韓永凱 張萍 李斯娜 李靜 王旭生 張帆 杜愛玲 張留莎 宋景貴

(新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院 1神經(jīng)內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 453002；2急診科；3新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科)

老年癲癇是指60歲或65歲以后發(fā)病的癲癇，發(fā)作時常伴有認知、精神、社會學等諸方面功能障礙，癲癇急性發(fā)作后可能會造成不可逆的腦損傷，又因患者為老年人群，因此致殘率和病死率都很高〔1〕。目前臨床常采用許多量表對老年癲癇患者病情及預(yù)后進行評估，但其準確性和及時性難以滿足臨床需求，因此，急需簡便、準確評估老年癲癇患者短期預(yù)后的臨床指標〔2〕。長鏈非編碼RNA(LncRNA)MIR155HG是長度為1 500 bp的LncRNA，因其為miR-155的宿主基因而得名〔3〕。目前，已有研究表明血清外泌體中miR-155與癲癇發(fā)生有密切聯(lián)系，然而未見LncRNA MIR155HG與癲癇相關(guān)性的報道〔4〕。外泌體廣泛分布于血液、腦脊液等體液中，在許多生理病理過程中起著重要作用〔5〕。本研究通過檢測老年癲癇患者血漿外泌體中LncRNA MIR155HG表達水平，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年5月至2019年6月因癲癇急性發(fā)作于新鄉(xiāng)醫(yī)學院第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診就診、住院的159例老年癲癇患者，納入標準：①符合癲癇診療指南中的診斷標準〔6〕；②病歷資料齊全者；③有頭顱CT或磁共振成像(MRI)等神經(jīng)影像學腦電圖結(jié)果者；④年齡>60歲者。排除標準：①僅有一次臨床發(fā)作者；②因低血糖或肝、腎等臟器病變因素引起抽搐患者；③患腦出血、腦腫瘤等引起抽搐患者；④腦電圖有癇性放電但臨床發(fā)作不典型者。所有患者由主治醫(yī)師明確診斷，本試驗經(jīng)醫(yī)院臨床研究倫理委員會批準，符合倫理學標準，所有受試對象家屬由專業(yè)人員詳細告知研究內(nèi)容并自愿參加，并簽署知情同意書。根據(jù)隨訪期間是否發(fā)生預(yù)后不良將患者分為預(yù)后不良組(76例)和預(yù)后良好組(83例)，其中預(yù)后不良組年齡60～87歲；預(yù)后良好組年齡60～86歲。兩組性別、年齡、體重指數(shù)(BMI)、吸煙史、飲酒史、文化程度、蒙特利爾認知評估(MoCA)量表評分差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1。

1.2主要試劑與儀器 白細胞介素(IL)-2、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號：JK-a-1494)、IL-6 ELISA試劑盒(貨號：JK-a-0023)、IL-8 ELISA試劑盒(貨號：JK-a-1002)、IL-1β ELISA試劑盒(貨號：JK-a-1438)、腫瘤壞死因子(TNF)-α ELISA試劑盒(貨號：JK-a-0016)均購自上海晶抗生物工程有限公司；exoRNeasy serum/plasma Midi kit(貨號：77044)，購自上海浩洋生物科技有限公司；miScript SYBR?Green qPCR Kit(貨號：218076)，購自德國QIAGEN公司；AceQ qPCR SYBR?Green Mix(貨號：Q111-02)，購自南京諾唯贊生物科技有限公司，CFX384實時熒光定量-聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)儀，購自美國Bio-Rad公司。

表1 兩組一般資料比較

1.3研究方法

1.3.1樣品采集及保存 抽取老年癲癇患者急性發(fā)作后24 h內(nèi)清晨空腹靜脈血樣置于EDTA-K2抗凝真空管中，3 000 r/min離心15 min后收集血漿，置于-80℃保存待測。

1.3.2一般資料收集 查閱門診及住院病歷，收集患者一般資料，包括性別、年齡、BMI、吸煙史、飲酒史、文化程度(低：小學及以下；中：初高中；高：大學及以上)；通過MoCA量表對患者進行認知功能評估，該量表涉及8個認知領(lǐng)域的評估，其中包括命名、語言、注意、空間與執(zhí)行功能、回憶、延遲、抽象和定向力。MoCA總分為30分，當受試者受教育年限<12年時，在測試得分的基礎(chǔ)上加1分，校正由教育程度產(chǎn)生的偏倚，得分越高認知功能越好。

