胡永煜 ， 吳 湜 鄭永貴 楊 洋 郭 燕 胡付品

鮑曼不動桿菌是臨床最常見的導致醫(yī)院感染的病原菌之一。由于該菌天然產(chǎn)生OXA-23型碳青霉烯酶而使其在體外具有較強的水解亞胺培南和美羅培南的活性，并在環(huán)境中具有頑強生命力，因而成為臨床抗感染治療的難題。2018年CHINET中國細菌耐藥監(jiān)測結(jié)果顯示，23 573株不動桿菌屬占所有受監(jiān)測臨床分離菌（244 843株）的9.6%，其中94%是鮑曼不動桿菌，且其對亞胺培南和美羅培南的耐藥率均超過70%[1-2]。碳青酶烯類耐藥鮑曼不動桿菌也顯示對其他抗菌藥物的耐藥性，常發(fā)生多重耐藥（MDR）或廣泛耐藥（XDR），常因無合適抗菌藥物而導致感染后的高死亡率，對臨床抗感染治療形成巨大挑戰(zhàn)[3]。舒巴坦作為對鮑曼不動桿菌具有抗菌活性的β內(nèi)酰胺酶抑制劑，其與第三代頭孢菌素（頭孢哌酮）聯(lián)合是治療鮑曼不動桿菌感染的主要抗菌藥物之一[4]。本研究主要評價頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E、阿米卡星、替加環(huán)素、美羅培南、左氧氟沙星和利福平等6種抗菌藥物聯(lián)合對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的體外藥敏試驗結(jié)果，為治療該菌所致感染提供實驗室參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細菌 取華山醫(yī)院抗生素研究所菌種庫2018年臨床分離的碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌保存菌株100株，無同一患者分離的重復菌株。標本來源為深部痰液69株、血液12株、胸水4株、清潔中段尿3株、膽汁3株、腹水3株、腦脊液2株、肺泡灌洗液3株、創(chuàng)面分泌物1株。細菌鑒定采用VITEK MS全自動微生物質(zhì)譜鑒定系統(tǒng)。藥敏試驗質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922及銅綠假單胞菌ATCC 27853。

1.1.2 抗菌藥物來源和測試濃度 抗菌藥物（包括頭孢哌酮、舒巴坦、美羅培南、阿米卡星、多黏菌素E、替加環(huán)素、利福平、左氧氟沙星）標準品均購自中國食品藥品檢定研究院技術(shù)服務部。藥物測試濃度范圍分別為頭孢哌酮（1～ 2 048 mg/L）、舒巴坦（0.5～1 024 mg/L）、美羅培南（0.125～512 mg/L）、阿米卡星（0.125～512 mg/L）、多黏菌素E（0.03～512 mg/L）、替加環(huán)素（0.125～512 mg/L）、利福平（0.125～512 mg/L）、左氧氟沙星（0.125～512 mg/L）。其中頭孢哌酮-舒巴坦（2∶1）按1∶0.5～2 048∶1 024 mg/L配制。

1.2 方法

1.2.1 棋盤法聯(lián)合藥敏試驗藥敏板制備 將抗菌藥物標準品按實驗設計稱量，并按CLSI M100 第29版中關(guān)于微量稀釋法制備抗菌藥物稀釋所需溶劑和稀釋液要求稀釋抗菌藥物。其中左氧氟沙星用0.1 mol/L NaOH溶解，利福平以甲醇溶解，溶解后繼續(xù)用無菌蒸餾水稀釋至藥敏試驗需要的濃度。頭孢哌酮、舒巴坦、阿米卡星、替加環(huán)素、多黏菌素E均采用無菌蒸餾水溶解。按棋盤法設計原理和CLSI M07第11版中肉湯微量稀釋法操作要求，將配制好的不同測試濃度的抗菌藥物加入96孔微量板中。

1.2.2 接種菌液制備和菌液接種 從新鮮過夜培養(yǎng)純分的受試菌平板上直接采用菌落懸浮法配置0.5麥氏濁度菌懸液，然后以雙倍CAMHB肉湯稀釋100倍，此為藥敏試驗接種菌懸液（1×106CFU/mL）。于棋盤法聯(lián)合藥敏試驗微量板以每孔50 μL接種菌懸液加入含藥藥敏板中，最終接種菌量為5×105CFU/mL。（35±2） ℃孵育18～20 h后讀取 結(jié)果。

