封彬彬， 董 蕓， 林美英， 周洪順， 李 銘， 邱麗華

結(jié)核性腦膜炎（TBM）是由結(jié)核分枝桿菌引起最嚴(yán)重的肺外結(jié)核病，占所有肺外結(jié)核病的5%～10%，致殘率、致死率高[1]，即使給予抗結(jié)核藥物治療，死亡率仍可高達(dá)10.0%～36.5%[2]。早期診斷靈敏度和特異度較高的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法對(duì)TBM患者改善預(yù)后具有重要意義。結(jié)核感染T細(xì)胞斑點(diǎn)試驗(yàn)（T-SPOT.TB）技術(shù)是基于抗原特異性細(xì)胞免疫應(yīng)答反應(yīng)檢測(cè)技術(shù)，對(duì)診斷結(jié)核感染的靈敏度及特異度均很高。腺苷脫氨酶 （ADA）是嘌呤代謝中與機(jī)體細(xì)胞免疫活性有關(guān)的重要酶類(lèi)，結(jié)核分枝桿菌感染后，可引發(fā)機(jī)體免疫功能紊亂，釋放ADA，檢測(cè)周期短、費(fèi)用低。利福平耐藥實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)（GeneXpert MTB/RIF）是可用于結(jié)核病診斷且為WHO認(rèn)證的新方法[3]，GeneXpert MTB/RIF既可以對(duì)有無(wú)結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以對(duì)其有無(wú)利福平耐藥基因突變進(jìn)行判定，檢測(cè)只需2 h。本文回顧性對(duì)原山東省胸科醫(yī)院收治的105例腦膜炎患者的以上三種快速實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行研究，探究其在結(jié)核性腦膜炎早期診斷中的價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 資料來(lái)源

選取2018年4月1日—2020年12月31日收治的確診TBM組患者47例，其中僅腦脊液Xpert MTB/RIF檢測(cè)陽(yáng)性患者13例、僅腦脊液分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性17例、兩者均陽(yáng)性17例；非TBM組患者58例，其中病毒性腦膜炎46例、化膿性腦膜炎8例、隱球菌腦膜炎3例、諾卡菌腦膜炎1例。對(duì)兩組外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液Xpert MTB/RIF檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析。

診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]：有任何腦膜炎的癥狀或體征或腦影像學(xué)異常，且腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性經(jīng)鑒定確定為結(jié)核分枝桿菌或腦脊液抗酸桿菌涂片陽(yáng)性經(jīng)鑒定確定為結(jié)核分枝桿菌或腦脊液結(jié)核分枝桿菌核酸擴(kuò)增試驗(yàn)陽(yáng)性。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①腦脊液檢查陰性；②影像學(xué)表現(xiàn)為顱內(nèi)占位性病變、腦外傷等非感染性病變。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 T-SPOT.TB檢測(cè)方法 收集患者靜脈血4～6 mL，肝素/肝素鈉抗凝，離心得到外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），洗滌后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。PBMC和結(jié)核特異抗原同時(shí)加入預(yù)包被抗體的反應(yīng)孔中，37℃，5% CO2孵育過(guò)夜。效應(yīng)T淋巴細(xì)胞釋放細(xì)胞因子，與預(yù)包被的抗體結(jié)合。洗板，加入二抗，孵育1 h。洗板，加入底物顯色液孵育7 min。蒸餾水終止反應(yīng)。一個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。陽(yáng)性結(jié)果參照標(biāo)準(zhǔn)：①陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè)，且抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)-陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6。②陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為6～10個(gè)，且抗原A或抗原B孔的斑點(diǎn)數(shù)≥2×陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。如果上述標(biāo)準(zhǔn)不符合且陽(yáng)性對(duì)照孔正常時(shí)檢測(cè)結(jié)果為“陰性”。

1.2.2 腦脊液ADA檢測(cè) 取腦脊液標(biāo)本1～2 mL， 以3 000～3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心10～15 min，取上清液檢測(cè)ADA。儀器采用西門(mén)子全自動(dòng)分析儀ADVIA 2400，標(biāo)本采用過(guò)氧化物酶法進(jìn)行分析。腦脊液ADA的正常值為0～8 U/L。

