高曉華，張海強(qiáng)，安 偉

(上海市水產(chǎn)研究所，上海 200433)

凡納濱對(duì)蝦()又名南美白對(duì)蝦，因其營(yíng)養(yǎng)豐富、肉味鮮美、生長(zhǎng)速度快、適鹽度范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，已成為我國(guó)重要的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種。2020年我國(guó)凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量186.3萬(wàn)t，占對(duì)蝦養(yǎng)殖總產(chǎn)量的86.54%，但由于近年來(lái)高密度集約化養(yǎng)殖方式，細(xì)菌性疾病已對(duì)凡納濱對(duì)蝦的養(yǎng)殖生產(chǎn)造成嚴(yán)重危害，大規(guī)模凡納濱對(duì)蝦患病死亡，嚴(yán)重制約對(duì)蝦養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

急性肝胰腺壞死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)是目前凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖中的主要細(xì)菌性疾病，該病主要感染投放10～40 d左右蝦苗，又稱早期死亡綜合征(Early mortality syndrome,EMS)，患病凡納濱對(duì)蝦主要病癥為蝦體變軟，肝胰腺萎縮、顏色發(fā)白，空胃空腸，攝食減少，死亡率高達(dá)90%以上，已對(duì)中國(guó)、菲律賓、墨西哥等多國(guó)對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。研究表明，對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病是由攜帶了能編碼毒力蛋白和質(zhì)粒的部分弧菌引起的，其毒力蛋白可引起對(duì)蝦肝胰腺上皮細(xì)胞脫落、壞死、肝胰腺功能障礙，進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)蝦急性死亡。已有報(bào)道顯示，可引起對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的病原菌包括副溶血弧菌()、歐文斯氏弧菌()、哈維氏弧菌()、坎氏弧菌()等。上海市奉賢區(qū)某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)大規(guī)模的急性死亡，其臨床表現(xiàn)為肝胰腺發(fā)白、空腸空胃、蝦殼變軟等癥狀，與已報(bào)道的急性肝胰腺壞死病臨床癥狀相似。本研究對(duì)疑似患急性肝胰腺壞死病的凡納濱對(duì)蝦進(jìn)行病原菌分離鑒定、致病性分析及藥物敏感性試驗(yàn)，并進(jìn)一步觀察其肝胰腺組織病理變化，以期為凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病的流行病學(xué)研究和藥物防控提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

自然患病凡納濱對(duì)蝦樣品采自上海市奉賢區(qū)某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，體長(zhǎng)約3.0～5.0 cm。健康凡納濱對(duì)蝦購(gòu)自上海市某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)，大小均勻，無(wú)病無(wú)傷，體長(zhǎng)約為5.0～7.0 cm，在水族缸內(nèi)暫養(yǎng)7 d，水溫控制在(28±1)℃，24 h充氧，并適量投喂飼料，每天按時(shí)吸污、換水，養(yǎng)殖穩(wěn)定后進(jìn)行人工感染。

1.2 主要試劑

胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)、硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂培養(yǎng)基(TCBS)均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司；PCR Premix Taq、DNA Marker DL2000、TaKaRa MiniBEST 細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒均購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；藥敏紙片、瓊脂(MHA)培養(yǎng)基購(gòu)自英國(guó)Oxoid公司，所有藥敏紙片均于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 病原菌分離

無(wú)菌接種環(huán)蘸取患病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺組織，劃線接種于弧菌選擇性培養(yǎng)基TCBS上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)箱，培養(yǎng)24 h，挑取TCBS培養(yǎng)基上形態(tài)一致的優(yōu)勢(shì)菌落，接種至TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)一步純化，純化后的菌株加入50%甘油溶液，混勻后冷凍保存于-80 ℃冰箱，菌株編號(hào)為：FHBX-1。

1.4 人工回歸感染試驗(yàn)及組織病理觀察

1.4.1 菌懸液的制備

挑取TSA培養(yǎng)基上分離株的單菌落接種至TSB液體培養(yǎng)基中，置于30 ℃恒溫?fù)u床(200 r/min)過(guò)夜培養(yǎng)，獲得菌懸液。高速離心菌懸液收集菌體，用無(wú)菌生理鹽水重懸，分光光度法測(cè)定菌液在OD下的吸光度值，確定菌液濃度。

1.4.2 人工感染試驗(yàn)

