張凡 齊鵬飛 李道明 張會娟

(商丘醫(yī)學高等?？茖W校 1外科學教研室，河南 商丘 476000；2醫(yī)學技術(shù)系；鄭州大學第一附屬醫(yī)院 3病理科；4內(nèi)分泌科)

甲狀腺癌(TC)作為臨床多見的一種惡性腫瘤，其患病率受人類生活方式及人口老齡化等因素的影響正呈逐年升高趨勢，對人類生命健康造成了極大威脅〔1,2〕。與臨床上多種惡性腫瘤相似，TC發(fā)病早期的隱匿性極強，絕大多數(shù)患者確診時已是中晚期，預后普遍不良〔3〕。因此，尋找一種有效診斷TC的手段具有極其重要的意義。核因子(NF)-κB p65屬于NF-κB的重要成員之一，可能參與多種炎癥因子表達過程，繼而間接影響腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程〔4〕。高遷移率族蛋白(HMG)B1是核內(nèi)結(jié)合蛋白之一，主要是介導了基因重組、復制及修復過程，可能通過Ras信號通路等途徑刺激細胞的異常增殖〔5〕。本文擬分析TC組織中NF-κB、HMGB1表達，旨在為臨床TC的診斷提供新的靶點與思路。

1 對象與方法

1.1一般資料 選取鄭州大學第一附屬醫(yī)院2015年1月1日至2016年12月30日收治的91例TC患者，男32例，女59例；年齡51～78歲，平均(61.35±10.72)歲；腫瘤直徑0.8～3.3 cm，平均(1.35±0.32)cm；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。入組標準〔6〕：(1)所有入組人員完成影像學檢查和手術(shù)病理活檢且確診為TC；(2)年齡>50歲；(3)入組前尚未接受抗腫瘤干預。剔除標準：(1)意識障礙或無法完成相關(guān)檢查者；(2)伴有其他惡性腫瘤者；(3)研究期間因故退出者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會獲悉并核準。

1.2儀器及試劑 電熱恒溫培養(yǎng)箱(購自上海博工實驗設(shè)備制造廠)；手提式壓力蒸汽滅菌器(購自上海醫(yī)用核子儀器廠)；顯微鏡(購自南京麒麟科學儀器集團有限公司)；干燥箱(購自中國科學院上海光機所)。兔抗人NF-κB p65、HMGB1多克隆抗體均購自博士德生物工程有限公司；自行配制磷酸鹽緩沖液(PBS)，枸櫞酸鹽抗原修復液，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物工作液及過氧化氫。

1.3研究方法 (1)制作切片：分別將所有受試者術(shù)中切除獲取的甲狀腺組織取材2 mm左右，以濃度為4%的甲醛溶液進行固定，梯度乙醇脫水處理。隨后進行石蠟包埋，冷凍處理后作厚度為4 μm的連續(xù)切片。并將切片放置于60℃烤箱中烘烤2 h，最后置于4℃冰箱中保存待檢。(2)蘇木素-伊紅(HE)染色：對上述處理好的切片進行脫蠟處理，分別放置在無水乙醇Ⅰ中5 min，流水反復沖洗3 s；無水乙醇Ⅱ中5 min，流水反復沖洗3 s；95%乙醇中5 min，流水反復沖洗3 s；80%乙醇中5 min，流水反復沖洗3 s；蒸餾水中5 min，流水反復沖洗3 s；蘇木素中5 min，流水反復沖洗3 s；1%鹽酸乙醇中3 s，流水反復沖洗30 s；0.5%伊紅液中4 min，蒸餾水沖洗2 s。梯度乙醇中脫水各2 min，最后置于二甲苯Ⅰ及二甲苯Ⅱ中各5 min，并封片。(3)SP染色：取出切片脫蠟水化，依次置入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ及不同梯度乙醇中浸泡，并以PBS重復清洗3次，5 min/次。以枸櫞酸抗原修復液進行抗原修復，并將切片置于抗原修復液中，同時置入手提壓力蒸汽滅菌器中，待觀察到蒸汽冒出后2 min取出，以自來水沖洗30 min，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加過氧化氫孵育，PBS沖洗，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。隨后滴加山羊血清，進行時長為15 min的孵育，封閉非特異性抗原。滴加50 μl一抗，并以1∶100比例進行稀釋，隨后放置在4℃冰箱中過夜。翌日恢復至室溫，采用PBS沖洗3次，5 min/次。滴加生物素二抗工作液1滴，孵育15 min，PBS沖洗3次，5 min/次。滴加辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素，孵育15 min，PBS液沖洗3次，5 min/次。DAB顯色，樹膠封片。

