韓秉君，牟美睿，楊鳳霞，田雪力，張克強(qiáng)

（農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191）

近年來(lái)，抗生素抗性基因（Antibiotic resistance genes，ARGs）作為一類新型環(huán)境污染物而備受關(guān)注，ARGs通過(guò)水平轉(zhuǎn)移和垂直傳播方式從人和動(dòng)物體進(jìn)入環(huán)境。目前，我國(guó)畜禽源抗性基因污染形勢(shì)十分嚴(yán)峻?？股卦趧?dòng)物體內(nèi)不能完全由吸收代謝途徑降解，60%～90%以原藥形態(tài)隨糞尿進(jìn)入環(huán)境[1]，誘導(dǎo)產(chǎn)生耐藥菌及抗性基因，對(duì)受納環(huán)境和人類健康構(gòu)成潛在威脅[2-3]。畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的長(zhǎng)期過(guò)量使用，加速了養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的產(chǎn)生和傳播，糞便、廢水回用農(nóng)田土壤，氣溶膠向大氣自然擴(kuò)散等活動(dòng)，都增加了ARGs 由動(dòng)物源向環(huán)境的輸入。世界衛(wèi)生組織（WHO）已將ARGs作為21世紀(jì)威脅人類健康的重大挑戰(zhàn)之一，并在全球范圍對(duì)控制ARGs進(jìn)行戰(zhàn)略部署[4-5]。因此，闡釋ARGs在畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中的多介質(zhì)遷移以及農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中的行為歸趨和影響因素，對(duì)遏制日益嚴(yán)峻的畜禽源細(xì)菌耐藥性問(wèn)題具有重要意義。

雖然畜禽環(huán)境中的ARGs 污染已被廣泛提及，但相關(guān)研究成果仍缺乏系統(tǒng)性，故加強(qiáng)畜禽源ARGs 的來(lái)源分布、傳播途徑和處理工藝的研究，有利于全面評(píng)估養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的生態(tài)環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)，同時(shí)為畜禽養(yǎng)殖環(huán)境的保護(hù)和動(dòng)物產(chǎn)品質(zhì)量安全的保證提供理論和科學(xué)依據(jù)。本文針對(duì)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的污染問(wèn)題，結(jié)合國(guó)內(nèi)外的最新文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)不同畜種、不同國(guó)家（地區(qū)）養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)ARGs 的分布規(guī)律及不同環(huán)境介質(zhì)中ARGs 的遷移擴(kuò)散進(jìn)行了綜述，對(duì)比了雞、豬和牛等主要養(yǎng)殖畜種間ARGs 豐度的差異，分析了地域性污染特征，并論述糞便堆肥和廢水處理等主要糞污資源化利用途徑對(duì)ARGs 的去除效果及處理過(guò)程中ARGs 的消長(zhǎng)規(guī)律，最后對(duì)畜禽源ARGs 的污染防控進(jìn)行了展望。

1 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的產(chǎn)生及來(lái)源

ARGs 在畜禽糞污（糞便和廢水）、周邊環(huán)境（土壤、水體和空氣）等不同環(huán)境介質(zhì)中普遍存在[6-7]，其借助質(zhì)粒、整合子和轉(zhuǎn)座子等可移動(dòng)性遺傳元件（Mobile genetic elements，MGEs）通過(guò)接合、轉(zhuǎn)座、轉(zhuǎn)化等方式在微生物中持續(xù)傳播并廣泛擴(kuò)散[8]。畜禽源細(xì)菌中ARGs 的不斷檢出，引起人們對(duì)抗生素使用與ARGs 產(chǎn)生之間關(guān)聯(lián)性的重視[9]。我國(guó)于2020 年7 月1 日起，禁止企業(yè)在商品飼料中添加用于促動(dòng)物生長(zhǎng)的抗生素，但此前抗生素長(zhǎng)期使用造成的細(xì)菌耐藥性產(chǎn)生與傳播仍是全球疾病防控面臨的重大問(wèn)題[10-11]。迄今為止，在畜禽糞便、養(yǎng)殖廢水等不同介質(zhì)中發(fā)現(xiàn)并報(bào)道的ARGs已包含近40種四環(huán)素類抗性基因、10余種高風(fēng)險(xiǎn)β-內(nèi)酰胺類抗性基因、3種磺胺類抗性基因以及多種喹諾酮類抗性基因[12]，且四環(huán)素抗性基因和磺胺類抗性基因的檢出率和含量水平較高，其在養(yǎng)殖環(huán)境中的污染較為嚴(yán)重[6]，這與廣譜獸用四環(huán)素和磺胺類抗生素藥物的普遍使用密切相關(guān)[13]。養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 主要來(lái)源于抗生素亞致死劑量誘導(dǎo)微生物發(fā)生基因新突變（細(xì)菌內(nèi)在抗性）或者在抗生素等因素脅迫下經(jīng)ARGs 水平轉(zhuǎn)移（獲得性抗性）。其中，動(dòng)物腸道微生物通過(guò)隨機(jī)突變或者表達(dá)其體內(nèi)潛在抗性基因等途徑而獲得抗生素抗性，即腸道細(xì)菌固有的抗性是養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 普遍存在的原因之一。然而，一般細(xì)菌的自發(fā)突變率僅為10-6～10-8且非常不穩(wěn)定，通過(guò)突變來(lái)獲得多種抗生素的多重耐藥性幾率更低[14]。相比之下，通過(guò)微生物體內(nèi)MGEs（如質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、基因盒等）介導(dǎo)而發(fā)生的ARGs 在細(xì)菌種內(nèi)和種間的轉(zhuǎn)移，對(duì)畜禽源ARGs 和耐藥菌廣泛遷移及嚴(yán)重污染的影響更為顯著[15-16]。此外，抗性基因的外源輸入亦是養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的重要來(lái)源，如通過(guò)進(jìn)食將水源和飼料中存在的某些ARGs 直接帶入動(dòng)物體內(nèi)后，又隨糞便及尿液排泄進(jìn)入環(huán)境。外源輸入的ARGs也會(huì)通過(guò)垂直傳遞和水平轉(zhuǎn)移的方式在養(yǎng)殖環(huán)境中進(jìn)一步傳播擴(kuò)散。ARGs 污染比較特殊，其不同于其他化學(xué)污染，一旦產(chǎn)生就很難控制和消除。因此，ARGs 在養(yǎng)殖環(huán)境中的持久性殘留和在菌群間的遷移、轉(zhuǎn)化和傳播，比抗生素本身對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害更大。