1.3.3qRT-PCR檢測血漿外泌體LncRNA MIR-155HG水平 采用qRT-PCR檢測老年癲癇患者血漿外泌體中LncRNA MIR155HG表達水平。采用exoRNeasy試劑提取血漿外泌體總RNA，反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，具體操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。采用qRT-PCR儀對LncRNA MIR155HG及其內(nèi)參GAPDH進行擴增，引物序列：LncRNA MIR155HG正向：5'-TGGAACAAATTGCTGCCGTG-3'，反向5'-AGGTTGAACATCCCAGTGACC-3';GAPDH正向：5'-ATTTGGCTACAGCAACAGGGTG-3'，反向：5'-TGGTTGAGCACAGGGTACTTTATTG-3'。qRT-PCR體系共20 μl：cDNA(50 ng/μl)2 μl，miScript SYBR?Green Mix 10 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.4 μl，引物由上海生工生物公司合成。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，40個循環(huán)。每份樣品均設(shè)3個重復(fù)孔，采用2-ΔΔCT法計算血漿外泌體LncRNA MIR155HG相對表達量。

1.3.4血漿細胞因子水平檢測 采用ELISA檢測老年癲癇患者血漿IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.3.5隨訪 患者隨訪1年，以其癲癇發(fā)作頻率較就診前的改變?yōu)闃藴逝袛喟l(fā)作的變化狀況，無癲癇發(fā)作83例作為預(yù)后良好組，發(fā)作次數(shù)無減少或較前較少<50%(或患者病情未得到改善甚至加重)76例作為預(yù)后不良組。

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS23.0軟件進行t檢驗、χ2檢驗、Pearson相關(guān)分析、Logistic回歸分析，采用受試者工作特征曲線(ROC)分析血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平對老年癲癇患者預(yù)后不良的預(yù)測價值。

2 結(jié) 果

2.1兩組血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平比較 預(yù)后不良組血漿外泌體中LncRNA MIR155HG水平(1.54±0.41)明顯高于預(yù)后良好組(1.00±0.23，P<0.05)。

2.2兩組血漿細胞因子水平比較 預(yù)后不良組血漿中IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平明顯高于預(yù)后良好組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組血漿細胞因子水平比較

2.3預(yù)后不良組老年癲癇患者血漿外泌體LncRNA MIR155HG與血漿細胞因子水平相關(guān)性 預(yù)后不良組老年癲癇患者血漿外泌體LncRNA MIR155HG與血漿IL-2(r=0.486，P=0.006)、IL-6(r=0.493，P=0.005)、IL-8(r=0.508，P=0.002)、IL-1β(r=0.483，P=0.006)、TNF-α(r=0.514，P=0.001)水平呈正相關(guān)。

2.4血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平對老年癲癇患者預(yù)后不良的預(yù)測價值 以血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平為檢驗變量繪制ROC曲線，結(jié)果顯示，血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平預(yù)測老年癲癇患者預(yù)后不良的曲線下面積(AUC)為0.852(95%CI:0.790～0.915)，截斷值為1.171，特異性為79.5%，敏感度為85.5%。見圖1。

圖1 血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平 預(yù)測老年癲癇患者預(yù)后不良的ROC曲線

2.5影響老年癲癇患者預(yù)后不良的多因素分析 將老年癲癇患者是否發(fā)生預(yù)后不良作為因變量，以血漿外泌體LncRNA MIR155HG水平及血漿IL-2、IL-6、IL-8、IL-1β、TNF-α水平為自變量進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示LncRNA MIR155HG、TNF-α是影響老年癲癇患者預(yù)后不良的獨立危險因素。見表3。

