阮云丹 湯艷蘭 張星鑫

(1湖北文理學(xué)院附屬襄陽市中心醫(yī)院血液腫瘤科，湖北 襄陽 441100；2武漢大學(xué)人民醫(yī)院血液腫瘤科)

多發(fā)性骨髓瘤(MM)是源于漿細胞的常見血液系統(tǒng)惡性增殖性疾病，好發(fā)于中老年群體，患者可表現(xiàn)出貧血、反復(fù)感染、骨破壞、腎功能異常等特征〔1〕。盡管近些年隨著免疫調(diào)節(jié)劑、蛋白酶抑制劑、造血干細胞移植治療等應(yīng)用，MM患者總生存期(OS)、無進展生存期(PFS)有一定延長，但該病仍無法治愈〔2〕。目前報道的MM生存時間從數(shù)月到數(shù)十年不等，且表現(xiàn)出明顯個體差異，尤其是老年MM患者，因臟器功能減退、認知功能下降等原因，在治療中不良反應(yīng)大、中斷率高，如何精準評估這類人群預(yù)后仍是臨床關(guān)注重點〔3〕。腫瘤發(fā)生發(fā)展離不開腫瘤微環(huán)境，其中以免疫、炎癥最突出，血小板與淋巴細胞比值(PLR)作為反映機體免疫、炎癥狀態(tài)的常用指標，被認為與非小細胞肺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤發(fā)展及預(yù)后相關(guān)〔4〕。微小RNA(miRNA)作為長度約22個堿基的非編碼RNA，可參與機體細胞增殖、分化、凋亡、免疫應(yīng)答等生物學(xué)過程，與某些腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)聯(lián)密切，其中miRNA-181a作為與造血相關(guān)的miRNA，目前在血液系統(tǒng)惡性腫瘤研究中受到關(guān)注〔5〕。當前國內(nèi)關(guān)于PLR、miRNA-181a與MM關(guān)系報道并不多見，本研究通過分析二者在MM患者中表達及與患者臨床病理特征、生存時間關(guān)系，旨在為MM診療及預(yù)后判斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年6月至2019年6月襄陽市中心醫(yī)院收治的MM患者，納入標準：符合《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南》(2015年修訂)〔6〕中MM診斷標準；初診患者；于醫(yī)院接受規(guī)范治療；年齡≥60歲；精神認知良好；可配合隨訪。排除標準：確診孤立漿細胞瘤；復(fù)發(fā)性MM；合并自身免疫性疾病、其他惡性腫瘤、嚴重感染、營養(yǎng)不良、多器官功能障礙者；因其他血液系統(tǒng)疾病引起的淋巴細胞或血小板異常；參與其他研究者。共129例MM患者設(shè)為MM組，年齡60～81〔平均(67.18±4.82)〕歲。同期門診60例老年健康體檢者設(shè)為對照組，男34例，女26例，年齡60～79〔平均(66.35±5.06)〕歲。MM組與對照組性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

1.2PLR檢測 采集患者入組時(未治療)肘靜脈血3 ml，送檢驗科檢查血常規(guī)，采用全自動血液分析儀(日本SYSMEX XE-2100)，計算血小板計數(shù)/淋巴細胞計數(shù)值，即PLR值。

1.3血清miRNA-181a表達檢測 采集入組時肘靜脈血標本，4℃、8 917 r/min條件下離心5 min，留取上清液于無菌、無酶EP管，-80℃條件下保存?zhèn)溆谩０凑昭錷iRNA快速提取試劑盒(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)說明提取血清miRNA，參照miRNA first-strand cDNA synthesis Kit試劑盒說明書(上海鈺博生物科技有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄；合成的cDNA作為模板，參照miRNA Real-time PCR試劑盒說明書(上海澤葉生物科技有限公司)進行擴增，采用美國Bio-Rad公司Bio-CFX96定量PCR儀，以U6為內(nèi)參基因(正義鏈5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，反義鏈5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′)，miRNA-181a引物序列分別為正義鏈5′-GCGGTAACATTCAACGCTGTCG-3′、反義鏈5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；反應(yīng)條件：92℃ 35 s，63℃ 35 s，72℃ 45 s，32個循環(huán)后，72℃ 延伸10 min。結(jié)果于熒光定量操作系統(tǒng)下分析，以2-△△Ct法分析miRNA-181a相對表達量。

