黃曉嵐， 劉笑芬， 王 雨， 范亞新， 毋海蘭， 郭蓓寧， 張 菁

多黏菌素是擬芽孢桿菌屬通過(guò)非核糖體酶合成的一種多肽類抗菌藥物，20世紀(jì)50年代開(kāi)始應(yīng)用于臨床，由于其明顯的腎毒性和神經(jīng)毒性于20世紀(jì)70年代被禁用[1-2]。該藥主要通過(guò)與革蘭陰性菌細(xì)胞膜脂多糖中帶負(fù)電荷的磷酸基結(jié)合，改變細(xì)胞膜通透性而發(fā)揮抗菌作用[3]。由于耐藥菌檢出逐年增加，以及缺乏新型有效的抗菌藥物，多黏菌素成為臨床治療廣泛耐藥革蘭陰性桿菌（如肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌及鮑曼不動(dòng)桿菌）的重要藥物之一[4]。

目前，已上市的多黏菌素類藥物包括硫酸多黏菌素B、多黏菌素E甲磺酸鹽（CMS）及硫酸多黏菌素E。CMS是前藥，須在體內(nèi)經(jīng)水解轉(zhuǎn)化為多黏菌素E才具有抗菌活性，但轉(zhuǎn)化后的多黏菌素E在體內(nèi)濃度較低。為此，上海上藥新亞藥業(yè)有限公司自主研發(fā)了硫酸多黏菌素E，該產(chǎn)品為含30余種組分的混合物，其中主要成分為多黏菌素E1和多黏菌素E2[5]。然而硫酸多黏菌素E缺乏足夠的藥動(dòng)學(xué)數(shù)據(jù)，因此迫切需要一種快速、準(zhǔn)確的多黏菌素E濃度測(cè)定方法，為臨床合理應(yīng)用提供依據(jù)。

現(xiàn)有的多黏菌素E在生物樣本中的分析方法包括微生物分析法、免疫學(xué)分析法及高效液相色譜（HPLC）法。微生物法耗時(shí)且缺乏特異性，另由于多黏菌素E對(duì)紫外光吸收能力較差，缺乏天然熒光，因此用HPLC法測(cè)定存在檢測(cè)限無(wú)法達(dá)到臨床要求的問(wèn)題[6]。近年來(lái)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法被廣泛用于生物樣品的藥物濃度測(cè)定。張莉婷等[7]采用蛋白沉淀法對(duì)人血漿中多黏菌素E總濃度進(jìn)行測(cè)定，簡(jiǎn)化了血漿預(yù)處理過(guò)程，然而蛋白沉淀法易受基質(zhì)效應(yīng)干擾；Gobin 等[8]采用固相萃取法，縮短了分析時(shí)間，但未對(duì)基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行必要驗(yàn)證；Dotsikas等[9]建立了一種全自動(dòng)96孔固相萃取法，縮短了運(yùn)行時(shí)間，降低了操作錯(cuò)誤可能性；Zhao等[5]改進(jìn)了固相萃取法，可同時(shí)測(cè)定人血漿中多黏菌素E1、E2及CMS濃度，但萃取過(guò)程中洗脫步驟較繁瑣。

本研究擬開(kāi)發(fā)一種快速、簡(jiǎn)便、靈敏度及準(zhǔn)確度高的LC-MS/MS法，同時(shí)測(cè)定人血漿中多黏菌素E1和E2的濃度，采用固相萃取法，簡(jiǎn)化洗脫步驟，提高檢測(cè)定量下限，并通過(guò)方法驗(yàn)證確定分析方法的可靠性，再應(yīng)用于多黏菌素E的臨床藥動(dòng)學(xué)研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 Waters UPLC超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters公司），API4000QTRAP質(zhì)譜儀（美國(guó)AB SCIEX公司），MettlerTodelo XS 205電子分析天平（瑞士梅特勒公司），Thermo Forma 900低溫冰箱（-70℃）（美國(guó)Thermo 公司），Positive Pressure-96正壓固相萃取裝置（美國(guó)Waters公司），96孔固相萃取小柱（30 mg，美國(guó)Waters 公司）。

