周 娟，林曉玲，劉 華，葉麗妍，陳佩文，葉綺娜，陳曉剛

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；3.廣州婦女兒童醫(yī)療中心，廣東 廣州 510623)

支氣管哮喘是以慢性氣道炎癥和氣道高反應(yīng)性為特征的過(guò)敏性疾病，以兒童多見(jiàn)。目前現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對(duì)哮喘的治療仍然以霧化吸入糖皮質(zhì)激素為主，然而過(guò)量吸入糖皮質(zhì)激素可能會(huì)造成藥物依賴或耐藥性以及其他不良反應(yīng)。此外，哮喘疾病病程較長(zhǎng)，患兒的用藥依從性較差，亦會(huì)影響治療效果。中醫(yī)藥治療哮喘顯示出較好效果，如景曉平等[1]研究報(bào)道，中藥治療可降低哮喘發(fā)作次數(shù)、整體調(diào)節(jié)患兒免疫力。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，“培土生金法”早期干預(yù)能顯著減輕哮喘模型幼鼠的氣道炎癥反應(yīng)，增加支氣管肺泡灌洗液中白細(xì)胞介素-10(IL-10)的含量[2]。本實(shí)驗(yàn)探討了“培土生金法”的上述作用機(jī)制是否與調(diào)節(jié)腸道微生物的構(gòu)成相關(guān)，旨在為中醫(yī)藥防治哮喘的作用機(jī)制研究提供更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 7日齡SPF級(jí)BALB/c雌性幼鼠32只，體重(5.26±1.15)g，購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0034。飼養(yǎng)環(huán)境：廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境，實(shí)驗(yàn)中心許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0092，實(shí)驗(yàn)符合廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理審查要求。

1.2藥品、試劑與儀器 雞卵清蛋白(OVA，Sigma公司)；氫氧化鋁粉(天津天士力化學(xué)試劑公司)；異功散組方：人參、白術(shù)、茯苓、廣陳皮、炙甘草(廣州中醫(yī)藥中大學(xué)第一附屬醫(yī)院)按1∶1∶1∶1∶1比例配制成含生藥質(zhì)量濃度為2 g/mL的溶液；酪酸梭菌(CGMCC313-1，山東科興生物制品有限公司)；霧化器(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院兒科)；小鼠霧化激發(fā)箱(廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。

1.3實(shí)驗(yàn)方法 按隨機(jī)數(shù)表法將幼鼠分為空白組、模型組、異功散組和益生菌組，每組8只，分籠喂養(yǎng)。模型組、異功散組和益生菌組參照文獻(xiàn)[2]方法制備幼鼠哮喘模型：幼鼠分別于第1天、第13天腹腔注射0.2 mL OVA致敏液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% OVA溶液0.1 mL與等體積佐劑液態(tài)鋁混合)，并于第19天開(kāi)始以3% OVA溶液霧化吸入激發(fā)，每次20 min，每日1次，連續(xù)激發(fā)6 d，幼鼠出現(xiàn)煩躁不安、腹部凹陷、搔耳撓鼻、弓背為陽(yáng)性反應(yīng)；空白組以等體積生理鹽水行腹腔注射致敏及霧化吸入激發(fā)。從造模起始日至霧化激化前1 d(共18 d)，異功散組給予異功散煎液灌胃，益生菌組給予濃度為5×108CFU/mL的酪酸梭菌溶液灌胃，空白組和模型組給予PBS溶液灌胃，均每日1次，0.2 mL/只。

1.4觀察指標(biāo)及方法

1.4.1幼鼠表現(xiàn)及體重 觀察幼鼠激發(fā)階段表現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄各組幼鼠體重。

1.4.2腸道菌群檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，解剖各組幼鼠取全結(jié)腸，收集糞便，-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩颖舅椭辽虾ｄJ翌生物科技有限公司行16S-rRNA擴(kuò)增子高通量檢測(cè)及相應(yīng)的生物信息學(xué)分析。

2 結(jié) 果

2.1各組幼鼠激發(fā)階段表現(xiàn)及體重比較 模型組幼鼠在激發(fā)階段期間出現(xiàn)搔耳撓鼻、前肢上抬、煩躁、活動(dòng)過(guò)度活躍(跑竄、攀爬等行為)、腹部凹陷等表現(xiàn)；異功散組和益生菌組幼鼠偶有搔耳撓鼻行為，無(wú)明顯其他異常表現(xiàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白組、模型組、異功散組、益生菌組幼鼠體重分別為(16.34±0.89)g、(13.33±1.98)g、(13.85±1.72)g、(14.59±1.64)g，模型組明顯低于空白組(P<0.05)，異功散組、益生菌組與模型組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，益生菌組與異功散組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.2各組幼鼠腸道菌群情況