2 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的研究方法

畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的主要研究方法有微生物培養(yǎng)法、PCR（Polymerase chain reaction）技術(shù)和宏基因組測(cè)序技術(shù)等。

2.1 微生物培養(yǎng)法

微生物培養(yǎng)法是指通過(guò)藥敏試驗(yàn)檢測(cè)微生物的抗生素抗性表型來(lái)評(píng)價(jià)其耐藥性，是研究畜禽源細(xì)菌耐藥性的傳統(tǒng)方法，其主要包括3 種檢測(cè)方式：①基于測(cè)量最小抑制濃度（MIC）的肉湯稀釋法和平板稀釋法；②基于藥敏紙片測(cè)量抑菌圈直徑的K-B 瓊脂擴(kuò)散法；③將稀釋法和擴(kuò)散法相結(jié)合的E-test 試驗(yàn)法?，F(xiàn)在使用最為廣泛的是藥敏檢測(cè)K-B 瓊脂擴(kuò)增法（紙片法）[17]，即在已接種待檢菌的瓊脂平板上貼上含有定量抗生素的小紙片，藥物在紙片上向周圍區(qū)域溶解擴(kuò)散而形成遞減濃度梯度，在其范圍內(nèi)抑制待檢細(xì)菌的生長(zhǎng)并產(chǎn)生透明的抑菌圈，根據(jù)抑菌圈的大小來(lái)判斷微生物對(duì)抗生素的耐受水平[18]。傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)法在研究可培養(yǎng)細(xì)菌的抗生素抗性方面發(fā)揮了重要作用，但是該方法的缺點(diǎn)是漏失了不可培養(yǎng)菌攜帶的抗性基因。近些年，新興的培養(yǎng)組學(xué)結(jié)合了MALDI-TOF 質(zhì)譜和16S rRNA 測(cè)序技術(shù)，利用不同條件培養(yǎng)難培養(yǎng)菌生長(zhǎng)并可實(shí)現(xiàn)細(xì)菌等微生物的鑒定。隨著新興培養(yǎng)組學(xué)的發(fā)展，新型培養(yǎng)技術(shù)逐漸涌現(xiàn)，如膜擴(kuò)散培養(yǎng)技術(shù)、微流控培養(yǎng)系統(tǒng)和基于細(xì)胞分選的方法等，并且其中一些已有成功的細(xì)菌培養(yǎng)案例[19]。新興培養(yǎng)組學(xué)相較于PCR 技術(shù)與宏基因組學(xué)，細(xì)菌檢測(cè)靈敏度極大提高，檢測(cè)閾值可低至每克糞便102個(gè)。同時(shí)，微生物培養(yǎng)的自動(dòng)化儀器也在不斷發(fā)展，使得微生物培養(yǎng)技術(shù)更為省力便捷。新興技術(shù)能夠一定程度提高微生物分離培養(yǎng)的潛力，理論上可以應(yīng)用于多種分類單元，但其仍有局限性。故對(duì)于微生物培養(yǎng)技術(shù)的研究仍要繼續(xù)深入，促進(jìn)技術(shù)方法不斷成熟和進(jìn)步。

2.2 PCR技術(shù)

隨著科技進(jìn)步和分子生物技術(shù)的發(fā)展，研究畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗性基因和耐藥菌的方法越來(lái)越多，定性PCR 技術(shù)是一種擴(kuò)增特定DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)，不需要對(duì)微生物分離培養(yǎng)，可快速、靈敏、準(zhǔn)確地進(jìn)行直接檢測(cè)。針對(duì)普通PCR 方法只能檢測(cè)環(huán)境中是否存在ARGs 而無(wú)法精準(zhǔn)量化的問(wèn)題，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time quantitative PCR，qPCR）和高通量熒光定量PCR 技術(shù)逐漸發(fā)展起來(lái)。qPCR 是PCR 從定性到定量的飛躍，因其重復(fù)性好、穩(wěn)定性強(qiáng)，且具有實(shí)時(shí)性，已被廣泛用于環(huán)境樣品中ARGs 的定量分析，該方法還可以直觀分析抗性基因在環(huán)境中的變化，為探究ARGs 在環(huán)境中分布特征及遷移規(guī)律提供了方法學(xué)上的更多可能[20]。而高通量熒光定量PCR技術(shù)進(jìn)一步突破了普通qPCR 同步測(cè)試數(shù)量少和種類有限的局限性，可同時(shí)對(duì)多個(gè)樣品及上百種抗性基因進(jìn)行定量分析，大大提高了檢測(cè)效率，在養(yǎng)殖環(huán)境中應(yīng)用也越來(lái)越多。ZHU 等[21]應(yīng)用高通量熒光定量PCR技術(shù)在養(yǎng)豬場(chǎng)糞便、堆肥及周圍施用糞肥農(nóng)田土壤中檢測(cè)到149 種ARGs，基本涵蓋目前的主要ARGs類型。