1.1.2 藥品 多黏菌素E（標(biāo)準(zhǔn)品：多黏菌素E1純度27.9%，多黏菌素E2純度46.8%，批號(hào)LN201812001-20190806），保 存 于（-20±5）℃冰箱中；多黏菌素B1（內(nèi)標(biāo)，純度96.2%，批號(hào)200421-1），保存于2～8 ℃冰箱中。上述藥品均由上海上藥新亞藥業(yè)有限公司提供。

1.1.3 試劑 甲醇（HPLC級(jí)）、乙腈（HPLC級(jí)）、氨水（化學(xué)純）、甲酸（分析純），以上試劑均購(gòu)于Sigma-Aldrich公司，超純水（HPLC級(jí)，Millipore超純水系統(tǒng)）?？瞻籽獫{來(lái)源于復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院Ⅰ期臨床研究中心6名健康受試者（經(jīng)過(guò)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)），血漿均采集于EDTA-K2管中，離心后保存于-40℃冰箱。

1.2 方法

1.2.1 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱為Phonomenex Kinetex XB-C18柱（100 mm×2.1 mm I.D.，2.6 μm）；流動(dòng)相為0.1% 甲酸溶液∶乙腈-甲醇（體積比1∶1）梯度洗脫；流速0.4 mL/min；柱溫30.0℃；分析時(shí)間3.5 min；進(jìn)樣體積3.0 μL。

采用電噴霧電離源（ESI 源），正離子多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）掃描模式，噴霧電壓5.5 kV，離子源溫度550℃，氣簾氣25 psi（1 psi=6.895 kPa），Gas1（氮?dú)猓?0 psi，Gas2（氮?dú)猓?0 psi，多黏菌素E1、E2、B1（內(nèi)標(biāo)）的母離子/子離子分別為：m/z 390.7→101.3、m/z 386.0→101.2、m/z 402.3→101.2，去簇電壓分別為63 V、61 V和59 V，碰撞能量分別為28 V、27 V和28 V。

1.2.2 血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線、質(zhì)控樣品的配制 精密稱取多黏菌素E標(biāo)準(zhǔn)品配制貯備液，用20%乙腈稀釋貯備液，配制一系列多黏菌素E的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作溶液（含多黏菌素E1濃度范圍為0.279～55.8 mg/L，多黏菌素E2濃度范圍為0.468～93.6 mg/L），低、中、高質(zhì)控工作溶液（含多黏菌素E1濃度分別為0.837 mg/L、4.46 mg/L、44.6 mg/L；多黏菌素E2濃度分別為1.40 mg/L、7.49 mg/L、74.9 mg/L）。

取上述系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線及質(zhì)控工作溶液各50 μL，分別加入空白血漿950 μL，配制為血漿中質(zhì)量濃度分別為0.014 0 mg/L、0.027 9 mg/L、0.069 8 mg/L、0.140 mg/L、0.279 mg/L、0.698 mg/L、1.40 mg/L、2.79 mg/L的多黏菌素E1標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和血漿中質(zhì)量濃度分別為0.023 4 mg/L、0.046 8 mg/L、0.117 mg/L、0.234 mg/L、0.468 mg/L、1.17 mg/L、2.34 mg/L、4.68 mg/L的 多 黏菌素E2標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，以及血漿中質(zhì)量濃度分別為0.041 9 mg/L、0.223 mg/L、2.23 mg/L的多黏菌素E1質(zhì)控樣品和質(zhì)量濃度分別為0.070 2 mg/L、0.374 mg/L、3.74 mg/L的多黏菌素E2質(zhì)控樣品。

1.2.3 內(nèi)標(biāo)工作液的配制 精密稱取多黏菌素B1標(biāo)準(zhǔn)品配制內(nèi)標(biāo)貯備液，用20%乙腈稀釋貯備液，配制濃度為8 mg/L的多黏菌素B1內(nèi)標(biāo)工作溶液。

1.2.4 血漿樣品處理方法 精密吸取200 μL血漿樣品加入50 μL內(nèi)標(biāo)工作溶液，加入5%氨水200 μL，渦旋混勻。吸取400 μL混合液加至預(yù)先使用1 mL甲醇和1 mL超純水活化的固相萃取板中，上樣后依次使用1 mL超純水和1 mL甲醇溶液洗凈小柱，300 μL的6%甲酸-30%乙腈水溶液洗脫，混勻后洗脫液3 μL進(jìn)樣LC-MS/MS分析。