1.2.3 棋盤法藥敏結(jié)果的讀取 按2019年版CLSI文件要求，讀取和記錄單藥及兩藥聯(lián)合后的最低抑菌濃度（MIC），并計算部分抑菌濃度指數(shù) （FIC)[5-7]。

1.2.4 FIC計算和意義 FIC = 聯(lián)合后甲藥MIC/聯(lián)合前甲藥MIC + 聯(lián)合后乙藥MIC/聯(lián)合前乙藥MIC。FIC≤0.5為兩藥存在協(xié)同作用，0.5＜FIC≤1為兩藥存在相加作用，l＜FIC≤2為兩藥無相關(guān)作用，F(xiàn)IC＞2為兩藥有拮抗作用[4]。對于出現(xiàn)協(xié)同或相加的聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果，均重復2次試驗，取2次相同的結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的敏感性

藥敏試驗結(jié)果顯示，頭孢哌酮-舒巴坦（2∶1)對100株碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌的MIC值范圍為16～256 mg/L，美羅培南、阿米卡星、利福平、左氧氟沙星、多黏菌素E和替加環(huán)素的MIC范圍分別為16～256 mg/L、0.5～256 mg/L、4～16 mg/L、0.25～64 mg/L、≤0.06～1 mg/L和0.125～8 mg/L。根據(jù)CLSI推薦的MIC折點和解釋[8]，所有菌株均對美羅培南100%耐藥，對阿米卡星、左氧氟沙星、替加環(huán)素和多黏菌素E的耐藥率分別為83%、76%、2%和0；所有菌株均對多黏菌素E敏感，92%的鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素敏感。見表1。

2.2 頭孢哌酮-舒巴坦與其他抗菌藥物聯(lián)合的體外抗菌活性

頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E聯(lián)合后對44%和53%菌株呈協(xié)同和相加作用，僅對3%菌株呈無關(guān)作用。在頭孢哌酮-舒巴坦與美羅培南的聯(lián)合中21% 的菌株呈現(xiàn)協(xié)同作用，呈相加作用和無關(guān)作用的菌株分別為72%和7%。頭孢哌酮-舒巴坦與替加環(huán)素、利福平、左氧氟沙星和阿米卡星聯(lián)合時呈相加作用的菌株分別為49%、65%、68%和75%，均高于呈協(xié)同作用的菌株（分別為4%、13%、5%和8%）。47%的菌株對頭孢哌酮-舒巴坦與替加環(huán)素聯(lián)合呈無關(guān)作用，是所有聯(lián)合抗菌藥物中最多的。頭孢哌酮-舒巴坦與所有6種抗菌藥物聯(lián)合均未發(fā)現(xiàn)拮抗現(xiàn)象。見表2。

表2 頭孢哌酮-舒巴坦體外聯(lián)合抗菌藥物對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌藥敏試驗協(xié)同結(jié)果Table 2 Antimicrobial synergy testing of cefoperazone-sulbactam in combination with other antimicrobial agents against carbapenem-resistant A. baumannii

頭孢哌酮-舒巴坦（2∶1）與多黏菌素E等6種抗菌藥物聯(lián)合藥敏試驗結(jié)果顯示，除替加環(huán)素外的抗菌藥物聯(lián)合對受試菌株的MIC值均較各個單藥的MIC值低，例如，頭孢哌酮-舒巴坦對100株細菌的單藥MIC值的范圍為16～256 mg/L，MIC90值為256 mg/L，頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E聯(lián)合后的MIC值范圍和MIC90值，分別為2～128 mg/L和64 mg/L ；多黏菌素E單藥的MIC值范圍為≤0.06～1 mg/L，MIC90值為0.5 mg/L， 與頭孢哌酮-舒巴坦聯(lián)合后MIC值的范圍和MIC90值分別為0.015～0.25 mg/L和0.125 mg/L；兩藥聯(lián)合后的MIC90值均下降為原來的1/4。頭孢哌酮-舒巴坦與其他抗菌藥物聯(lián)合的效果有同樣趨勢。見表2。

