma)；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，白細(xì)胞介素(IL)-1α(上海聯(lián)祖生物科技有限公司)。

1.4樣品收集與處理 在末次給藥24 h后，對小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，頸動脈取血，收集的血液樣品經(jīng)靜置(4℃，60 min)后離心(3 500 r/min，15 min，4℃)得到血清，置于-80℃冰箱保存，用于小鼠血清中ALT、AST、IL-1α指標(biāo)測定。將肝臟組織剝離后鹽水清洗，濾紙吸干即刻置于液氮中，待冷凍后轉(zhuǎn)存于-80℃冰箱中，用于SOD、MDA、GSH-Px水平檢測。

1.5血清生化分析 將收集的小鼠血漿，室溫靜置2 h，在4℃下，4 000 r/min離心10 min，收集上清。測定分析小鼠血清ALT、AST、IL-1α水平，按照試劑盒說明書進(jìn)行測定。

1.6肝臟組織中SOD、GSH-Px及MDA水平檢測 取20 mg肝組織，加入9倍量體積生理鹽水研磨，渦旋混勻3 min，離心(12 000 r/min，15 min，4℃)兩次，獲得上清液，按照試劑盒說明書檢測小鼠肝組織中的SOD、GSH-Px及MDA水平

1.7數(shù)據(jù)處理 采用GraphPad Prism9.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Tukey多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1GLP對LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清ALT、AST活性的影響 與正常組比較，模型組血清中AST和ALT活性顯著升高(P<0.001)，說明小鼠急性肝損傷模型造模成功；與模型組比較，GLP-L、GLP-M、GLP-H組均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠血清ALT、AST活性的升高(P<0.001)，且呈劑量效應(yīng)關(guān)系。見表1。

2.2GLP對LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清IL-1α的影響 與正常組比較，模型組血清IL-1α水平顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，GLP-L、GLP-M、GLP-H組血清IL-1α水平均顯著降低(P<0.001)，且呈現(xiàn)劑量依賴性。見表1。

2.3GLP對LPS誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠肝組織中SOD、GSH-Px、MDA活性的影響 與正常組比較，模型組肝臟中SOD、GSH-Px活性顯著降低，MDA活性顯著升高(P<0.001)；與模型組比較，GLP-L、GLP-M、GLP-H組均能顯著抑制LPS誘導(dǎo)的肝損傷模型小鼠肝臟SOD、GSH-Px活性的降低及MDA活性的升高(P<0.001，P<0.01)。見表1。

表1 各組血清ACT、AST活性和IL-1α水平及肝組織中SOD、GSH-Px、MDA活性比較

3 討 論

肝臟是重要的機(jī)體代謝及解毒器官，多種因素可誘發(fā)肝損傷，如代謝異常、藥物、酒精、病毒及自身免疫性因素；不及時(shí)治療可進(jìn)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌等終末期肝病〔7～11〕。肝臟損傷時(shí)，首先產(chǎn)生大量的活性氧自由基(ROS)，形成氧化應(yīng)激狀態(tài)，干擾機(jī)體能量代謝。機(jī)體內(nèi)自由基代謝的平衡主要由抗氧化系統(tǒng)調(diào)控，包括SOD、GSH-Px、過氧化氫酶(CAT)等。MDA是脂質(zhì)過氧化物降解的主要產(chǎn)物，而MDA則間接體現(xiàn)自由基攻擊機(jī)體時(shí)細(xì)胞受損的程度。正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化與抗氧化處于動態(tài)平衡，外界刺激造成機(jī)體內(nèi)ROS與活性氮自由基(RNS)等表達(dá)量增多，同時(shí)機(jī)體清除能力卻下降，因此機(jī)體氧化與抗氧化的平衡就受到破壞，形成氧化應(yīng)激。ROS是以氧為中心的活性基團(tuán)，包括超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)，這些活性基團(tuán)可僅有被催化為過氧自由基(ROO-)、烷氧基(RO-)及硫自由基(RS-)，受多種刺激因素機(jī)體內(nèi)堆積大量的未被完全還原的O2進(jìn)而引發(fā)ROS大量激增〔12〕。如酒精刺激，酒精可引起線粒體電子傳遞鏈等功能障礙，還原型輔酶Ⅱ(NADPH)氧化酶或活化細(xì)胞色素PD459E1(CYP2E1)則可催化分子氧形成大量ROS，進(jìn)一步抑制脂肪酸氧化，形成酒精性脂肪肝病〔13〕。已有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激與肝炎、肝纖維化、肝硬化及肝癌等關(guān)系密切〔14〕。