2.3 宏基因組測(cè)序技術(shù)

宏基因組學(xué)也稱為微生物環(huán)境基因組學(xué)，是對(duì)環(huán)境樣品中直接獲得的總DNA（包括全部微小生物遺傳物質(zhì)的總和）進(jìn)行分析的所有研究集合[22]，它不僅是一套研究方法，更是一個(gè)研究領(lǐng)域[23]。利用宏基因組測(cè)序技術(shù)檢測(cè)畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 主要分為三步：①宏基因組DNA 的提?。虎跇?gòu)建宏基因組文庫(kù)；③宏基因組文庫(kù)的分析與篩選。隨著測(cè)序技術(shù)和組學(xué)分析技術(shù)的不斷發(fā)展，宏基因組測(cè)序在畜禽源ARGs 檢測(cè)以及ARGs 生態(tài)健康風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估方面的應(yīng)用也越來(lái)越多。FANG等[24]利用該方法在雞糞及雞糞肥施用土壤中檢測(cè)出22 類ARGs 以及46 種由致病菌攜帶和32 種人類致病菌所攜帶的抗性基因。宏基因組測(cè)序技術(shù)還可以發(fā)掘畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中存在的新型抗性基因，客觀全面地反映ARGs 的多樣性，確定新的抗性機(jī)制并揭示生態(tài)作用。另外，通過(guò)轉(zhuǎn)移基因組的檢測(cè)分析，宏基因組測(cè)序還可以為研究環(huán)境中畜禽源ARGs 的水平轉(zhuǎn)移提供方法支持[25]。近年來(lái)宏基因組學(xué)的發(fā)展，使得養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的深入研究更加簡(jiǎn)便、高效且具有較高特異性，成本也不斷下降，同時(shí)也增加了人類對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境中抗性基因污染的了解和認(rèn)知。鑒于環(huán)境中ARGs 具有潛在的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)與健康危害，故運(yùn)用先進(jìn)的ARGs 檢測(cè)技術(shù)手段研究其傳播機(jī)制與功能十分必要。

3 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的污染現(xiàn)狀

3.1 畜種間差異

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中各畜種（主要包括雞、牛、豬等）由于具有不同的生理特性、生活習(xí)性以及養(yǎng)殖環(huán)境，其糞污中的ARGs 多樣性和豐度存在顯著差異。研究顯示，雞糞和豬糞中ARGs 濃度平均值顯著高于牛糞[26-27]。鄒威等[28]針對(duì)不同畜禽ARGs 的研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)雞場(chǎng)糞便中磺胺類和大環(huán)內(nèi)酯類ARGs 的相對(duì)豐度（ARGs copies/16S rRNA copies）高于養(yǎng)豬場(chǎng)糞便，如雞糞中sul2 基因的相對(duì)豐度為2.16×10-2～2.26×10-1，高于豬糞中的1.2×10-4～5.56×10-2，該結(jié)果與CHENG 等[29]對(duì)我國(guó)華東地區(qū)畜禽糞便的調(diào)研結(jié)果一致。MU 等[30]通過(guò)定量檢測(cè)磺胺類、四環(huán)素類以及大環(huán)內(nèi)酯類ARGs 也印證了這一結(jié)論，各畜種養(yǎng)殖場(chǎng)中ARGs總濃度表現(xiàn)為雞>豬>肉牛。谷艷茹等[31]對(duì)天津地區(qū)不同發(fā)育階段豬群的研究發(fā)現(xiàn)，母豬糞污中多數(shù)ARGs 的相對(duì)豐度顯著高于仔豬和育肥豬。由此可見(jiàn)，不同種類畜禽糞污中ARGs 的濃度水平存在差異，且處于不同生長(zhǎng)發(fā)育階段的畜禽產(chǎn)生的糞污中ARGs濃度也不同。

