徐紅斌, 張申平, 杜茹蕓, 周 靜, 翁史昱

(上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院,國家市場監(jiān)管重點實驗室(乳及乳制品檢測與監(jiān)控技術(shù)),上海 200233)

近年來,人們對保健食品的需求與日俱增,尤其是減肥和壯陽類產(chǎn)品格外受到人們的青睞,然而該類產(chǎn)品檢出非法添加藥物的情況屢見不鮮。不法商家為了達到產(chǎn)品宣稱的保健功效,在產(chǎn)品中超量、超范圍添加處方藥及其類似物或者衍生物,給消費者的身體健康造成了隱患。為嚴厲打擊非法添加行為、保護消費者身體健康,需要開發(fā)快速準確的檢測方法用于減肥及壯陽類非法添加藥物的檢測。

目前常用的非法添加檢驗方法主要有薄層色譜法[1-3]、液相色譜法[4-6]、常規(guī)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7-9],這些方法大都存在選擇性差、干擾多、定性不準確等缺點。作為質(zhì)譜分析器的突破性技術(shù),Orbitrap通過靜電場軌道阱的方式提供高分辨率及精確離子質(zhì)量數(shù),最高分辨率可達240 000 FWHM (full width at half maxima)以上。目前已有報道使用超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質(zhì)譜對保健食品中非法添加藥物進行檢測。譚會潔等[10]報道了保健食品中15種減肥類化合物的超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜篩查方法,建立了篩查數(shù)據(jù)庫,采用Hypersil gold C18色譜柱分離,正負離子模式同時掃描,回收率達到79.7%～95.4%,但未就數(shù)據(jù)庫應用時各項參數(shù)的意義進行說明。黃澤瑋等[11]建立了基于超高效液相色譜-Orbitrap-Elite高分辨質(zhì)譜的快速篩查及確證減肥及壯陽類保健食品和中成藥中54種非法添加物的方法,采用Hypersil gold C18色譜柱在28 min內(nèi)完成54種目標化合物的分離,全掃描/數(shù)據(jù)依賴的二級掃描(Full MS/dd-MS2)模式完成高精度一級、二級質(zhì)譜信息采集,但在建立數(shù)據(jù)庫時僅涉及正離子模式。洪燈等[12]針對不法商家用非法添加藥物的類似物來規(guī)避法定方法檢測的現(xiàn)象,開展了超高效液相色譜-Orbitrap高分辨質(zhì)譜法篩查保健食品中西布曲明及其衍生物的檢測方法,定量限為25 μg/kg,加標回收率為93.5%～103.5%,但標準曲線線性范圍僅為0.5～20 μg/L,對于高濃度的檢出值需要多次稀釋至標準曲線濃度中值附近進行測定,容易引入不確定度因子。我國現(xiàn)行的保健食品中非法添加藥物的檢測方法有BJS 201710《保健食品中75種非法添加化學藥物的檢測》和BJS 201805《食品中那非類物質(zhì)的測定》,覆蓋了絕大部分可能的非法添加藥物,但隨著藥物研發(fā)的推進,非法添加藥物的衍生物及類似物日益增多,也應將其納入檢測范圍。

本文將Orbitrap高分辨質(zhì)譜用于減肥及壯陽類保健食品中32種非法添加藥物的快速篩查及確證,在對比正負離子模式下各化合物響應強度的基礎(chǔ)上建立了高分辨質(zhì)譜信息庫,總結(jié)了數(shù)據(jù)庫建立及篩查數(shù)據(jù)分析的要點,對提取溶劑、色譜柱溫度等實驗條件進行了詳細探究,盡可能給出了較寬的標準曲線線性范圍。通過Full MS/dd-MS2模式,在17 min內(nèi)完成了目標物的分離和碎片離子質(zhì)量數(shù)的采集,并通過TraceFinder軟件完成數(shù)據(jù)分析。本方法具有快速、準確、靈敏度高的特點,有助于打擊保健食品的非法添加行為。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