人工感染試驗(yàn)參照Tran浸泡感染法，將健康凡納濱對(duì)蝦隨機(jī)分成感染組、對(duì)照組，每組10尾，每組設(shè)置3個(gè)平行。感染組凡納濱對(duì)蝦浸泡于菌液終濃度為1.0×10CFU/mL的人工海水中(鹽度約15‰)，對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦浸泡于無(wú)菌人工海水中，浸泡15 min，將浸泡后感染組凡納濱對(duì)蝦撈出轉(zhuǎn)入菌液終濃度為1.0×10CFU/mL的10 L人工海水桶中，持續(xù)感染。對(duì)照組轉(zhuǎn)入10 L無(wú)菌人工海水桶中。試驗(yàn)周期為7 d，水溫控制在(28±1)℃，24 h充氧，每天正常投喂、吸污、換水，觀察凡納濱對(duì)蝦癥狀及統(tǒng)計(jì)7 d內(nèi)累計(jì)死亡率，并對(duì)患病凡納濱對(duì)蝦再次進(jìn)行病原菌分離鑒定。

1.4.3 組織病理觀察

取感染組患病瀕死凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織進(jìn)行病理切片觀察，以健康凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織作為對(duì)照組。用10%中性緩沖福爾馬林固定液固定48 h，再轉(zhuǎn)移到75%乙醇室溫保存，常規(guī)制備石蠟組織切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝胰腺組織病理變化。

1.5 病原菌鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)及生理生化特征鑒定

將分離株接種于TSA固體培養(yǎng)基上，置于30 ℃恒溫培養(yǎng)18 h，對(duì)平板上的菌落進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察以及革蘭氏染色，同時(shí)按照VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀操作步驟，對(duì)分離株進(jìn)行生理生化鑒定。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

取適量菌懸液，根據(jù)TaKaRa細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，提取分離株基因組DNA。以基因組DNA為模板，對(duì)分離株進(jìn)行16S rRNA、弧菌鑒定特異HSP60基因PCR檢測(cè)，檢測(cè)方法和引物序列參照相應(yīng)來(lái)源文獻(xiàn)，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系為25.0 μL，其中PCR Premix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，菌株基因組DNA模板2.0 μL，無(wú)菌雙蒸水8.5 μL，并設(shè)無(wú)菌雙蒸水為陰性對(duì)照模板。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析，并采用MEGAX 軟件中Neighbor-Joining法，基于HSP60基因比對(duì)結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，1 000次 Bootstrap重復(fù)檢驗(yàn)，對(duì)分離株進(jìn)行分子鑒定。

1.6 病原菌毒力基因的PCR檢測(cè)

以基因組DNA為模板，進(jìn)行菌株急性肝胰腺壞死病相關(guān)、以及副溶血弧菌的耐熱直接溶血毒素基因和相對(duì)耐熱直接溶血毒素基因的PCR檢測(cè)，檢測(cè)方法和引物序列參照相應(yīng)來(lái)源文獻(xiàn)，引物序列見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系同1.5.2PCR反應(yīng)體系進(jìn)行，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳(130 V,30 min)，凝膠成像系統(tǒng)下拍照記錄結(jié)果后，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)分析。

表1 引物序列

1.7 病原菌藥敏特性分析

采用(K-B)紙片擴(kuò)散法，測(cè)定分離株對(duì)18種抗菌藥物敏感性，參照美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(CLSL)抗生素敏感試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，分離菌株藥敏結(jié)果用S(敏感)、I(中介)、R(耐藥)進(jìn)行記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌分離結(jié)果

從患病凡納濱對(duì)蝦肝胰腺中分離獲得一株優(yōu)勢(shì)菌，命名為 FHBX-1。該菌株在 TCBS培養(yǎng)基上菌落呈綠色，圓形，中央略微隆起，直徑約2～3 mm；革蘭氏染色呈陰性，菌體呈稍微彎曲的桿狀(圖1)。

圖1 FHBX-1菌株的形態(tài)特征

2.2 病原菌的鑒定結(jié)果

由表2可知，菌株FHBX-1生理生化鑒定結(jié)果與副溶血弧菌對(duì)照菌株FJLV01生理生化特征基本一致，且VITEK2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定菌株FHBX-1為副溶血弧菌，可信度高達(dá)99%。基于16S rRNA基因序列在GenBank上進(jìn)行同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，該菌株與弧菌屬的副溶血弧菌、哈維氏弧菌、溶藻弧菌相似度超過(guò)98%，但菌種無(wú)法確定。進(jìn)一步基于弧菌鑒定特異60基因進(jìn)行序列比對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(shù)顯示，菌株FHBX-1與副溶血弧菌聚為一支，與副溶血弧菌NB1013株(GenBank登錄號(hào)：DQ279072.1)進(jìn)化關(guān)系最近(圖2)。綜合上述結(jié)果以及菌株形態(tài)學(xué)特征，可判定菌株FHBX-1為副溶血弧菌。

圖2 基于HSP60基因序列構(gòu)建的菌株FHBX-1與相近菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