1.2.3 Xpert MTB/RIF 取1.5～2 mL的腦脊液直接加入到Xpert試劑盒（美國(guó)賽沛公司）中，插入Xpert-MTB/RIF檢測(cè)平臺(tái)中。輸入樣本相關(guān)信息后，儀器自動(dòng)過(guò)濾洗滌樣本，超聲溶菌釋放DNA并與PCR反應(yīng)試劑混合，半巢式實(shí)時(shí)擴(kuò)增檢測(cè)熒光信號(hào)，2 h后儀器自動(dòng)給出檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 定義 三種方法聯(lián)合檢測(cè)是三種檢測(cè)方法中任意一種陽(yáng)性則判斷為陽(yáng)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用Excel 2016和SPSS 19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，使用Koimogorov-Smirnov test檢驗(yàn)變量是否服從正態(tài)分布。正態(tài)分布的計(jì)量資料采用x±s表示。非正態(tài)分布的計(jì)量資料用中位數(shù)（四分位數(shù)）[median（P25，P75）]表示。兩組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布的連續(xù)變量采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的樣本采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)，以受試者工作特征（ROC）曲線及曲線下面積（AUC）來(lái)分析不同試驗(yàn)方法的診斷價(jià)值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 TBM與非TBM患者基本資料比較

確診為T(mén)BM患者47例，男24例，女23例，年齡17～74歲，平均（41.1±16.2）歲；非TBM患者58例，男34例，女24例，年齡15～81歲，平均（45.9±19.7）歲；兩組患者性別、年齡比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TBM組腦脊液蛋白高于非TBM組，氯化物和糖低于非TBM組（P＜ 0.05）；腦脊液白細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 TBM組與非TBM組腦脊液檢查結(jié)果比較Table 1 Cerebrospinal fluid test results of tuberculous meningitis versus non-tuberculous meningitis

2.2 檢測(cè)結(jié)果

外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液Xpert MTB/RIF檢測(cè)及三種方法聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性腦膜炎的陽(yáng)性結(jié)果，在TBM組與非TBM組的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液Xpert MTB/RIF及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)結(jié)核性腦膜炎的陽(yáng)性結(jié)果Table 2 Positive rate of peripheral blood T-SPOT.TB, CSF-ADA, CSF Xpert MTB/RIF and combined tests in CSF in detecting tuberculous meningitis

外周血T-SPOT.TB的靈敏度、準(zhǔn)確度分別為91.5%（43/47）、88.6%（93/105）高 于 腦 脊液ADA的21.3%（10/47）、61.9%（65/105）和腦脊液Xpert MTB/RIF的63.8%（30/47）、83.8%（88/105），靈敏度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2分別為47.108、10.363，P均＜0.05）。三種方法聯(lián)合檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確度最高，分別為100%（47/47）和90.5%（95/105）。見(jiàn)表3。

表3 外周血T-SPOT.TB、腦脊液-ADA、腦脊液 Xpert MTB/RIF及聯(lián)合檢測(cè)結(jié)果Table 3 Performance of peripheral blood T-SPOT.TB, CSF-ADA, CSF Xpert MTB/RIF, and combined tests in diagnosis of tuberculous meningitis

2.3 三種檢測(cè)結(jié)果ROC曲線分析

外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA和腦脊液Xpert MTB/RIF的ROC曲線的AUC分別是0.888、0.700和0.819。外周血T-SPOT.TB檢測(cè)AUC值最高，為0.888（95%CI：0.819～0.958）。見(jiàn)圖1。

3 討論

TBM是中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染結(jié)核分枝桿菌后引起的非化膿性炎性疾病，常常導(dǎo)致神經(jīng)損害或腦實(shí)質(zhì)損害，易遺留嚴(yán)重的后遺癥，甚至引起死 亡[5]。相關(guān)研究顯示，TBM早期得到確診的病死率不到10%，而晚期確診的病死率可高達(dá)60%[6]。 因此及早診斷、有效治療十分重要。腦脊液結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性或抗酸染色陽(yáng)性為診斷TBM的金標(biāo)準(zhǔn)，但腦脊液結(jié)核分枝桿菌的培養(yǎng)往往耗時(shí)較長(zhǎng)（4～8周），陽(yáng)性率僅在25%左右；抗酸染色其腦脊液檢出率更低,腦脊液中MTB數(shù)量需超過(guò)1 000×103/L方能在鏡下觀察到[7]。對(duì)早期診斷TBM的價(jià)值極其有限。因此，尋找更好的早期診斷方法非常重要。