Thermo Q Exactive PLUS超高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)包括vanquish VF-P10-A液相色譜系統(tǒng)及Orbitrap高分辨質(zhì)譜;Xcalibur 4.3軟件用于質(zhì)譜儀器控制及數(shù)據(jù)采集;TraceFinder 5.0軟件用于數(shù)據(jù)分析;電子天平(感量0.1 mg,MS204S,德國Mettler Toledo公司);離心機(Centrifuge 5804);渦旋振蕩器(Reax Control,德國Heidolph);超純水器(美國Millipore)。

大黃素(emodin,純度>98.0%)、他達拉非甲基氯化物(chlorpretadalafil,純度>98.0%)以及其余30種非法添加藥物對照品溶液(100 mg/L,甲醇)購自上海普譽科貿(mào)有限公司。HPLC級甲醇(純度>99.9%)購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司,HPLC級乙醇(純度>99.9%)購自默克股份兩合公司,甲酸(分析純)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

48份保健食品(片劑、硬膠囊、粉劑、口服液、酒類)來自上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院監(jiān)督抽樣。樣品種類包括靈芝孢子粉、氨基酸口服液、保健酒類、西洋參含片及膠囊,基質(zhì)成分較為復雜,主要成分為天然成分、羧甲基纖維素鈉、淀粉、蔗糖、葡萄糖。陰性樣品均屬于監(jiān)督抽檢項目中按照國家標準方法未檢出的樣品,隨機挑選未檢出的片劑、粉劑、硬膠囊(內(nèi)容物)樣品混合均勻,作為陰性固體樣品基質(zhì);挑選未檢出的口服液、酒類樣品混合均勻,作為陰性液體樣品基質(zhì)。

1.2 對照品溶液的配制

稱取適量大黃素和他達拉非甲基氯化物對照品,分別用乙醇和50%(v/v,下同)甲醇水溶液配制成1 000 mg/L的儲備液,再分別用甲醇稀釋至100 mg/L;分別取32種對照品溶液,以甲醇稀釋為5 mg/L的混合對照品溶液Ⅰ,再以甲醇稀釋為500 μg/L的混合對照溶液Ⅱ。上述溶液均保存在-20 ℃冰箱,臨用前取出恢復至室溫。

取混合對照品溶液Ⅱ,以陰性基質(zhì)提取液逐級稀釋為1.0、2.0、5.0、10.0、50.0、100.0、200.0 μg/L的系列對照品標準溶液。

1.3 供試品溶液的制備

片劑研細后備用,硬膠囊取內(nèi)容物粉末備用,粉劑、口服液、酒類可直接稱取。精密稱定0.5 g樣品置于15 mL具塞離心管中,加入10 mL 50%甲醇水溶液,振蕩混合均勻,25 ℃下恒溫超聲提取15 min,超聲功率53 kHz,于5 000 r/min離心2 min,上清液過0.22 μm微孔濾膜,濾液即為供試品溶液。對于濃度超過標準曲線上限的待測液,需用50%甲醇水溶液適當稀釋后再次測定。

1.4 儀器條件

1.4.1色譜

色譜柱為Thermo Hypersil gold vanquish (100 mm×2.1 mm,1.9 μm),柱溫:25 ℃,流速:0.3 mL/min,流動相A:0.1%甲酸水溶液,流動相B:0.1%甲酸乙腈溶液,梯度洗脫程序:0～2 min,10%B;2～8 min,10%B～90%B;8～10 min,90%B;10～11 min,90%B～10%B;11～14 min,10%B。進樣量:5 μL。

1.4.2質(zhì)譜

離子源:可加熱電噴霧離子源(HESI);離子源溫度:325 ℃;噴霧電壓:3.50 kV(正離子模式),2.8 kV(負離子模式);透鏡電壓:50.0 V;鞘氣流速:40 arb;輔助氣流速:10 arb;輔助氣溫度:350 ℃;掃描模式:Full MS/dd-MS2;采集范圍:m/z100.0～1 000.0;一級質(zhì)譜分辨率為70 000 FWHM;自動增益控制目標離子數(shù)(AGC target):1×106;C-trap最大注入時間:200 ms;二級質(zhì)譜分辨率17 500 FWHM;AGC target:2×105;C-trap最大注入時間:60 ms;歸一化碰撞能(NCE):20%/40%/60%;動態(tài)排除:8.0 s。各個化合物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 32種化合物的UHPLC-HRMS分析參數(shù)Table 1 UHPLC-HRMS parameters for the 32 compounds