造成不同畜種間ARGs 水平差異的原因是復(fù)雜的，雞糞中ARGs 的豐度較高，可能是由于雞飼養(yǎng)過(guò)程中允許的飼喂抗生素用量高于豬和牛的允許用量[32]。有研究報(bào)道，雞和豬的糞便中發(fā)現(xiàn)的抗生素殘留量通常比肉牛高，我國(guó)畜禽養(yǎng)殖業(yè)雞糞中抗生素殘留量（1 420.8 mg·g-1）明顯高于豬糞[33-34]。此外，養(yǎng)雞場(chǎng)較高的養(yǎng)殖密度也導(dǎo)致其更容易感染傳染病，養(yǎng)殖戶為了預(yù)防和治療疾病，可能會(huì)使用超出許可范圍的抗生素。除了抗生素使用量高以外，雞微生物組中ARGs 的高度可轉(zhuǎn)移性也可能有助于ARGs 在雞糞中的傳播。QU 等[35]使用宏基因組學(xué)方法發(fā)現(xiàn)，MGEs是雞盲腸微生物組的主要功能成分，有助于基因水平轉(zhuǎn)移。一般而言，由于較高的繁殖密度和較短的生長(zhǎng)周期，養(yǎng)雞和養(yǎng)豬使用的抗生素量遠(yuǎn)高于養(yǎng)牛[33]。同時(shí)，不同農(nóng)場(chǎng)同種動(dòng)物樣品中ARGs 的多樣性和豐度也存在差異，這可能與飼料條件（飲食結(jié)構(gòu)和抗生素使用劑量）、動(dòng)物亞型和年齡有關(guān)，如在低劑量水平上應(yīng)用不同抗生素可能導(dǎo)致牛糞中ARGs 類型的顯著變化[36]。進(jìn)一步地，還可以用動(dòng)物飼料中添加的不同抗生素以及畜種之間的腸道菌群差異來(lái)解釋[37-39]。而不同育齡階段ARGs 變化的原因，可能是動(dòng)物各生長(zhǎng)階段的抗生素給藥方式不同。豬的養(yǎng)殖早期階段會(huì)使用較高劑量的抗生素，在其生長(zhǎng)過(guò)程中逐漸降低抗生素使用濃度，故肥育豬糞污ARGs 的豐度和多樣性低于母豬和仔豬[40-41]。

3.2 地域性差異

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中ARGs 污染情況在各國(guó)間存在差異，這很大程度上受到當(dāng)?shù)乜股厥褂梅煞ㄒ?guī)和實(shí)施情況的影響。近年，歐盟以及一些國(guó)家為應(yīng)對(duì)抗生素抗性的蔓延，限制了養(yǎng)殖業(yè)中用于預(yù)防疾病的抗生素的用量，同時(shí)對(duì)飼料級(jí)抗生素也進(jìn)行了限制，尤其是四環(huán)素和多黏菌素的使用[42]。盡管各國(guó)均有相關(guān)監(jiān)控和管理部門，但抗生素仍在養(yǎng)殖業(yè)廣泛應(yīng)用，導(dǎo)致動(dòng)物和農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中ARGs的增加[43]。尤其是許多低收入和中等收入國(guó)家和地區(qū)對(duì)抗生素使用監(jiān)管不到位，使得抗生素和ARGs 進(jìn)入到土壤和水體中，給環(huán)境健康和社會(huì)安全帶來(lái)重大風(fēng)險(xiǎn)[7]。在已報(bào)告ARGs 豐度數(shù)據(jù)的96 個(gè)國(guó)家中，我國(guó)是最大的抗生素生產(chǎn)者和消費(fèi)國(guó)，養(yǎng)殖業(yè)產(chǎn)生的糞便中通常有較高的ARGs 豐度[44]。我國(guó)自20 世紀(jì)70 年代使用抗生素以來(lái)，消費(fèi)量呈持續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，近一半抗生素進(jìn)入了養(yǎng)殖業(yè)，總量達(dá)105 000 t[45]。畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 污染在全球各國(guó)間存在地域性差異，HEUER 等[46-47]的研究發(fā)現(xiàn)德國(guó)養(yǎng)豬場(chǎng)糞便中磺胺類ARGs 相對(duì)豐度為10-5～10-2；而美國(guó)24 個(gè)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便中，sul1 的相對(duì)豐度范圍為10-6～10-5，低于德國(guó)。ARGs 的豐度變化還取決于各國(guó)不同地區(qū)的具體情況，不同地區(qū)畜禽養(yǎng)殖業(yè)ARGs 的污染水平存在較大差異。在美國(guó)奶牛場(chǎng)中，中西部和東北部養(yǎng)殖場(chǎng)糞污中ARGs 豐度具有明顯差異。在我國(guó)，山東養(yǎng)殖場(chǎng)牛糞中ARGs 的絕對(duì)豐度（濃度高達(dá)1011copies·g-1）比陜西高出約100倍[48-49]；河北地區(qū)養(yǎng)豬場(chǎng)和養(yǎng)雞場(chǎng)ARGs 的平均相對(duì)豐度分別為4.99×10-2和1.36×10-1，均高于天津市[29]。對(duì)某些國(guó)家來(lái)說(shuō)，ARGs 豐度主要與抗生素使用量和殘留濃度有關(guān)，但由于影響耐藥菌生長(zhǎng)以及ARGs 傳播和削減的區(qū)域物理和化學(xué)條件不同，各地區(qū)ARGs豐度可能出現(xiàn)較大的差異[6]。全球抗生素使用量與ARGs 濃度之間尚無(wú)法建立明確的聯(lián)系，如我國(guó)山東和美國(guó)科羅拉多各自在本國(guó)范圍內(nèi)抗生素的使用情況較為相似（分別占全球消費(fèi)量的23%和19%）[48-49]，但對(duì)兩地豬場(chǎng)廢水中的四環(huán)素類ARGs豐度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，山東地區(qū)較科羅拉多高出104 倍，因此，比較國(guó)家間ARGs污染情況是十分必要的。