1.4其他實驗室指標 檢測血清標本中與MM相關(guān)的其他臨床指標，主要包括血清鈣、血清白蛋白、血紅蛋白、乳酸脫氫酶、肌酐、β2-微球蛋白。

1.5治療及隨訪 患者結(jié)合腫瘤進展、化療耐受性、經(jīng)濟條件等進行治療，采用VD方案(硼替佐米+地塞米松)41例，TD方案(沙利度胺+地塞米松)29例，MP方案(馬法蘭+潑尼松)10例，VAD方案(長春新堿+阿奇霉素+地塞米松)25例，VDT方案(硼替佐米+地塞米松+沙利度胺)21例、PCD方案(硼替佐米+環(huán)磷酰胺+地塞米松)3例。上述治療中所用藥物如下：注射用硼替佐米(正大天晴藥業(yè)集團股份有限公司，國藥準字H20183262)；地塞米松(廣東南國藥業(yè)有限公司，國藥準字H44024618)；沙利度胺片(常州制藥廠有限公司，國藥準字H32026219)；馬法蘭(澳大利亞葛蘭素威廉公司，注冊證號H20100160)；醋酸潑尼松片(上海上藥信誼藥廠有限公司，原上海信誼藥廠有限公司，國藥準字H31020675)；長春新堿(廣州白云山明興制藥有限公司，國藥準字H44022399)；阿奇霉素(輝瑞制藥有限公司，國藥準字H10960112)；復(fù)方環(huán)磷酰胺片(通化茂祥制藥有限公司，國藥準字H22026738)。2個療程后評估化療方案有效性，有效者完成4個療程后評估疾病情況，無效或進展者更換其他方案治療。治療期間隨時對患者癥狀體征、實驗室指標進行評估，予以針對性處理。出院后，采取門診、電話形式進行隨訪，隨訪時間截至2020年12月31日。OS定義為疾病確定到死亡或最后隨訪時間，PFS定義為疾病確診到疾病進展、復(fù)發(fā)、死亡或最后隨訪時間。

1.6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件，符合正態(tài)分布計量資料采用獨立樣本t檢驗；不符合正態(tài)分布計量資料用中位數(shù)、四分位數(shù)間距〔M(P25，P75)〕表示，行Mann-Whitney檢驗；計數(shù)資料行χ2檢驗；繪制受試者工作特征(ROC)曲線評價PLR、血清miRNA-181a診斷效能，并以約登指數(shù)最大時對應(yīng)PLR、血清miRNA-181a水平確定臨界值；采用Kaplan-Meier法行生存分析，Log-rank檢驗比較生存率。

2 結(jié) 果

2.1兩組PLR、血清miRNA-181a表達比較 MM組PLR值及血清miRNA-181a表達水平均明顯高于對照組(P<0.05)。見表1。

2.2PLR、血清miRNA-181a表達對MM診斷價值 以MM為狀態(tài)變量，以PLR、血清miRNA-181a為檢驗變量繪制ROC曲線，見表2和圖1。

表1 MM組與對照組PLR、血清miRNA-181a 表達比較〔M(P25,P75)〕

2.3PLR值與臨床病理關(guān)系 根據(jù)ROC曲線確定的臨界值，將MM患者分為高PLR組(PLR≥140.12)58例，低PLR組(<140.12)71例。結(jié)果顯示，高PLR組血小板計數(shù)明顯高于低PLR組(P<0.05)，兩組性別、年齡、國際分期系統(tǒng)(ISS)分期、Durie-Salmon(D-S)分期、免疫分型、淋巴細胞計數(shù)、血清鈣、血清白蛋白、血紅蛋白、乳酸脫氫酶、肌酐、β2-微球蛋白比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表2 PLR、血清miRNA-181a診斷MM的ROC AUC