表2 菌株FHBX-1的生理生化結(jié)果

2.3 人工回歸感染試驗(yàn)及組織病理觀察

人工回歸感染試驗(yàn)，感染組凡納濱對(duì)蝦在攻毒感染后出現(xiàn)肝胰腺萎縮、顏色變淺，空腸空胃，蝦體發(fā)白、變軟，攝食減少，活力萎靡等病癥與自然患病凡納濱對(duì)蝦病癥基本一致。感染組凡納濱對(duì)蝦在感染后第1 d已出現(xiàn)死亡情況，7 d內(nèi)累計(jì)死亡率為80%；對(duì)照組凡納濱對(duì)蝦攝食、活力均正常，未發(fā)生死亡情況。從感染組瀕死凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織再次分離的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌與菌株FHBX-1生理生化、分子生物學(xué)特征相同，由此判斷菌株FHBX-1是引起凡納濱對(duì)蝦發(fā)病死亡的病原菌。取感染組瀕死凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織進(jìn)行病理切片觀察，結(jié)果顯示：健康組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織肝小管結(jié)構(gòu)清晰，肝胰腺上皮細(xì)胞排列整齊，可以分辨出分泌細(xì)胞(B)、吸收細(xì)胞(R)及纖維細(xì)胞(F)(圖3A)。感染組凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織發(fā)生嚴(yán)重的病理變化，肝胰腺上皮細(xì)胞排列紊亂，肝小管管腔變大(圖3B)，肝胰腺上皮細(xì)胞脫落至管腔內(nèi)(圖3C)，細(xì)胞之間界限不清，無(wú)法辨認(rèn)出B、R、F細(xì)胞，肝小管結(jié)構(gòu)消失，僅見(jiàn)無(wú)結(jié)構(gòu)的組織團(tuán)(圖3D)，呈典型急性肝胰腺壞死病的病理特征。

圖3 健康凡納濱對(duì)蝦與患病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺組織病理特征

2.4 病原菌的毒力基因分析

參照HAN等、TEY等文獻(xiàn)方法以及水產(chǎn)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SC/T 7233-2020(急性肝胰腺壞死病診斷規(guī)程)的套式PCR方法，分離株FHBX-1毒力基因檢測(cè)結(jié)果如圖4所示，、以及&基因PCR擴(kuò)增結(jié)果為均為陽(yáng)性，條帶大小分別為284 bp、392 bp(圖4A)和230 bp(圖4B)，擴(kuò)增產(chǎn)物送生工測(cè)序，測(cè)序結(jié)果經(jīng)BLAST序列同源性比對(duì)分析結(jié)果顯示，分別與副溶血弧菌BpShHep18(GenBank登錄號(hào)：MH388411.1)的基因序列相似為98.41%、副溶血弧菌R13(GenBank登錄號(hào)：MK368635.1)的基因序列相似為96.18%、副溶血弧菌YH3(GenBank登錄號(hào)：MH718270.1)的&基因序列相似度為100%。但該分離株耐熱直接溶血毒素基因、相對(duì)耐熱直接溶血毒素基因PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陰性。

圖4 菌株FHBX-1毒力基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

A：健康凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺[肝細(xì)胞排列整齊，B-分泌細(xì)胞，F(xiàn)-纖維細(xì)胞，R-吸收細(xì)胞(箭頭)]；B：患病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺[箭頭示肝細(xì)胞排列紊亂，肝小管管腔變大]；C：患病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺[箭頭示肝胰腺上皮細(xì)胞脫落至管腔]；D：患病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺[箭頭示肝小管結(jié)構(gòu)消失，僅見(jiàn)無(wú)結(jié)構(gòu)的組織團(tuán)]。

2.5 病原菌的藥敏特征

菌株FHBX-1對(duì)18種抗菌藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果如表3所示，菌株FHBX-1對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等11種抗菌藥物敏感，對(duì)新霉素、紅霉素2種抗生素中介，而對(duì)鏈霉素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺甲噁唑等5種抗菌藥物耐藥。

表3 菌株FHBX-1藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病于2009年首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)，隨后在越南、馬來(lái)西亞、墨西哥等對(duì)蝦主要養(yǎng)殖國(guó)家也陸續(xù)暴發(fā)，每年造成全球?qū)ξr養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)十億美元以上，該病已成為阻礙對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)健康發(fā)展的主要細(xì)菌性疾病。相關(guān)研究顯示，急性肝胰腺壞死病的致病菌包括副溶血弧菌、哈維氏弧菌、歐文斯氏弧菌等。本研究從上海市奉賢區(qū)疑似患急性肝胰腺壞死病的凡納濱對(duì)蝦肝胰腺組織分離出一株優(yōu)勢(shì)菌株，經(jīng)菌株形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)鑒定確定了該菌株為副溶血弧菌?；?6S rRNA、60基因序列的分析鑒定，表明60基因在弧菌屬細(xì)菌具相對(duì)的保守性、又有一定種間變異性的特點(diǎn)，較16S rRNA更適合區(qū)分鑒定高相似度弧菌種間的聚類分析。