4 典型糞污處理工藝中抗生素抗性基因的影響

4.1 固體糞便堆肥

堆肥作為一種可以有效減少甚至消除畜禽糞便中ARGs 的常見(jiàn)方法（主要有好氧堆肥和厭氧堆肥兩種方式），可以有效殺滅動(dòng)物糞便中的病原菌，將糞便制成有機(jī)肥[50-51]。而堆肥過(guò)程中產(chǎn)生的高溫可以消除耐藥微生物，降低糞便中的抗生素殘留，削減ARGs的濃度水平，實(shí)現(xiàn)糞便無(wú)害化處理。QIAN 等[26]的研究顯示，堆肥分別使雞糞和豬糞中ARGs減少了57種和28 種，平均從雞糞中去除了53%的ARGs，堆肥后65%的ARGs豐度不足原來(lái)的1/10。吳丹[52]對(duì)北京地區(qū)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞便好氧堆肥的研究也發(fā)現(xiàn)，ARGs 去除率高達(dá)90.0%～99.9%。另外，厭氧發(fā)酵作為畜禽糞便資源化和肥料化利用的一種重要方式，也能夠有效地削減ARGs 的豐度。錢燕云等[53]的研究顯示，厭氧發(fā)酵過(guò)程中tetG、tetL、tetO、tetW、sul1 和sul2 的豐度均有所下降。除了有關(guān)好氧或厭氧堆肥過(guò)程中ARGs變化的研究，現(xiàn)階段也有針對(duì)好氧-厭氧結(jié)合堆肥中ARGs 去除效果的研究，好氧-厭氧兩相堆肥能夠有效地降低部分ARGs 和潛在致病菌豐度，其中ermB、tetK的相對(duì)豐度分別降低了39.7%、72.2%[54]。

堆肥雖然能夠一定程度去除大多數(shù)ARGs，抑制潛在致病菌的繁殖擴(kuò)散，但部分ARGs 和致病菌仍存在增多的現(xiàn)象。如在高溫堆肥過(guò)程中，與堆肥初期相比，豬糞中ermF 出現(xiàn)了增加的情況[55]。ZHANG 等[56]也發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)堆肥處理，一些ARGs 的豐度減少，但也有部分ARGs 豐度增加，因此，現(xiàn)有的堆肥工藝仍有許多問(wèn)題亟待優(yōu)化。通過(guò)控制堆肥的外部因素，如pH、溫度、碳氮比等，可以提高抗生素降解和ARGs去除的效果。好氧和厭氧堆肥去除ARGs 主要是通過(guò)提高溫度達(dá)到目的，傳統(tǒng)技術(shù)最高溫度一般在55 ℃[57-58]，但對(duì)部分ARGs 的去除效果并不理想。AWASTHI 等[59]發(fā)現(xiàn)在堆肥過(guò)程中添加高濃度的黏土可以使去除效果明顯提升，并且其與溫度、pH、二氧化碳濃度以及微生物可利用的營(yíng)養(yǎng)元素等因素顯著相關(guān)。還有研究人員在傳統(tǒng)好氧堆肥和厭氧消化的原材料中添加零價(jià)鐵、鋸末、稻殼、蘑菇殘?jiān)⒅兴帤堅(jiān)任镔|(zhì)，發(fā)現(xiàn)也有一定增效作用，這可能是由于添加物影響了堆肥過(guò)程中微生物種類、營(yíng)養(yǎng)成分、溫度及水分，但具體機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究[60-63]。

4.2 廢水處理工藝

畜禽養(yǎng)殖廢水是ARGs 的重要儲(chǔ)庫(kù)之一，ARGs隨廢水排入河流或回用于農(nóng)田都可能增加環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。MCKINNEY 等[49]和SMITH 等[64]的研究 表明養(yǎng) 豬場(chǎng)廢水中tetQ、tetM、tetW 和tetO 具有較高的豐度。冀秀玲等[65]檢測(cè)了上海地區(qū)養(yǎng)牛場(chǎng)廢水中磺胺類和四環(huán)素類ARGs，發(fā)現(xiàn)含量最高的分別為sulA（108～1010cop?ies·mL-1）和tetW（106～107copies·mL-1）。HE等[3]指出，豬廢水樣品中的ARGs 至少比井水和魚(yú)塘水中高31倍。此外，在養(yǎng)殖場(chǎng)周圍的土壤和水環(huán)境中也檢測(cè)到高水平的ARGs。養(yǎng)殖場(chǎng)廢水處理對(duì)ARGs 的削減具有重要意義，不同處理工藝中ARGs 消長(zhǎng)變化不同，且ARGs 轉(zhuǎn)歸規(guī)律尚不明晰，某些ARGs 經(jīng)過(guò)處理后甚至有增多現(xiàn)象，研究畜禽養(yǎng)殖廢水中ARGs 在處理過(guò)程以及農(nóng)田回用過(guò)程中的變化規(guī)律十分必要。厭氧消化是畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)中使用廣泛的廢水生物處理工藝，產(chǎn)生的沼氣可以作為生物能源，殘?jiān)ǔＳ米饔袡C(jī)肥料[66-68]。ZHANG 等[69]的研究表明厭氧發(fā)酵降低ARGs 豐度的幅度最高可達(dá)63.9%。SUI 等[68]也指出厭氧發(fā)酵可以大幅降低ARGs 豐度，并且廢水在系統(tǒng)內(nèi)停留時(shí)間越長(zhǎng)越有利于ARGs 的去除。厭氧消化和好氧生物處理對(duì)tetA、tetW、sul1、sul2 等ARGs 的平均去除率為33.3%～97.6%[70]。廢水處理系統(tǒng)運(yùn)行狀況受季節(jié)變化的影響，CHEN 等[71]研究發(fā)現(xiàn)，夏季ermB、ermF和ermX的去除效果比冬季好。然而，由于處理系統(tǒng)實(shí)際運(yùn)行情況不同，厭氧發(fā)酵工藝也存在使一些ARGs 水平升高的情況。ZHANG 等[69]的研究表明豬場(chǎng)廢水經(jīng)微波+H2O2處理后進(jìn)行厭氧消化，ARGs濃度水平有上升趨勢(shì)，其他研究中也出現(xiàn)了厭氧發(fā)酵工藝增加ARGs豐度的結(jié)果[72]。養(yǎng)殖場(chǎng)廢水處理工藝中，氧化塘和人工濕地也很常見(jiàn)，JOY 等[73]的研究結(jié)果中，豬場(chǎng)廢水經(jīng)氧化塘處理40 d 后，ermB 的豐度僅降低了50%～60%。由此可見(jiàn)，現(xiàn)行的養(yǎng)殖廢水處理工藝對(duì)抗生素抗性基因的去除效果并不理想，還需研發(fā)能夠消解養(yǎng)豬廢水中ARGs 的新技術(shù)，以降低畜禽源抗性基因的二次污染。此外，出水中高濃度ARGs的存在亦說(shuō)明豬場(chǎng)廢水的外排是畜禽源抗性基因進(jìn)入環(huán)境中的一個(gè)重要的潛在途徑。