表3 影響老年癲癇患者預(yù)后不良的多因素分析

3 討 論

癲癇是諸多因素引起大腦神經(jīng)元異常放電所致的短暫性腦功能失調(diào)病，可見于各年齡段，且兒童癲癇發(fā)病率高于成人〔7〕。而進入老年期后，由于老年癡呆、腦血管疾病及神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變增多，癲癇的發(fā)病率又隨之上升〔8〕。老年人癲癇通常是指60歲以上老年人出現(xiàn)至少2次的癇性發(fā)作，又因老年人基礎(chǔ)疾病較多，癲癇急性發(fā)作后易造成高致殘率和死亡率，給老年癲癇患者及家庭帶來沉重的心理和經(jīng)濟負擔，同時對社會產(chǎn)生較多負面影響〔9,10〕。

老年人癲癇的發(fā)病機制尚未明了，但以免疫學發(fā)病機制研究較多〔11,12〕。癲癇患者存在免疫異常，且其體液中部分細胞因子的變化也處于異常狀態(tài)〔13〕。外泌體是細胞產(chǎn)生的小于150 nm的雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，可參與包括阿爾茲海默病、帕金森病在內(nèi)的多種腦部疾病的發(fā)生和發(fā)展，因此血漿外泌體的研究可能對老年癲癇有重要意義〔14〕。LncRNA可通過表觀遺傳修飾與轉(zhuǎn)錄后加工等多種機制在細胞生命活動中發(fā)揮作用，且在先天性和獲得性免疫系統(tǒng)中，對免疫細胞的激活和分化發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用〔15〕。LncRNA MIR155HG是miR-155的宿主基因，LncRNA MIR155HG中包含有miR-155的前體序列，已有研究表明，miR-155在癲癇的免疫炎癥機制中發(fā)揮重要作用〔16,17〕。本研究結(jié)果提示LncRNA MIR155HG與老年癲癇患者的預(yù)后有密切聯(lián)系，可能作為癲癇治療的新靶點，推測可能是LncRNA MIR155HG作為miR-155的宿主基因，同樣有調(diào)節(jié)炎性血腦屏障的白細胞黏附及廣泛的促炎作用，可進一步加重患者病情，影響老年癲癇患者預(yù)后，增加預(yù)后不良概率。劉丹丹等〔18〕研究表明細胞因子在癲癇發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，IL-2為Th細胞應(yīng)激狀態(tài)下分泌的一種糖蛋白，可促進淋巴細胞增生和生存，調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)〔19〕；IL-6為早期炎癥因子，在炎癥、感染及患腫瘤過程中可能會發(fā)揮免疫作用〔13〕；IL-8由巨噬細胞產(chǎn)生，其水平上升可能會增加局部組織的炎癥反應(yīng)〔20〕；IL-1β的異常分泌通常與一些常見的自身免疫性疾病的發(fā)生有關(guān)〔21〕；TNF-α可加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，影響神經(jīng)元的興奮性，引起疾病反復(fù)發(fā)作〔13〕。本研究結(jié)果與李超等〔22〕研究結(jié)果接近，也和李欣等〔23〕研究中血清細胞因子在癲癇患者中的表達趨勢一致。推測預(yù)后不良組老年患者中各類血漿細胞因子水平上升，加劇腦內(nèi)炎癥反應(yīng)，破壞血腦屏障，引起疾病的反復(fù)發(fā)作，造成不良預(yù)后。而本研究Pearson相關(guān)分析結(jié)果進一步表明血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平的變化可為評估老年癲癇患者病情及預(yù)后提供一定依據(jù)。此外，本研究提示作為影響老年癲癇患者預(yù)后不良的危險因素，血漿外泌體LncRNA MIR155HG對預(yù)后具有重要的提示作用，且當其表達量>1.171時，老年癲癇患者發(fā)生預(yù)后不良的概率可能更大。

綜上，血漿外泌體LncRNA MIR155HG與血漿細胞因子水平均有一定的相關(guān)性，表明在臨床診治過程中，老年癲癇急性發(fā)作后血漿外泌體LncRNA MIR155HG表達水平的變化可為評估病情及預(yù)后提供一定依據(jù)。但LncRNA MIR155HG水平影響老年癲癇患者預(yù)后的具體機制仍不十分明確，需進一步深入研究。且本研究樣本數(shù)量較小，范圍局限，需加大樣本量進一步研究。