各類因素刺激的ROS激增，不僅造成肝細(xì)胞損傷，還可形成脂質(zhì)過氧化，肝細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化可增加細(xì)胞膜的通透性，破壞細(xì)胞內(nèi)膜結(jié)構(gòu)，促進(jìn)白三烯、血栓素等生物獲悉物質(zhì)產(chǎn)生，進(jìn)一步誘發(fā)炎癥反應(yīng)。肝臟損傷時(shí)大量炎癥因子釋放，幾乎所有原因所致肝臟疾病中都存在炎癥，而且貫穿疾病的始終，已證實(shí)多數(shù)肝損傷都伴隨炎癥〔15,16〕。因此以調(diào)控氧化應(yīng)激和炎癥為抓手，針對性治療肝損傷，可以延緩疾病進(jìn)展，提高患者生活質(zhì)量〔17〕。

GLP由三股單糖鏈溝通，具有螺旋狀的三級立體構(gòu)型，其藥理活性與單糖間糖苷鏈結(jié)合形式和立體構(gòu)型密切相關(guān)〔18〕。目前利用紫外可見光譜、紅外光譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等多項(xiàng)技術(shù)已分離獲得200余種GLP，對GLP等三旋螺旋梯結(jié)構(gòu)及多糖結(jié)構(gòu)特性進(jìn)行了全面分析，特別是構(gòu)效關(guān)系也獲得了較大進(jìn)步，構(gòu)效關(guān)系的繼續(xù)深入研究還有大量工作要完善〔19〕。GLP可有效提高機(jī)體免疫力，加速血液微循環(huán)，消除體內(nèi)自由基，提高抗病愈病能力。本研究中發(fā)現(xiàn)GLP可有效改善LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷中氧化應(yīng)激，調(diào)控SOD、MDA及GSH-Px活性。肝臟損傷時(shí)，轉(zhuǎn)氨酶是肝實(shí)質(zhì)損傷密切相關(guān)指標(biāo)，肝細(xì)胞受損則釋放轉(zhuǎn)氨酶，轉(zhuǎn)氨酶越高則肝臟損傷越嚴(yán)重。轉(zhuǎn)氨酶種類繁多，如賴氨酸、蘇氨酸及其他α-氨基酸均可參與轉(zhuǎn)氨基作用并形成特異性轉(zhuǎn)氨酶，眾多轉(zhuǎn)氨酶中ALT和AST最為重要，分別參與催化谷氨酸與丙酮酸間及谷氨酸與草酰乙酸間的轉(zhuǎn)氨作用。本研究結(jié)果可見GLP可有效降低LPS誘導(dǎo)肝損傷小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶水平，表明GLP可保護(hù)肝細(xì)胞受損，防止進(jìn)一步的肝臟損傷。IL是白細(xì)胞、免疫細(xì)胞間相互作用的主要細(xì)胞因子，發(fā)揮傳遞信息，激活或調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞，介導(dǎo)T細(xì)胞和B細(xì)胞的活化、增殖及分化，參與炎癥反應(yīng)。促炎因子IL-1α的活化通常需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(caspase)-1的切割，受炎性小體的調(diào)控。核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白(NLRP)3是最具特征性的炎性小體，其可激活I(lǐng)L-1α的成熟。ROS不僅可以引發(fā)氧化應(yīng)激還能參與炎癥級聯(lián)反應(yīng)，ROS可激活NLRP3炎性小體，其激活后進(jìn)一步通過caspase-1導(dǎo)致IL-1α分泌增多，形成ROS-NLRP3-IL-1α的聯(lián)動模式。因此在進(jìn)一步研究中，本研究發(fā)現(xiàn)GLP可以降低LPS誘導(dǎo)畸形肝損傷小鼠血清炎癥因子IL-1α水平，說明GLP通過抑制炎癥因子來改善LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷，也進(jìn)一步驗(yàn)證GLP通過抑制調(diào)控ROS-NLRP3-IL-1α的聯(lián)動模式改善LPS刺激肝細(xì)胞損傷。ROS-NLRP3-IL-1α的調(diào)控可能有益于GLP對肝損傷的改善作用。綜上所述，GLP在抗LPS誘導(dǎo)小鼠肝損傷方面有明顯的緩解作用，可以作為保肝護(hù)肝的有效功能因子制成保健食品或藥物，但具體調(diào)控作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

尋找天然抗氧化劑，降低肝細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，緩解肝病，對于各類肝病的防治具有重要的研究價(jià)值和指導(dǎo)意義。GLP作為眾多天然產(chǎn)物中的佼佼者，對肝損傷有較好的治療效果。相信隨著氧化應(yīng)激的介導(dǎo)肝病相關(guān)信號通路的深入研究，將發(fā)現(xiàn)GLP改善肝病的特異靶向治療策略，為GLP臨床應(yīng)用將提供新的策略和思路。