副溶血弧菌已是我國(guó)首要的食源性致病菌，能引起人類急性腹瀉、嘔吐、敗血癥等食物中毒病癥，其、基因常作為人源致病性副溶血弧菌毒力的檢測(cè)靶標(biāo)基因。本研究分離株FHBX-1的、基因PCR檢測(cè)結(jié)果均為陰性，與余達(dá)勇等在浙江臺(tái)州分離獲得的急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌株HY3檢測(cè)結(jié)果一致。目前國(guó)內(nèi)鮮見(jiàn)水產(chǎn)蝦源副溶血弧菌、基因陽(yáng)性樣品，但國(guó)外學(xué)者SUJEEWA等、RAHIMI等已陸續(xù)發(fā)現(xiàn)蝦源副溶血弧菌、基因陽(yáng)性的菌株。因此，水產(chǎn)蝦源副溶血弧菌、基因攜帶情況仍需持續(xù)關(guān)注，以便準(zhǔn)確評(píng)估人與蝦共患病的潛在風(fēng)險(xiǎn)。

本研究分離株FHBX-1急性肝胰腺壞死病相關(guān)的毒力基因、的 PCR擴(kuò)增結(jié)果均為陽(yáng)性，在菌液濃度為1.0×10CFU/mL人工浸泡感染試驗(yàn)中，感染組凡納濱對(duì)蝦7 d內(nèi)累計(jì)死亡率為80%，這與林楠在福州分離獲得的對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病致病性副溶血弧菌株FJLV01的試驗(yàn)結(jié)果類似，而與賈丹等從山東濰坊分離獲得的副溶血弧菌株20160303005-1相比毒力較弱。感染組瀕死凡納濱對(duì)蝦出現(xiàn)明顯的甲殼變軟，空腸空胃，肝胰腺萎縮等癥狀，且組織病理觀察發(fā)現(xiàn)肝胰腺上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落，肝小管崩塌,與侯巧利等在舟山觀察患急性肝胰腺壞死病凡納濱對(duì)蝦的肝胰腺組織的病理變化相似，呈典型的急性肝胰腺壞死病的病理學(xué)特征。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，本研究分離到的副溶血弧菌FHBX-1對(duì)凡納濱對(duì)蝦有較強(qiáng)的致病力，是引起上海奉賢某對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)凡納濱對(duì)蝦大量死亡的致病菌。

本研究分離株FHBX-1對(duì)氟苯尼考、多西環(huán)素、恩諾沙星、頭孢他啶、復(fù)方新諾明等11種抗菌藥物敏感，而對(duì)鏈霉素、慶大霉素、氨芐西林、磺胺甲噁唑等5種抗菌藥物耐藥，這與賈丹等分離獲得的凡納濱對(duì)蝦源副溶血弧菌株20160303005-1對(duì)慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素等抗菌藥物敏感，但對(duì)阿莫西林、復(fù)方新諾明等抗菌藥物耐藥試驗(yàn)結(jié)果存在明顯差異；與DONG等分離獲得的對(duì)蝦源副溶血弧菌株Vp2S01對(duì)環(huán)丙沙星、頭孢曲松、諾氟沙星、呋喃妥因等17種抗菌藥物耐藥或中介，僅對(duì)氟苯尼考敏感也有不同，說(shuō)明凡納濱對(duì)蝦源副溶血弧菌不同菌株之間藥敏特性存在差異。因此，養(yǎng)殖中對(duì)凡納濱對(duì)蝦急性肝胰腺壞死病進(jìn)行藥物防治時(shí)需先進(jìn)行藥物敏性篩選試驗(yàn)，選擇最敏感的藥物治療，以提高疾病的防治效果，避免藥物的過(guò)量濫用情況。此外，由于急性肝胰腺壞死病在國(guó)內(nèi)對(duì)蝦養(yǎng)殖場(chǎng)頻頻暴發(fā)且有持續(xù)流行和擴(kuò)大趨勢(shì)，建議養(yǎng)殖戶購(gòu)苗時(shí)做好該病篩查，盡量選購(gòu)無(wú)特定病原體的SPF蝦苗，為養(yǎng)殖后期的穩(wěn)產(chǎn)穩(wěn)收提供基礎(chǔ)保障。