5 畜禽源抗生素抗性基因向各環(huán)境介質(zhì)的遷移擴(kuò)散規(guī)律

畜禽養(yǎng)殖過(guò)程中產(chǎn)生的ARGs 并不僅僅存在于養(yǎng)殖場(chǎng)及其周邊環(huán)境，還會(huì)通過(guò)各種農(nóng)業(yè)活動(dòng)污染地表水、地下水、農(nóng)田土壤和作物等（圖1）。其中，糞便堆肥還田是畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)向周圍環(huán)境輸出ARGs 的主要途徑，ARGs進(jìn)入土壤環(huán)境后會(huì)改變天然耐藥水平。許多研究表明，糞便是抗生素和ARGs 的存儲(chǔ)庫(kù)，禽畜糞便的施用造成土壤中抗生素抗性基因和相關(guān)耐藥菌群的增加。GU 等[74]對(duì)洱海流域的研究結(jié)果表明，施用不同動(dòng)物糞肥對(duì)農(nóng)田土壤中的ARGs 具有不同的影響，施用豬糞后ARGs 豐度比對(duì)照土壤增加了36 倍，而施用雞糞和牛糞肥使ARGs 的豐度分別增加了30 倍和11 倍。糞肥中ARGs 對(duì)土壤環(huán)境的污染是長(zhǎng)期且持續(xù)的，在ZHANG 等[27]的研究中，隨著時(shí)間的推移，施用家禽糞便的土壤中ARGs 的相對(duì)豐度雖有下降，但仍明顯高于未施用糞便的土壤中ARGs 水平。更令人擔(dān)憂的是，ARGs 隨糞肥進(jìn)入土壤增加了其對(duì)人類的暴露風(fēng)險(xiǎn)，土壤中ARGs 可能會(huì)通過(guò)內(nèi)生菌進(jìn)入植物體內(nèi)，危害農(nóng)產(chǎn)品安全，最終可能隨著食物鏈進(jìn)入人體。MARTI 等[75]在施用豬糞的土壤與其上生長(zhǎng)的蔬菜中都檢測(cè)到多種ARGs。同時(shí)，土壤中ARGs還可能隨雨水淋溶和徑流沖刷進(jìn)一步擴(kuò)散到周圍水體環(huán)境中，在更大范圍內(nèi)傳播和富集。

圖1 畜禽源抗生素抗性基因在環(huán)境中的傳播擴(kuò)散Figure 1 Transmission and diffusion of antibiotic resistance genes from livestock and poultry farming