1.2.5 方法學(xué)驗(yàn)證 分別測(cè)定來(lái)自6個(gè)不同健康受試者的空白血漿進(jìn)行選擇性考察。按前述方法制得濃度分別為0.014 0～2.79 mg/L的多黏菌素E1和濃度分別為0.023 4～4.68 mg/L的多黏菌素E2標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)行測(cè)定，以多黏菌素E1或E2與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)，多黏菌素E1或E2的濃度為橫坐標(biāo)，采用1/x2加權(quán)的線性回歸擬合。另制備多黏菌素E血漿基質(zhì)定量下限，及低、中、高濃度的質(zhì)控樣品，至少3個(gè)分析批（至少2 d配制），每個(gè)濃度至少預(yù)處理5份后進(jìn)樣，計(jì)算批內(nèi)（n=6）、批間（n=18）精密度和批間準(zhǔn)確度偏倚（%），精密度用變異系數(shù)（CV/%）表示。

在低、中、高質(zhì)控濃度下考察不同個(gè)體空白基質(zhì)對(duì)待測(cè)物及內(nèi)標(biāo)質(zhì)譜信號(hào)的影響，人血漿方法學(xué)驗(yàn)證同時(shí)考察正常血漿、溶血血漿、脂血血漿的基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)歸一化的基質(zhì)效應(yīng)因子=待測(cè)物面積比/內(nèi)標(biāo)面積比×100%，其中面積比=空白基質(zhì)加入含藥緩沖液峰面積/含藥緩沖液溶液峰面積均值。另用混合空白血漿配制的低、中、高濃度質(zhì)控樣品經(jīng)預(yù)處理后進(jìn)樣（6份），同時(shí)配制空白血漿處理后添加含藥溶液樣品（6份），計(jì)算提取回收率。提取回收率=質(zhì)控樣品處理后待測(cè)物的面積/混合空白基質(zhì)處理后加含藥溶液面積平均值×100% 。本研究考察了血漿樣品在 -20℃和-70℃冰箱存放71 d、反復(fù)凍融3次、樣品預(yù)處理前室溫放置18 h及制備后樣品于4℃放置48 h的穩(wěn)定性。

1.2.6 受試者給藥、采血方案 經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，開(kāi)展單中心開(kāi)放試驗(yàn)進(jìn)行受試者靜脈輸注硫酸多黏菌素E的藥動(dòng)學(xué)研究。在試驗(yàn)前簽署知情同意書(shū)，告知受試者試驗(yàn)?zāi)康?、藥物特性及可能出現(xiàn)的藥物不良反應(yīng)等。對(duì)所有受試者進(jìn)行體格檢查，生命體征、心電圖及實(shí)驗(yàn)室檢查。試驗(yàn)藥物為注射用硫酸黏菌素（批號(hào)：200302， 50萬(wàn)IU/瓶，上海上藥新亞藥業(yè)有限公司），給藥劑量為1 萬(wàn)IU/kg（即0.452 mg/kg）， 靜脈滴注時(shí)間為2 h。留取受試者于給藥前 （0 h）和給藥后0.5 h、1 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、14 h、18 h、26 h、38 h、50 h的 靜 脈 血 4 mL，置于EDTA-K2管中，離心分離出血漿并保存于（-70±10）℃冰箱。采用已建立的LC-MS/MS法測(cè)定受試者血漿樣品中多黏菌素E1、E2的濃度。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)驗(yàn)證

選擇性考察結(jié)果顯示，血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)在多黏菌素E1、E2、內(nèi)標(biāo)出峰位置均不存在干擾峰，不影響其分離測(cè)定。血漿中多黏菌素E1、E2、內(nèi)標(biāo)的保留時(shí)間分別為1.70 min、1.44 min、1.96 min。典型色譜圖見(jiàn)圖1。多黏菌素E1和E2的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為y＝1.108 2x-0.000 6（R2=0.997 3），y＝1.204 4x+0.001 3（R2=0.997 7）。多黏菌素E1濃度于0.014 0～2.79 mg/L線性關(guān)系良好，定量下限為0.014 0 mg/L；多黏菌素E2濃度在0.023 4～4.68 mg/L線性關(guān)系良好，定量下限為0.023 4 mg/L。

多黏菌素E1批內(nèi)和批間精密度分別為2.7%～10.2%和2.5%～9.0%，批間準(zhǔn)確度偏差為 -4.5%～2.2%；多黏菌素E2批內(nèi)和批間精密度分別為2.8%～7.5%和2.9%～5.3%，批間準(zhǔn)確度偏差在-4.8%～4.3%。均符合生物樣品測(cè)定要求，見(jiàn)表1。