圖1 PLR、血清miRNA-181a診斷MM的ROC曲線

2.4血清miRNA-181a表達與臨床病理關(guān)系 根據(jù)ROC曲線確定的臨界值，將血清miRNA-181a表達分為高表達組(miRNA-181a≥1.52)85例，低表達組(<1.52)44例。結(jié)果顯示，高表達組ISS分期Ⅲ期占比、D-S分期Ⅲ期占比、肌酐、β2-微球蛋白均明顯高于低表達組(P<0.05)，淋巴細胞計數(shù)、血清白蛋白、血紅蛋白均明顯低于低表達組(P<0.05)，兩組年齡、性別、免疫分型、血小板計數(shù)、血清鈣、乳酸脫氫酶比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

2.5不同PLR、血清miRNA-181a表達水平患者生存時間比較 截至2020年12月31日，129例患者中位OS為26(2～65)個月，中位PFS為12(1～54)個月。其中高PLR組中位OS為23(2～61)個月，中位PFS為11(1～51)個月；低PLR組中位OS為27(4～65)個月，中位PFS為12(2～54)個月；經(jīng)Kaplan-Meier分析顯示，高PLR組與低PLR組中位OS、中位PFS比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.074，0.262)。miRNA-181a高表達組中位OS為21(2～52)個月，中位PFS為10(1～49)個月；低表達組中位OS為29(5～65)個月，中位PFS為12(2～54)個月；經(jīng)Kaplan-Meier分析顯示，高表達組中位OS明顯低于低表達組(P=0.021)，但高表達組與低表達組中位PFS比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.082)。

表3 PLR值與臨床病理關(guān)系

表4 血清miRNA-181a表達與臨床病理關(guān)系

3 討 論

MM占血液系統(tǒng)惡性腫瘤比例超過10%，且近些年來，隨著臨床對MM檢測及認識進展，老年MM發(fā)病人數(shù)呈逐年上升趨勢，盡管目前相關(guān)新藥研究取得一定進展，但受老年患者身體功能影響，不少新藥應(yīng)用并未在老年人群中顯示生存獲益〔7〕。MM發(fā)病機制復(fù)雜且有異質(zhì)性，目前關(guān)于其病理機制研究主要集中于細胞遺傳學(xué)和骨髓微環(huán)境分析，其中炎癥和免疫作為骨髓微環(huán)境基本特點也是臨床關(guān)注重點〔8〕。

PLR值是臨床評價炎癥與免疫狀態(tài)的常用指標，目前被認為與多種惡性腫瘤發(fā)展和預(yù)后相關(guān)〔9〕。本研究顯示，MM組PLR值較對照組明顯升高，這與崔壯壯等〔10〕報道一致。本文提示PLR值升高可能與MM發(fā)生相關(guān)。分析原因，PLR值升高，無非與血小板數(shù)量過度增加或淋巴細胞計數(shù)明顯下降有關(guān)。一方面，血小板作為血細胞重要成分，在正常情況下主要參與機體凝血、止血，但在病理狀態(tài)下，可釋放轉(zhuǎn)化生長因子、血管內(nèi)皮細胞因子等活性因子，參與炎性反應(yīng)，誘導(dǎo)腫瘤細胞增殖、血管生成，為腫瘤生長、轉(zhuǎn)移創(chuàng)造有利條件；而MM腫瘤細胞也能通過釋放大量細胞因子，刺激骨髓巨核細胞向血小板分化、誘導(dǎo)血小板聚集，二者相互作用使得病情進一步發(fā)展〔11〕。另一方面，淋巴細胞數(shù)量及功能與機體免疫狀態(tài)息息相關(guān)，可通過直接細胞毒作用、抑制血管生成等作用產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)，但受各種因素影響引起機體免疫狀態(tài)改變時，淋巴細胞可隨之出現(xiàn)數(shù)量或功能變化；而且MM腫瘤細胞本身及其細胞因子也可對機體正常免疫功能產(chǎn)生抑制，使得淋巴細胞數(shù)量及亞群出現(xiàn)改變，機體抗腫瘤效應(yīng)減弱，導(dǎo)致腫瘤進一步發(fā)展，因此淋巴細胞計數(shù)也影響著MM預(yù)后，這也是免疫調(diào)節(jié)劑在抗MM治療中往往能發(fā)揮良好作用的原因〔12〕。故MM患者可表現(xiàn)出PLR值升高。本研究提示雖然MM患者可表現(xiàn)出PLR值升高，但PLR值升高并不是導(dǎo)致患者病情進展或發(fā)生腎損傷、貧血、高鈣血癥等病理變化的決定性因素。本研究提示，PLR值對MM患者預(yù)后影響并不明顯，但既往有研究認為〔13〕，高PLR可能意味著初診MM患者較短的生存時間，與本研究有一定差異，可能與研究樣本量、治療方案等差異有關(guān)，而且PLR作為一個動態(tài)指標，本身受多種因素影響，后期可擴大樣本量、采用多中心研究進一步評估PLR對MM預(yù)后影響。