畜禽養(yǎng)殖業(yè)中ARGs 除了隨堆肥進(jìn)入土壤環(huán)境外，還可能通過(guò)氣溶膠進(jìn)入周圍大氣環(huán)境中。研究表明動(dòng)物糞便及其接觸土壤中的ARGs 會(huì)通過(guò)氣流作用留存于空氣中，并且在處理處置期間，通過(guò)堆肥發(fā)酵、蒸發(fā)等方式被氣溶膠化，從而進(jìn)入周圍大氣環(huán)境[76-78]。目前，養(yǎng)殖場(chǎng)大氣環(huán)境中檢出的ARGs 種類繁多，這與養(yǎng)殖業(yè)抗生素使用密切相關(guān)，其中大環(huán)內(nèi)酯類和四環(huán)素類ARGs 檢出率較高[79-80]。這可能是由于四環(huán)素類抗生素作為重要的抗菌藥物，廣泛應(yīng)用在集約化養(yǎng)殖場(chǎng)中用于促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)和預(yù)防疾病[81]，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素則因其能有效抑制某些革蘭氏陽(yáng)性菌和革蘭氏陰性菌，而被用于畜禽細(xì)菌感染性疾病的治療[82]。在養(yǎng)殖環(huán)境的大氣中發(fā)現(xiàn)的四環(huán)素類ARGs已達(dá)10 余種。養(yǎng)豬場(chǎng)氣溶膠中檢出13 種四環(huán)素類ARGs，肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)中檢測(cè)出6 種四環(huán)素類ARGs[83]。ermA 和ermB 是最常被檢出的大環(huán)內(nèi)酯類ARGs，在養(yǎng)雞場(chǎng)舍內(nèi)氣溶膠中普遍存在[84]。有研究人員從養(yǎng)豬場(chǎng)大氣環(huán)境金黃色葡萄球菌中檢出了ermC，腸球菌和鏈球菌中檢出ermF 和mefA，并發(fā)現(xiàn)部分菌株表現(xiàn)出多重抗藥性[85-86]。大氣環(huán)境中ARGs 種類及豐度受室內(nèi)外環(huán)境條件和養(yǎng)殖情況等多重因素的影響。劉菲等[87]研究發(fā)現(xiàn)，肉雞養(yǎng)殖場(chǎng)舍內(nèi)外ARGs 豐度相差1～4 個(gè)數(shù)量級(jí)，雞舍內(nèi)PM2.5中ARGs 豐度明顯高于舍外。MCEACHRAN 等[83]對(duì)肉牛養(yǎng)殖場(chǎng)周圍空氣顆粒物的研究發(fā)現(xiàn)，下風(fēng)向氣溶膠中ARGs 豐度顯著高于上風(fēng)向。

養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 還可能通過(guò)野鳥(niǎo)、飛蟲(chóng)（蜜蜂、果蠅）和土壤動(dòng)物（蚯蚓、跳蟲(chóng)、線蟲(chóng)、螨）等媒介傳播擴(kuò)散。蠅類與動(dòng)物糞便中微生物群和ARGs/MGEs 的結(jié)果表明，蒼蠅可能在抗生素抗性的流行病學(xué)中發(fā)揮重要作用，監(jiān)測(cè)其生命活動(dòng)可以幫助了解耐藥性的傳播動(dòng)態(tài)[88]。研究顯示blaNDM在養(yǎng)雞場(chǎng)中能夠通過(guò)狗、蒼蠅和野生鳥(niǎo)類等互相傳播，并可能隨鳥(niǎo)類遷徙進(jìn)行長(zhǎng)距離遷移[89]。土壤動(dòng)物在ARGs的傳播中發(fā)揮重要作用，其腸道微生物可能是ARGs 的潛在儲(chǔ)存庫(kù)，其遷移活動(dòng)或者被捕食過(guò)程會(huì)造成ARGs 的擴(kuò)散。有研究表明，長(zhǎng)期施用雞糞增加了蚯蚓腸道中ARGs 豐度，豬糞施用也使得線蟲(chóng)、跳蟲(chóng)和捕食性螨中抗生素抗性增強(qiáng)[90-92]。對(duì)跳蟲(chóng)-捕食性螨土壤食物鏈的研究發(fā)現(xiàn)，豬糞來(lái)源的ARGs 在土壤生態(tài)系統(tǒng)中會(huì)通過(guò)營(yíng)養(yǎng)級(jí)傳遞，這說(shuō)明食物鏈傳遞對(duì)土壤中ARGs 的擴(kuò)散具有重要貢獻(xiàn)[91]。但關(guān)于土壤動(dòng)物在自然食物網(wǎng)和生態(tài)系統(tǒng)中傳播的研究仍然有限，且ARGs 的擴(kuò)散可能受食物網(wǎng)中動(dòng)物種類及營(yíng)養(yǎng)關(guān)系的重大影響。因此，針對(duì)ARGs 向不同環(huán)境介質(zhì)遷移的復(fù)雜情況，從分子層面對(duì)ARGs 的傳播擴(kuò)散機(jī)制進(jìn)行深入分析是十分必要的，并需要對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)糞污進(jìn)入周圍環(huán)境的途徑進(jìn)行管控，從而有效減少ARGs 對(duì)受納環(huán)境的污染和對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的危害。

6 畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中抗生素抗性基因的管控策略

解決畜禽源ARGs 污染需在養(yǎng)殖糞污產(chǎn)生、處置、利用等各環(huán)節(jié)進(jìn)行有效管控，提高畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞污處理中ARGs 的去除效率，并最大程度地減少排放到周圍受納環(huán)境中ARGs 的數(shù)量，從而降低ARGs 對(duì)環(huán)境及人類健康的危害。在源頭控制方面，需進(jìn)一步落實(shí)獸用抗生素管控的法律法規(guī)，加強(qiáng)用藥監(jiān)督，同時(shí)積極開(kāi)發(fā)并推廣使用抗生素替代品，如抗菌肽、益生菌、益生元等。這些替代品具有大部分或全部的抗生素功能，不易引起細(xì)菌的耐藥性。其中益生元還可通過(guò)調(diào)節(jié)代謝和免疫系統(tǒng)建立良好的腸道菌群，抑制病原體并促進(jìn)生長(zhǎng)[93-94]。值得注意的是，減少抗生素使用雖然減少了動(dòng)物體內(nèi)某些抗性細(xì)菌和多重耐藥細(xì)菌的豐度，卻不一定會(huì)使ARGs 的豐度降低[95]。攜帶ARGs 的質(zhì)粒頻繁接合會(huì)導(dǎo)致不使用抗生素時(shí)質(zhì)粒仍在微生物群落中存在的情況，因此，除停止獸用抗生素使用外，還需要采取相關(guān)措施，如應(yīng)用質(zhì)粒消除等技術(shù)防止耐藥質(zhì)粒接合對(duì)ARGs 豐度水平的影響。對(duì)于養(yǎng)殖場(chǎng)與養(yǎng)殖戶，要向其普及抗生素污染的相關(guān)知識(shí)，使其加強(qiáng)對(duì)養(yǎng)殖業(yè)ARGs 污染與擴(kuò)散造成潛在危險(xiǎn)的認(rèn)識(shí)。養(yǎng)殖場(chǎng)動(dòng)物疾病防控工作也十分關(guān)鍵，需要及時(shí)調(diào)整動(dòng)物飲食以減少疾?。ㄘi的痢疾、牛的瘤胃酸中毒等）的發(fā)生，降低人與動(dòng)物的接觸頻率，優(yōu)化養(yǎng)殖場(chǎng)廢物收集方法，并為患病畜禽建立隔離區(qū)以控制疾病的傳播。