表1 (續(xù))Table 1 (Continued)

1.4.3定性篩查條件

目標峰面積閾值設(shè)置為50 000,以排除部分雜峰的影響,減少篩查時間,信噪比閾值設(shè)置為10,精確質(zhì)量數(shù)偏差設(shè)置為5×10-6;保留時間的判定模式設(shè)置為confirm,保留時間窗口寬度為30 s;碎片離子判定模式設(shè)置為confirm,最小匹配度為1個碎片離子,碎片離子強度閾值為5 000,碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5;同位素篩查可作為目標峰的補充篩查信息,啟用時判定模式為confirm,匹配度閾值為90%,質(zhì)量數(shù)偏差為1×10-5,強度偏差為20%。

2 結(jié)果與討論

2.1 實驗條件考察

參考相關(guān)文獻[10,12],分別考察了甲醇、乙腈、50%甲醇水溶液、50%乙腈水溶液對基質(zhì)加標樣品中32種化合物的超聲提取效果。結(jié)果表明,以50%甲醇水溶液進行提取,32種化合物在固體基質(zhì)和液體基質(zhì)中的回收率均高于其他3種提取溶劑,其中那非乙酰酸在3個水平(0.2、0.6、1.0 mg/kg)下的加標回收率平均值分別由42.8%、52.1%、66.7%提高到70.2%、88.3%、92.4%,苯佐卡因的加標回收率平均值由34.1%、39.4%、48.4%提高到78.6%、91.2%、109.3%,氯卡色林的加標回收率平均值由36.3%、49.5%、64.6%提高到76.1%、88.5%、94.4%。將超聲處理時間由15 min延長至20 min,提取效果沒有明顯增加?？紤]到節(jié)省樣品前處理時間,本實驗選擇50%甲醇水溶液作為提取溶劑,超聲提取15 min。

為選擇合適的流動相,本實驗對比了0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水、10 mmol/L乙酸銨乙腈-0.1%甲酸水和0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水作為流動相時的分離效果。結(jié)果表明,0.1%甲酸甲醇-0.1%甲酸水流動相體系中,去乙基伐地那非、去甲基西地那非、羥基伐地那非均在7.27 min出峰,未能完全分開;10 mmol/L乙酸銨乙腈-0.1%甲酸水體系中,去甲他達拉非、羥基硫代豪莫西地那非的響應值降低1個數(shù)量級,苯佐卡因的響應值降低2個數(shù)量級。相比而言,0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水體系可獲得最佳的色譜峰形和分離效果,不同化合物在合適的正負離子模式下均能獲得較高的響應值。

柱溫對分離效果也有一定的影響,分別考察了25、30、35 ℃下的分離情況,發(fā)現(xiàn)提高柱溫至35 ℃時,去甲基硫代西地那非在其保留時間附近存在干擾峰,影響峰積分,同時各化合物保留時間減小,如達泊西汀的保留時間由6.67 min前移至6.61 min,保留時間整體偏移較小,在30 s的保留時間判定窗口中仍可實現(xiàn)目標峰的判定。另外部分化合物出現(xiàn)了多次保留的情況,如鹽酸N,N-雙去甲基西布曲明在6.30 min和6.59 min出現(xiàn)了兩次保留,烏地那非在5.80 min和6.16 min出現(xiàn)了兩次保留。相比而言,25 ℃柱溫下,各化合物峰形對稱,去甲基硫代西地那非與基質(zhì)中的干擾物質(zhì)可完全分離,有利于峰積分。因此確定最佳柱溫為25 ℃。