近些年來，循環(huán)miRNA與惡性腫瘤的發(fā)生及預(yù)后的研究越來越多，研究認為〔14〕，miRNA可通過介導(dǎo)細胞因子表達、影響細胞周期信號通路等途徑參與腫瘤細胞調(diào)控，有促進腫瘤細胞凋亡或增殖的作用。miRNA-181是一個家族系列miRNA，主要在人類1、9、19號3個獨立染色體上編碼，可通過與靶目標mRNA的3′-UTR堿基互補結(jié)合來降低互補mRNA穩(wěn)定性或抑制其翻譯功能，從而調(diào)控相關(guān)基因表達，參與各種生理、病理過程〔15〕。miRNA-181a作為miRNA-181家族重要成員之一，被認為與造血功能相關(guān)，研究顯示〔16〕，miRNA-181a在急性白血病中呈高表達，且與患者預(yù)后關(guān)聯(lián)密切。本研究提示血清miRNA-181a高表達可能參與MM發(fā)生，且對MM有一定診斷價值。不過目前關(guān)于miRNA-181a表達影響MM發(fā)生的機制并不明確，有研究認為〔17〕，miRNA-181a可能通過抑制凋亡蛋白表達，使得腫瘤細胞抗凋亡作用增強，利于腫瘤發(fā)展；還有文獻顯示〔18〕，miRNA-181a的靶基因P300/CBP相關(guān)因子在多數(shù)MM細胞株中表達明顯缺損，且伴隨著miRNA-181a高表達，MM細胞凋亡率也下降，認為miRNA-181a可能是MM致癌因子之一。ISS分期、D-S分期是目前臨床評價MM病情的常見分期方式，可用于患者生存期評估；血清白蛋白、血紅蛋白、肌酐、β2-微球蛋白等指標與患者貧血、腎功能損害等病理特征有關(guān)；一般來說，ISS分期、D-S分期越晚，血清白蛋白、血紅蛋白越低，肌酐、β2-微球蛋白越高，提示腫瘤負荷越重，患者預(yù)后也越差〔19〕。本研究說明miRNA-181a與患者病情進展及不良預(yù)后有關(guān)，可能因為miRNA-181a高表達能干擾磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)信號通路而影響腫瘤細胞周期，有利于促進腫瘤細胞增殖與遷移〔20〕；也可能與miRNA-181a高表達誘導(dǎo)腫瘤細胞耐藥性有關(guān)〔21〕；具體機制仍有待研究。本研究提示miRNA-181a高表達可能意味著更短的生存期，這一結(jié)果或許可為后期MM精準預(yù)后評估、miRAN靶向治療奠定基礎(chǔ)，但仍有待大樣本、多中心研究證實。

綜上，老年MM患者外周血PLR值升高、血清miRNA-181a呈高表達，且與部分臨床病理特征有關(guān)，尤其是血清miRNA-181a高表達，可能意味著患者更差的預(yù)后及更短的生存時間，可為患者診療、預(yù)后評估帶來契機。