表1 血漿中多黏菌素E1、E2的批間及批內(nèi)精密度和準(zhǔn)確度偏倚結(jié)果Table 1 Assay precision and accuracy of polymyxin E1 and polymyxin E2 in human plasma（%）

多黏菌素E1在正常血漿、溶血血漿及脂血血漿中的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子為94.8%～102.3%，提取回收率為26.1%～29.4%；多黏菌素E2在正常血漿、溶血血漿及脂血血漿中的內(nèi)標(biāo)歸一化基質(zhì)效應(yīng)因子為93.1%～100.1%，提取回收率為29.2%～33.0%?；|(zhì)效應(yīng)和提取回收率平均值見(jiàn)表2。

表2 多黏菌素E1、E2基質(zhì)效應(yīng)與提取回收率Table 2 Matrix effects and recovery of polymyxin E1 and polymyxin E2 （%）

穩(wěn)定性考察結(jié)果見(jiàn)表3，測(cè)定準(zhǔn)確度分別為87.5%～101.4%（多黏菌素E1）和90.4%～103.9%（多黏菌素E2），表明多黏菌素E1、E2血漿樣品在 -20℃冰箱存放3 d、-70℃冰箱長(zhǎng)期存放71 d、反復(fù)凍融3次、樣品預(yù)處理前室溫放置18 h及制備后樣品4℃放置48 h均能保持穩(wěn)定。本研究中存放71 d的穩(wěn)定性驗(yàn)證可覆蓋臨床標(biāo)本實(shí)際存放時(shí)間。

表3 血漿中多黏菌素E1、E2穩(wěn)定性考察Table 3 Stability of polymyxin E1 and polymyxin E2 in human plasma（%）

2.2 多黏菌素E藥動(dòng)學(xué)研究

測(cè)定結(jié)果顯示，本研究建立的方法可用于健康受試者體內(nèi)多黏菌素E1、E2的血藥濃度測(cè)定。6名健康受試者接受單劑靜脈輸注多黏菌素E1、E2的平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2，在靜脈輸注開(kāi)始后2 h即可達(dá)到峰濃度。多黏菌素E1血藥峰濃度為0.428 mg/L，多黏菌素E2血藥峰濃度為0.676mg/L。

3 討論

與其他方法相比，本研究建立的LC-MS/MS法的優(yōu)勢(shì)在于提高了檢測(cè)定量下限，縮短了分析時(shí)間，能夠準(zhǔn)確測(cè)定人血漿中多黏菌素E1及多黏菌素E2的濃度，可為多黏菌素E的臨床藥動(dòng)學(xué)血漿樣品檢測(cè)提供可靠方法。該檢測(cè)方法具有靈敏度高、分析時(shí)間短、進(jìn)樣量少、選擇性強(qiáng)等特點(diǎn)，對(duì)基質(zhì)效應(yīng)及提取回收率考察結(jié)果顯示，回收率雖偏低但不同濃度間回收率一致，精密度及準(zhǔn)確度均符合標(biāo)準(zhǔn)，故不影響測(cè)定。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果滿足藥動(dòng)學(xué)研究原則中有關(guān)生物樣品分析的要求[10-13]。 在后續(xù)實(shí)際樣品檢測(cè)中，所有批次質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)均 合格。

常用的生物樣品前處理方法一般包括蛋白沉淀、液液萃取、固相萃取等。本研究采用固相萃取法，與既往文獻(xiàn)報(bào)道的方法相比，能更有效地分離待測(cè)物與干擾組分，降低樣品基質(zhì)干擾，提高檢測(cè)靈敏度。一般在流動(dòng)相選擇上，乙腈作流動(dòng)相的峰形較好，甲醇可提高質(zhì)譜響應(yīng)，甲酸有助于色譜改善峰形。由于難以獲得多黏菌素E的同核素內(nèi)標(biāo)，本研究中選擇結(jié)構(gòu)類似物多黏菌素B1作為內(nèi)標(biāo)。經(jīng)考察，該方法操作簡(jiǎn)單，精密度與準(zhǔn)確度良好，適用于多黏菌素E的臨床藥動(dòng)學(xué)研究。