在過(guò)程減量環(huán)節(jié)中，要對(duì)ARGs 去除工藝條件進(jìn)一步優(yōu)化，如固體糞便采用效果良好的堆肥處理工藝，以提高ARGs 的去除效率。畜禽養(yǎng)殖業(yè)廢水處理工藝中，在好氧、厭氧等技術(shù)基礎(chǔ)上，還可以考慮加入消毒等方法，以實(shí)現(xiàn)ARGs 最大程度的削減[96-97]。針對(duì)養(yǎng)殖業(yè)廢水和廢物最終的處理處置，應(yīng)建立合理可行的法規(guī)和政策，以指導(dǎo)糞肥貯存和廢水處置等實(shí)踐。在末端治理方面，對(duì)于養(yǎng)殖環(huán)境ARGs 向各環(huán)境介質(zhì)擴(kuò)散的情況，則要加強(qiáng)對(duì)ARGs 分布的具體調(diào)查，以及對(duì)土壤、水體和大氣等多種受納環(huán)境中ARGs污染的定量分析和長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)，確認(rèn)ARGs 的污染區(qū)域和水平及其周年變化規(guī)律，建立相關(guān)的ARGs 污染數(shù)據(jù)庫(kù)。同時(shí)，加強(qiáng)對(duì)ARGs 生態(tài)環(huán)境危害的研究，建立抗生素抗性生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估體系，盡可能減小ARGs對(duì)環(huán)境和人類社會(huì)造成的危害。此外，對(duì)環(huán)境中畜禽源ARGs 傳播機(jī)制及其驅(qū)動(dòng)因素的深入研究也十分必要，準(zhǔn)確了解受納環(huán)境不同介質(zhì)間ARGs 的遷移及消長(zhǎng)規(guī)律，確定不同作用機(jī)制ARGs 的關(guān)鍵宿主菌群及其傳播主導(dǎo)途徑，有助于闡明ARGs 在各環(huán)境介質(zhì)中的遷移轉(zhuǎn)化，為我國(guó)畜禽養(yǎng)殖源ARGs 的污染控制提供參考。

7 結(jié)論與展望

畜禽養(yǎng)殖活動(dòng)的加劇不僅加速了環(huán)境中畜禽源微生物的進(jìn)化，還導(dǎo)致抗生素抗性基因在不同環(huán)境介質(zhì)中的多方向傳播，甚至通過(guò)食物鏈威脅人類健康。目前，關(guān)于畜禽養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 的研究主要集中在糞便、廢水、堆肥和農(nóng)田土壤中的殘留等方面，而對(duì)于ARGs 在畜禽糞污利用、處置過(guò)程中的組成多樣性演變，及其在受納環(huán)境中的遷移、擴(kuò)散過(guò)程則較少關(guān)注。同時(shí)，該領(lǐng)域研究尚缺乏對(duì)畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)和周圍糞污受納環(huán)境中ARGs 歸趨行為的系統(tǒng)性分析，以及對(duì)環(huán)境中ARGs 分子擴(kuò)散機(jī)制的深度剖析。針對(duì)以上問(wèn)題，未來(lái)應(yīng)進(jìn)一步加強(qiáng)以下幾方面研究：

（1）探明養(yǎng)殖環(huán)境中ARGs 向受納環(huán)境的遷移與擴(kuò)散機(jī)制，以及與其遷移相關(guān)的宿主微生物種類和進(jìn)化問(wèn)題。

（2）發(fā)展更加靈敏有效的方法與技術(shù)手段，獲得更準(zhǔn)確的ARGs 定量監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)，提供更充足的證據(jù)來(lái)闡明養(yǎng)殖過(guò)程中ARGs的分子轉(zhuǎn)移機(jī)制。

（3）深入研究ARGs 在養(yǎng)殖環(huán)境中的持久性，對(duì)其長(zhǎng)期持久存在可能帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行系統(tǒng)性評(píng)估，科學(xué)收集數(shù)據(jù)并建立完善的評(píng)價(jià)系統(tǒng)。

（4）全球ARGs 數(shù)據(jù)庫(kù)的建立和共享是急迫且必要的，了解并借鑒各國(guó)和各地區(qū)政策及措施，探索更合理的養(yǎng)殖業(yè)糞污管控方式，更有利于有效控制ARGs在畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的遷移并減少其向周圍環(huán)境介質(zhì)的傳播。