1.4評價標準〔7〕NF-κB p65、HMGB1均定位在細胞核或細胞質(zhì)，以棕黃色顆粒為陽性細胞。隨機選擇10個視野，每個視野觀察100個細胞，細胞核或細胞質(zhì)基本不著色計0分；淡黃色計1分；棕黃色計2分；棕褐色計3分。陽性細胞占比<5%計0分；5%～25%計1分；26%～50%計2分；>50%計3分。將兩項評分的乘積作為最終結(jié)果，將0～1分為陰性，≥2分為陽性。

1.5統(tǒng)計學處理 采用SPSS22.0軟件進行方差齊性檢驗、t檢驗及χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1差異性甲狀腺組織中NF-κB p65、HMGB1表達比較 TC組織中NF-κB p65、HMGB1陽性率(87.91%，80例；68.13%，62例)均高于癌旁正常組織(20.88%，19例；8.79%，8例)，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=82.417、67.693，均P=0.000)，見圖1。

NF-κB p65表達

HMGB1表達

2.2TC組織中NF-κB p65、HMGB1表達和臨床病理特征的關(guān)系 腫瘤直徑≥1.0 cm、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移TC患者NF-κB p65、HMGB1陽性率高于腫瘤直徑<1.0 cm、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者，差異有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見表1。

表1 TC組織中NF-κB p65、HGMB1表達和臨床病理特征的關(guān)系〔n(%)〕

2.3TC組織中NF-κB p65、HMGB1表達與預后的關(guān)系 TC死亡患者NF-κB p65、HMGB1陽性率〔57例(95.00%)、48例(80.00%)〕高于存活患者〔23例(74.19%)、14例(45.16%)〕，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=8.327、11.426；P=0.004、0.001)。

3 討 論

目前普遍認為，遺傳、放射性接觸和碘攝入量異常等因素均可能參與了TC的發(fā)生、發(fā)展過程〔8〕。早期診治對患者預后的改善具有積極作用，其中CT、磁共振成像(MRI)及病理檢查等均是臨床上診斷TC的重要手段〔9～11〕。其中病理檢查是全球范圍內(nèi)公認的TC診斷金標準，但該檢查會對受檢者造成一定的創(chuàng)傷，且對受檢者耐受性與配合度要求均較高，具有較高的臨床推廣局限性〔12～14〕。其中CT與MRI等影像學檢查雖可為醫(yī)生提供病灶數(shù)目及直徑等信息，卻難以完成對病灶性質(zhì)的鑒別，可能出現(xiàn)假陽性及假陰性情況。隨著近年來相關(guān)研究的不斷深入，分子診斷開始在TC的診斷中受到了廣泛關(guān)注。

本文結(jié)果顯示，TC組織中NF-κB p65、HMGB1表達異常升高，與杜朝陽等〔15〕研究相符。分析原因，NF-κB p65可通過C段結(jié)構(gòu)域夾心結(jié)構(gòu)形成二聚體，且經(jīng)由信號傳導通路對細胞凋亡、炎癥介質(zhì)的釋放及腫瘤形成起到調(diào)節(jié)作用。HMGB1作為存在于真核細胞核內(nèi)的一種非組蛋白染色體結(jié)合蛋白，但受到外界信號刺激時，其賴氨酸殘基會被乙?；?，并釋放至細胞外，于DNA的重組、復制及修復過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，且可通過激活MAPK及Ras等多種信號通路，刺激炎癥反應(yīng)及細胞的異常增殖，對細胞惡變具有積極促進作用〔16～18〕。

此外，TC組織中NF-κB p65、HMGB1表達和腫瘤大小及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，即隨著上述兩項蛋白表達的升高，TC患者的腫瘤越大，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生風險越高?？紤]原因可能是NF-κB p65可直接或間接誘導抗腫瘤細胞的凋亡，繼而促進腫瘤細胞增殖，同時可上調(diào)和腫瘤細胞浸潤及生長密切相關(guān)的多種基因表達，在腫瘤發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中起至關(guān)重要的作用。HMGB1可通過促進細胞外鈣離子內(nèi)流，從而提高內(nèi)皮生長因子的活性，實現(xiàn)對細胞外信號調(diào)節(jié)激酶的活化作用，繼而引起細胞骨架肌動蛋白結(jié)構(gòu)的變化，提升細胞運動性，間接參與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移過程。同時，HMGB1可通過和纖溶酶原系統(tǒng)相結(jié)合，繼而發(fā)揮激活多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)活性的作用，起到細胞外基質(zhì)降解作用，從而促進了腫瘤轉(zhuǎn)移及浸潤〔19,20〕。

另外，隨著NF-κB、HMGB1表達的不斷升高，TC患者預后越差。

究其原因，可能是由于NF-κB、HMGB1表達的異常升高，在一定程度上反映了患者的病情不斷惡化、浸潤及轉(zhuǎn)移風險較大，從而增加了臨床治療的難度，對預后造成不利影響。

綜上，TC組織中NF-κB、HMGB1均存在異常高表達，且和腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及預后轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。