2.2.1微生物菌群物種豐度 門水平：與空白組比較，模型組幼鼠腸道內(nèi)的擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度減少，厚壁菌門(Firmicutes)豐度增加；與模型組比較，異功散組、益生菌組的擬桿菌豐度增加，厚壁菌門豐度減少，見(jiàn)圖1。屬水平：空白組產(chǎn)丁酸鹽菌屬(Saccharibacteria-genera-incertae-sedis)比例顯著增加，模型組中阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、鏈球菌屬(Streptococcus)、棒桿菌屬(Corynebacterium)比例顯著增加，異功散組螺桿菌屬(Helicobacter)、黃酮菌屬(Flavonifractor)比例顯著增加，益生菌組中腸桿菌屬(Enterorhabdus)、羅氏菌屬(Rothia)、戴爾福特菌屬(Delftia)比例顯著增加，見(jiàn)圖2。

圖1 空白組和哮喘各組幼鼠門水平上微生物菌群物種豐度

2.2.2腸道菌群物種alpha多樣性分析 各組幼鼠腸道菌群的稀釋曲線均急劇上升后呈平緩趨勢(shì)(見(jiàn)圖3)，表明測(cè)序深度可以覆蓋本樣本中的物種組成情況。與空白組比較，模型組幼鼠腸道菌群豐度chao1指數(shù)及observed_species指數(shù)和菌群多樣性shannon指數(shù)及simpson指數(shù)均有下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。與模型組比較，異功散組幼鼠腸道菌群的豐度chao1指數(shù)明顯降低(P<0.05)，菌群多樣性指數(shù)有下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；益生菌組幼鼠腸道菌群豐度chao1指數(shù)及observed_species指數(shù)有下降趨勢(shì)，菌群多樣性shannon指數(shù)及simpson指數(shù)有增加趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 空白組和哮喘各組幼鼠腸道微生物菌群豐富度和多樣性比較

圖3 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群的稀釋曲線

2.2.3Beta多樣性分析各組樣本的主成分分析(PCA) 空白組、模型組、異功散組及益生菌組在第1主成分(14.68%)及第2主成分(10.78%)可分離，說(shuō)明各組菌群組成存在一定的差異，見(jiàn)圖4。

圖4 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群樣本的主成分分析

2.2.4微生物組間差異分析 在門水平上，空白組幼鼠腸道菌群以CandidatusSaccharibacteria為主，模型組以疣微菌門(Verrucomicrobia)為主，異功散組以擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)為主；在屬水平上，空白組主要為產(chǎn)丁酸鹽菌屬(Saccharibacteria-genera-incertae-sedis)、球菌屬(Sporosarcina)、巴氏桿菌屬(Pasteurella)，模型組主要為阿克曼氏菌屬(Akkermansia)、擬普雷沃菌屬(alloprevotella)，異功散組主要為螺桿菌屬(Helicobacter)、黃酮菌屬(Flavonifractor)、Erysipelotrichaceae-incertae-sedis，益生菌組主要為腸桿菌屬(Enterorhabdus)、短小桿菌屬(Curtobacterium)。見(jiàn)圖5及圖6。

圖5 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群進(jìn)化分支

圖6 空白組和哮喘各組幼鼠腸道菌群 LDA值分布情況

3 討 論

近年來(lái)越來(lái)越多的證據(jù)表明，嬰兒早期腸道微生物的組成及改變與過(guò)敏性哮喘發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，出生后第1個(gè)月腸道菌群多樣性降低可導(dǎo)致學(xué)齡期哮喘的發(fā)生[3]；3個(gè)月嬰兒腸道的低水平Faecalibacterium、Lachnospira、V feillonella和Rothia菌群與哮喘發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[5]。腸道菌群的失調(diào)雖可能導(dǎo)致哮喘的發(fā)生，但特定的微生物物種在哮喘的發(fā)展中亦起保護(hù)作用，口服益生菌被認(rèn)為是防治哮喘的有效治療手段。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，口服酪酸桿菌、短雙歧桿菌M-16V可減輕OVA導(dǎo)致的小鼠過(guò)敏性氣道炎癥[6]；一項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的Meta分析結(jié)果顯示，補(bǔ)充鼠李糖乳桿菌GG有助于預(yù)防哮喘[7]。