有研究表明，T-SOPT.TB檢測(cè)在TBM的診斷中具有較高的特異度及靈敏度[8]，可作為早期輔助診斷的一項(xiàng)參考指標(biāo)。T-SPOT.TB是一種酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)法，用于檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原EAST-6和CFP-10釋放γ干擾素特異性T細(xì)胞數(shù)。單細(xì)胞水平的T-SPOT.TB檢測(cè)能及時(shí)捕獲細(xì)胞周?chē)置诘募?xì)胞因子，不受卡介苗接種和機(jī)體免疫狀態(tài)的影響，其靈敏度和特異度均較高[9]。其他輔助診斷如結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)、結(jié)核抗體（TB-Ab）測(cè)定、結(jié)核特異性的核酸擴(kuò)增檢測(cè)等，常由于接種卡介苗引起假陽(yáng)性、患者免疫功能低下導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)假陰性，PCR方法技術(shù)要求高、無(wú)法區(qū)分死/活菌，且存在取樣困難等問(wèn)題限制了其在臨床的應(yīng)用[10]。中國(guó)近幾年多項(xiàng)研究表明，外周血T-SPOT.TB診斷TBM的靈敏度為70%～91%，特異度為58%～87%[11-13]。本研究顯示外周血T-SPOT.TB診斷TBM的靈敏度為91.5%，特異度為86.2%，準(zhǔn)確度為88.6%，與上述報(bào)道基本一致。

腦脊液ADA是嘌呤核苷酸代謝的關(guān)鍵酶，參與機(jī)體T淋巴細(xì)胞增殖、分化過(guò)程，結(jié)核分枝桿菌感染會(huì)增加腦脊液ADA含量，通過(guò)測(cè)定ADA活性，有利于診斷TBM。Tuon等[14]通過(guò)對(duì)13宗研究分析發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦脊液ADA正常值在1～4 U/L 時(shí)，其靈敏度＞93%，特異度＜80%，有助于排除TBM；＞8 U/L時(shí)，靈敏度＜59%，特異度＞96%，有助于TBM診斷。本研究顯示腦脊液ADA的靈敏度為21.3%，特異度為94.8%，可見(jiàn)靈敏度明顯降低，考慮可能原因：①白血病、AIDS等可導(dǎo)致機(jī)體免疫功能降低，進(jìn)而影響腦脊液ADA檢測(cè)結(jié)果，從而使ADA水平和陽(yáng)性率減低[15]；②因大多數(shù)腦膜炎患者在就診之前，曾進(jìn)行過(guò)治療，不排除使用抗結(jié)核藥物及激素等，從而使體內(nèi)激素水平發(fā)生變化，出現(xiàn)假陰性；③隨著年齡的增大，ADA分泌也逐步下降[16]。

2010年GeneXpert MTB/RIF檢測(cè)技術(shù)被WHO確認(rèn)為用于診斷肺和肺外結(jié)核的方法[3]。薈萃分析表明，在確診的TBM患者中腦脊液Xpert MTB/RIF檢測(cè)有較高的準(zhǔn)確率，靈敏度可達(dá)57%（38%～74%），特 異 度 為98%（89%～100%），在臨床疑似患者中其檢測(cè)的靈敏度僅有13%（6%～28%），特異度為98%（92%～100%）[17]。本研究顯示Xpert MTB/RIF檢測(cè)的靈敏度和特異度分別為63.8%和100%，靈敏度與以往研究相似。與傳統(tǒng)培養(yǎng)法相比，Xpert MTB/RIF檢測(cè)的靈敏度高，且在檢測(cè)時(shí)間、自動(dòng)化及耐藥結(jié)果獲取方面具有明顯的優(yōu)勢(shì)[18]。

本研究中，采用ROC曲線及其AUC分析不同試驗(yàn)方法的診斷價(jià)值顯示：外周血T-SPOT.TB、腦脊液ADA、腦脊液Xpert MTB/RIF檢測(cè)的AUC值分別為0.888、0.700、0.819。外周血T-SPOT.TB的AUC值明顯高于腦脊液ADA、腦脊液Xpert MTB/RIF檢測(cè)。外周血T-SPOT.TB診斷TBM的靈敏度為91.5%，高于其他兩種檢測(cè)方法。由此可見(jiàn)，外周血T-SPOT.TB在早期TBM的診斷中價(jià)值較高。但是T-SPOT.TB檢測(cè)不能有效區(qū)分活動(dòng)性結(jié)核病或潛伏性結(jié)核感染，不能用于確診或排除結(jié)核病，對(duì)于痰抗酸桿菌涂片及培養(yǎng)檢查均陰性的結(jié)核病有輔助診斷價(jià)值。還需要結(jié)合臨床癥狀、腦脊液常規(guī)、生化及其他早期診斷方法進(jìn)一步明確診斷。本研究顯示三種早期診斷方法聯(lián)合的靈敏度為100%，準(zhǔn)確度為90.5%，均高于三種單項(xiàng)檢測(cè)方法，對(duì)TBM的診斷更有意義，值得臨床 推廣。

本研究的局限性：僅為一所醫(yī)院數(shù)據(jù)，樣本量少，仍需加大樣本量及多中心研究進(jìn)一步加以論證。總之，希望能發(fā)現(xiàn)更多新的標(biāo)志物及新方法，為T(mén)BM的早期診斷提供更強(qiáng)有力的工具。