綜上,最終確定了1.4節(jié)的色譜條件,加標量為1.0 mg/kg的陰性樣品提取液(供試品溶液質(zhì)量濃度50 μg/L)中各目標化合物的提取離子色譜圖見圖1。在現(xiàn)有色譜條件下,氫氯噻嗪、羥基伐地那非、去乙基紅地那非保留時間在3～6 min內(nèi)的峰形并不是非常理想,這是因為供試品溶液的溶劑(50%甲醇水)與流動相(0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水)不一致而產(chǎn)生了輕微的溶劑效應,但其余29種化合物峰形良好、基線干凈。為了探究該現(xiàn)象是否會影響低濃度下這3種化合物的定性定量檢測,調(diào)整供試品溶液的濃度為10 μg/L(基質(zhì)加標水平0.2 mg/kg),測試結(jié)果表明這3種化合物的響應很強,峰面積在3×106～6×106之間,且在保留時間附近的基線非常干凈,說明輕微的溶劑效應并不影響低濃度下這3種化合物定性和定量檢測的準確性。

2.2 基質(zhì)效應

固體基質(zhì)包括靈芝孢子粉、西洋參含片及硬膠囊,主要成分是天然成分、羧甲基纖維素鈉、淀粉、蔗糖,液體基質(zhì)包括氨基酸口服液及酒類,主要成分為糖類、氨基酸,這些成分會干擾目標化合物的分離和檢測[13-15]。以基質(zhì)匹配標準工作曲線的斜率與純?nèi)軇藴使ぷ髑€的斜率的比值考察基質(zhì)效應(matrix effect,ME),ME值小于0.80或者大于1.10,存在強基質(zhì)效應,反之基質(zhì)效應較弱。結(jié)果表明32種化合物在固體基質(zhì)中的ME值為0.61～0.95,其中硫代豪莫西地那非、去甲基硫代西地那非、他達拉非甲基氯化物的ME值較低,分別為0.61、0.70、0.63;在液體基質(zhì)中的ME值為0.73～1.09,其中羥基紅地那非、硫代豪莫西地那非的ME值為0.73、0.75;可見部分化合物在兩種基質(zhì)中存在不同程度的基質(zhì)效應,因此分別使用固體陰性基質(zhì)和液體陰性基質(zhì)提取液配制系列混合標準溶液,降低基質(zhì)效應。

2.3 方法學考察

2.3.1線性范圍和檢出限

分別將兩種基質(zhì)提取液配制的系列混合標準溶液在最優(yōu)條件下進樣,每個濃度平行測定3次,以平均峰面積(y)對其質(zhì)量濃度(x,μg/L)繪制標準曲線,得到相關(guān)系數(shù)(r2)。所有的化合物在合適的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,r2均大于0.99。在空白基質(zhì)樣品中進行低濃度加標試驗,計算信噪比,當供試品溶液的質(zhì)量濃度為1 μg/L時(氯噻酮、去甲基硫代西地那非供試品溶液質(zhì)量濃度為2 μg/L),有23種化合物的信噪比顯示為“INF”,其余9種化合物的信噪比在50～240之間。若以3倍信噪比(S/N=3)對應的濃度計算檢出限,則該值遠低于現(xiàn)有值,不具備實際意義,因此本研究以1 μg/L計算檢出限,結(jié)果見表2。標準曲線線性范圍最低點為5 μg/L,最高濃度點根據(jù)化合物不同而分別為200、500 μg/L;液體樣品中32種化合物的檢出限為0.02 mg/kg,固體樣品中29種化合物的檢出限為0.02 mg/kg,氯噻酮、去甲基硫代西地那非和烏地那非的檢出限為0.04 mg/kg。以標準曲線最低濃度點計算定量限為0.1 mg/kg。

表2 32種化合物的線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢出限Table 2 Linear equations,linear ranges,correlation coefficients (r2),and LODs of the 32 compounds

2.3.2重復性

各取6份固體基質(zhì)和液體基質(zhì)進行加標試驗,加標水平為0.2 mg/kg,每份樣品平行測定3次,取結(jié)果平均值計算相對標準偏差(RSD),考察重復性。結(jié)果表明32種化合物峰面積的RSD為0.35%～3.1%,均小于5%,說明該測定方法重復性良好。