3 討論

對于碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌感染患者，人們常將多黏菌素E、碳青霉烯類藥物、替加環(huán)素、氨基糖苷類藥物和氟喹諾酮類藥物單獨使用，或?qū)⑵渑c頭孢哌酮-舒巴坦或其他抗菌藥物聯(lián)合使用來進行治療[9-12]。在中國，頭孢哌酮-舒巴坦是一種常用的β內(nèi)酰胺酶抑制劑復方制劑。相關(guān)研究顯示，舒巴坦能夠通過與鮑曼不動桿菌青霉素結(jié)合蛋白PBP2結(jié)合，發(fā)揮其抗不動桿菌的活性[13]。 研究還表明，頭孢哌酮-舒巴坦對鮑曼不動桿菌具有良好抗菌活性，并可與替加環(huán)素、米諾環(huán)素、碳青霉烯類抗生素、氨基糖苷類抗生素等聯(lián)合使用[14-15]。

本組資料顯示，頭孢哌酮-舒巴坦聯(lián)合多黏菌素E、美羅培南等6種抗菌藥物對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌均有良好的體外協(xié)同和相加等抗菌作用。其中以與多黏菌素E聯(lián)合最為顯著。該兩藥聯(lián)合呈現(xiàn)協(xié)同和相加作用的菌株共97%，呈無關(guān)作用的菌株僅3%。其次為頭孢哌酮-舒巴坦與美羅培南聯(lián)合，雖然呈協(xié)同作用的菌株僅為21%，但有72%的菌株呈相加作用，呈無關(guān)作用的菌株僅7%。頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E或美羅培南的聯(lián)合均顯示，聯(lián)合后MIC90值僅為單藥時MIC90值的1/4，提示頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E或美羅培南的聯(lián)合可使藥物抗菌活性增加4倍，此結(jié)果與Karaoglan等[16]和Kiratisin等[6]的研究結(jié)果一致。頭孢哌酮-舒巴坦與阿米卡星、利福平、左氧氟沙星和替加環(huán)素等其他4種藥的聯(lián)合也均有類似抗菌活性增強的趨勢。雖然頭孢哌酮-舒巴坦與替加環(huán)素聯(lián)合具有協(xié)同作用的菌株僅4%，但49%的菌株具有相加作用，另有47%的菌株呈現(xiàn)無關(guān)作用。此外，頭孢哌酮-舒巴坦與6種抗菌藥物聯(lián)合均未有拮抗現(xiàn)象發(fā)生，此結(jié)果為臨床選擇合適的抗鮑曼不動桿菌感染的治療方案提供了重要實驗室參考依據(jù)。

本研究采用肉湯微量稀釋棋盤法進行頭孢哌酮-舒巴坦聯(lián)合6種抗菌藥物的聯(lián)合藥敏試驗，此方法設計的原理和基礎是CLSI M07文件中肉湯微量稀釋法。在抗菌藥物微量板制板操作時需注意以下關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①因是抗菌藥物的“聯(lián)合”藥敏試驗，故聯(lián)合受試的抗菌藥物工作液的濃度均應為“雙倍”；②抗菌藥物單藥和聯(lián)合工作區(qū)均應包含在同一塊微量板上；③因是“棋盤法”藥敏試驗，微孔板內(nèi)抗菌藥物聯(lián)合工作區(qū)必須保證涉及的2種抗菌藥物測試濃度均應嚴格一一配對，不能發(fā)生缺失和錯誤；④必須留有受試菌的生長對照孔，其他均嚴格遵守了 CLSI M07中關(guān)于肉湯稀釋法的要求。通過此法既可以了解抗菌藥物單藥的MIC值，又可以了解抗菌藥物聯(lián)合后的MIC值。通過計算最終還可以了解兩藥的聯(lián)合指數(shù)FIC，以及預測兩藥聯(lián)合可能發(fā)生的“協(xié)同” “相加” “無關(guān)” “拮抗”作用，報告臨床，達到合理選藥治療。此法操作雖較為繁瑣，但在目前耐藥菌感染肆虐又無合適抗菌藥物可用的情況下，仍不失為支持抗菌藥物合理用藥的藥敏試驗方法，建議臨床微生物室考慮增設。

綜上所述，頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E、美羅培南或替加環(huán)素等6種抗菌藥物聯(lián)合，其體外協(xié)同抗菌活性對碳青霉烯類耐藥鮑曼不動桿菌感染的抗菌治療具有重要臨床價值。本研究顯示的頭孢哌酮-舒巴坦與多黏菌素E等6種抗菌藥物的聯(lián)合作用還需進一步采用時間-殺菌曲線等方法，來動態(tài)監(jiān)測和觀察這種“協(xié)同”和 “相加”作用，以幫助臨床合理選用抗菌藥物。