中醫(yī)認(rèn)為，哮喘的夙根為“痰”，哮喘緩解期以脾肺氣虛證多見(jiàn)。《保嬰撮要》中記載：“喘一小兒外感風(fēng)邪，服表散之劑，汗出作喘，此邪氣去而脾肺虛也。用異功散而汗喘止，再劑而乳食進(jìn)。”異功散是北宋名醫(yī)錢乙所制名方，由人參、白術(shù)、茯苓、陳皮、炙甘草組成，人參益氣補(bǔ)中，白術(shù)健脾燥濕，茯苓健脾滲濕，陳皮行氣燥濕，甘草甘緩和中，全方健脾益氣、行氣化滯，在哮喘患兒緩解期的治療中得到大量應(yīng)用?，F(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，方中主要藥物的活性成分如橘皮素、橙皮苷、人參皂苷Rh2等，能減輕哮喘模型動(dòng)物肺組織炎癥，或降低氣道高反應(yīng)性，抑制Th2、Th17細(xì)胞增殖及相關(guān)炎性因子分泌等[8-9]。

本實(shí)驗(yàn)中采用16S-rRNA擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)哮喘幼鼠腸道菌群情況，結(jié)果顯示模型組腸道菌群豐度和菌群多樣性有下降趨勢(shì)，異功散和益生菌的早期干預(yù)并未使菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變，提示二者未能有效逆轉(zhuǎn)哮喘幼鼠腸道菌群物種豐度及多樣性的下降，這可能與用藥時(shí)間較短(18 d)有關(guān)，也提示藥物的作用可能只局限于某些特定菌群。

擬桿菌是腸道內(nèi)棲息的常見(jiàn)共生菌，是腸道產(chǎn)生短鏈脂肪酸(SCFAs)尤其是乙酸的主要細(xì)菌來(lái)源[10]，而乙酸可有效改善過(guò)敏性哮喘[4]。Abrahamsson等[3]研究發(fā)現(xiàn)，腸道擬桿菌豐度高的嬰幼兒以后患哮喘和過(guò)敏性疾病的概率相對(duì)較低；相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提示，腸道擬桿菌有助于減輕哮喘模型小鼠的過(guò)敏性炎癥及氣道高反應(yīng)性[4，11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組幼鼠腸道內(nèi)的擬桿菌門豐度減少，厚壁菌門豐度增加；與模型組比較，異功散組、益生菌組的擬桿菌豐度增加，厚壁菌門豐度減少。提示異功散早期干預(yù)可能通過(guò)改變腸道菌群中擬桿菌門豐度從而改善哮喘。

幽門螺桿菌被認(rèn)為可防治哮喘。美國(guó)一項(xiàng)大型橫斷面分析結(jié)果顯示，幽門螺桿菌的定植與哮喘發(fā)生呈負(fù)相關(guān)，在5歲以下尤為明顯[12]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在致敏前期暴露于幽門螺桿菌可顯著改善OVA致敏哮喘小鼠的氣道炎癥，抑制氣道重塑[13]，其誘導(dǎo)的保護(hù)作用包括通過(guò)IL-18和IL-10依賴性機(jī)制誘導(dǎo)耐受性樹(shù)突狀細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞[14-16]。黃酮菌屬中的Flavonifractorplautii(FP)為革蘭陽(yáng)性厭氧菌，可從人類糞便中分離出來(lái)，參與人腸道中兒茶素的代謝，兒茶素被認(rèn)為可減輕哮喘小鼠的氣道炎癥[17]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，口服FP可抑制OVA致敏小鼠的脾臟細(xì)胞分泌IL-4，減少血清中OVA-sIgE的含量，并增加CD4+CD25+T細(xì)胞和CD103+CD11c+樹(shù)突狀細(xì)胞，減輕抗原誘導(dǎo)的Th2免疫應(yīng)答[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，異功散組中螺桿菌屬、黃酮菌屬較模型組顯著增加，提示異功散早期干預(yù)可能通過(guò)影響螺桿菌屬、黃酮菌屬而發(fā)揮治療哮喘作用。

綜上所述，異功散的早期干預(yù)影響了哮喘模型幼鼠的腸道菌群，其防治哮喘作用可能與某些關(guān)鍵菌群如擬桿菌、螺桿菌、黃酮菌等相關(guān)，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步深入探索。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。