2.3.3精密度

取一份加標樣品溶液在一日內(nèi)的不同時間點(共6個時間點,間隔4 h)測定,計算RSD值,記為日內(nèi)精密度;在不同日期(連續(xù)5 d內(nèi)的同一時間)測定,計算RSD值,記為日間精密度。32種化合物的日內(nèi)精密度均小于6.5%,日間精密度均小于10%,說明測試方法精密度良好。

2.3.4穩(wěn)定性

按照1.2節(jié)和1.3節(jié)分別制備對照品溶液和樣品溶液,同一份對照品溶液和陽性樣品溶液在0、2、4、6、8 h進樣,計算RSD值,考察穩(wěn)定性。標準溶液中32種化合物的峰面積RSD為0.42%～2.7%,均小于3%,表明32種化合物在測定時間8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。大黃素陽性樣品溶液在8 h內(nèi)進樣5次，大黃素峰面積的RSD為1.4%，說明樣品提取液在測定時間內(nèi)非常穩(wěn)定。

2.3.5回收率

精密稱取兩種陰性基質(zhì),分別加入5 mg/L的混合標準儲備液20、60、100 μL,按照1.3節(jié)的方法進行樣品處理,對應的加標水平為0.2、0.6、1.0 mg/kg。平行測定6次,計算回收率平均值和RSD,結(jié)果見表3。結(jié)果表明,固體基質(zhì)中除達泊西汀、羥基硫代豪莫西地那非、硫代豪莫西地那非、硫代西地那非、去甲基硫代西地那非的回收率較低外,其余27種化合物的回收率為50.5%～84.5%,RSD為1.2%～13%,液體基質(zhì)中32種化合物的回收率范圍為60.4%～109.3%,RSD為0.77%～8.2%。

表3 不同陰性基質(zhì)中3個添加水平下的32種化合物的回收率及相對標準偏差(n=6)Table 3 Recoveries and RSDs of the 32 compounds spiked in different blank samples at three levels (n=6)

總體而言,固體基質(zhì)加標樣品中32種化合物在3個加標濃度下的回收率略低于液體基質(zhì)加標樣品,可能是因為固體樣品在50%甲醇水提取液中存在不溶物,產(chǎn)生的吸附作用造成提取不徹底。這就導致即使采用了基質(zhì)匹配標準曲線進行定量,部分化合物回收率依然較低的情況。如硫代豪莫西地那非在固體基質(zhì)中的回收率為23.4%～49.8%,低于液體基質(zhì)的回收率64.9%～88.5%,但其在兩種基質(zhì)中的檢出限均能達到0.02 mg/kg,即當供試品溶液質(zhì)量濃度低至1 μg/L時,連續(xù)3針進樣都能保證準確定性。另外藥物非法添加的濃度均較高[10,14-18],綜合考慮本方法的檢出限和回收率能滿足定性篩查的需要。

2.4 建立HRMS數(shù)據(jù)庫及篩查方法

分別以50%甲醇水溶液稀釋對照品溶液,得到2 mg/L或5 mg/L的32種化合物標準溶液,采用單針進樣的方式分別在正負離子模式下進行Full MS/dd-MS2掃描,對比響應強度,選擇合適的掃描模式、離子碎片精確質(zhì)量數(shù),在TraceFinder軟件中輸入至method development→compound database文件(.cdb)中。其中,高分辨一級質(zhì)譜圖用于化合物的篩查、鑒定和定量,二級質(zhì)譜圖用于化合物的確認。

調(diào)用上述.cdb文件,建立screening master method用于快速篩查定性,篩查條件的設(shè)置同1.4.3節(jié)。調(diào)用上述.cdb文件,建立quan master method用于陽性樣品定量。關(guān)聯(lián)較高濃度混合標準溶液的.raw文件(較高濃度以方便找到對應的化合物峰位置),確定陽性檢出化合物的峰積分時間窗口、峰平滑點數(shù),設(shè)置標準曲線類型為外標法,指定標準曲線點數(shù)和對應的濃度值,上述操作可批量進行。當目標峰、保留時間、碎片離子、同位素豐度比的篩查條件都通過時,TraceFinder軟件的分析結(jié)果顯示flag為綠燈,則可認為該化合物呈陽性。

本研究對TraceFinder軟件篩查條件設(shè)置相關(guān)經(jīng)驗進行了總結(jié),如下:保留時間是篩查分析中除了質(zhì)量精度之外最重要的參數(shù),其提供的是與質(zhì)譜正交維度的信息,尤其對痕量物質(zhì)的篩查至關(guān)重要。當自建數(shù)據(jù)庫中的保留時間與樣品采集方法相匹配時,建議將保留時間作為篩查條件。關(guān)于匹配模式的選擇,選擇identify時,意味著保留時間是化合物確證的必要條件,若此條件不滿足要求,則不進行后續(xù)碎片離子和同位素豐度比的篩查;若選擇confirm,意味著保留時間是化合物確證的一個可選條件,若此條件不滿足要求,還是需要進行后續(xù)其他條件的匹配,比如碎片離子、同位素信息等。同位素信息在高分辨質(zhì)譜中非常重要,是對一級精確質(zhì)量數(shù)的有效補充,建議啟用,但應考慮到目標物在復雜基質(zhì)中含量很低時,同位素豐度比會更低,可能會影響同位素的匹配。另外在碎片離子的判定中,若在TraceFinder軟件的篩查結(jié)果中未看到化合物碎片離子的判定結(jié)果,但在數(shù)據(jù)瀏覽器中可提取到碎片離子信息,則可將篩查條件中碎片離子的強度閾值進一步降低,查找相應的碎片離子信息。

2.5 實際樣品檢測

將Xcalibur軟件采集的.raw原始數(shù)據(jù)文件導入至TraceFinder軟件,調(diào)用screening master method進行快速定性篩查,同步采用外標標準曲線進行32種化合物的定量分析。

在48份樣品中只有1份某公司生產(chǎn)的減肥茶檢出大黃素成分,檢出率2.08%，檢出含量平均值為0.37 mg/kg。查配料表發(fā)現(xiàn)該樣品含有決明子,而決明子富含大黃酚、大黃素、決明素[19],加之檢出濃度較低,可認為大黃素為內(nèi)源性成分,并非非法添加。陽性樣品中大黃素的提取離子色譜圖、一級全掃描質(zhì)譜圖、二級質(zhì)譜圖及數(shù)據(jù)庫對比圖見圖2、圖3。大黃素的[M-H]-離子實測保留時間和理論保留時間偏差為0 s,一級質(zhì)譜精確質(zhì)量數(shù)實測值與理論值偏差為-1.08×10-6,兩個二級碎片離子質(zhì)量數(shù)偏差分別為5.11×10-6和0.9×10-6,上述結(jié)果均符合篩查方法中設(shè)置的控制條件,對應的篩查結(jié)果標記為綠燈,最終flag為綠燈,表明分析軟件判定該樣品中檢出了大黃素。基于flag的標記情況,使用該HRMS數(shù)據(jù)庫和篩查方法可進行快速篩查,嚴格的篩查條件降低了假陰性和假陽性的概率。

圖2 陽性樣品中大黃素的提取離子色譜圖和全掃描質(zhì)譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram and full scan mass spectrum of emodin positive sample

圖3 大黃素陽性樣品的二級質(zhì)譜圖及其TraceFinder數(shù)據(jù)庫譜圖Fig.3 MS2 spectra of emodin in positive sample and TraceFinder database

3 結(jié)論

本研究基于實際檢測工作需要建立了減肥和壯陽類保健食品中非法添加藥物的快速篩查和確證方法,依靠TraceFinder軟件建立的高分辨數(shù)據(jù)庫,完成了快速定性篩查和定量分析,總結(jié)了數(shù)據(jù)庫應用過程中的要點。本方法樣品前處理簡單,靈敏度高,篩查分析準確,自動化程度高,適用于同時篩查和測定減肥和壯陽類保健食品中的非法添加藥物,具有很好的實際應用價值,已應用于日常檢測工作。后續(xù)研究中在增加可篩查非法添加藥物數(shù)量的同時應兼顧峰形和響應強度,同時繼續(xù)深入研究基質(zhì)效應對非法添加藥物篩查的影響規(guī)律。