耿 琦，叢 軍

上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院，上海 200021

腸易激綜合征（irritable bowel syndrome，IBS）是一種功能性腸病，臨床以反復(fù)發(fā)作的腹痛，伴排便頻次或大便性狀改變?yōu)橹饕憩F(xiàn)［1］。據(jù)一項(xiàng)來自Rome 委員會(huì)的系統(tǒng)綜述（包含83 項(xiàng)研究，涉及41 個(gè)國(guó)家）顯示，全球IBS 的總體患病率為8.8%，亞洲患病率為9.6%，占消化科門診的25%～50%，每年發(fā)生的直接醫(yī)療費(fèi)用為13.5 億美元，間接花費(fèi)為2.05 千萬美元［2-3］。腹痛是IBS 患者最為常見的不適主訴，內(nèi)臟感覺高敏則是IBS 的一項(xiàng)重要病理生理學(xué)征候，其發(fā)生機(jī)理目前尚不十分明確［4］。而目前治療內(nèi)臟疼痛的藥物有限，針對(duì)軀體疼痛治療的藥物副作用大，因此對(duì)內(nèi)臟痛敏神經(jīng)生理機(jī)制的研究，將有助于尋找新的治療靶點(diǎn)。

腸吉泰是全國(guó)名中醫(yī)蔡淦教授治療IBS 的經(jīng)驗(yàn)方，具有疏肝健脾、緩急止瀉的功效。前期RCT臨床研究結(jié)果表明，腸吉泰對(duì)鎮(zhèn)痛止瀉有效，對(duì)改善患者糞便性狀、減少每天排便次數(shù)、減輕急迫癥狀、減輕腹脹程度均有較為顯著的治療作用［5］。我們經(jīng)過更進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)［6-7］，腸吉泰方可以減少IBS 內(nèi)臟高敏感模型大鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)目，從而有效控制肥大細(xì)胞受P 物質(zhì)刺激后的脫顆粒狀態(tài)；使得IBS 模型大鼠結(jié)腸黏膜TRPV1 mRNA 的表達(dá)降低，改善內(nèi)臟痛覺敏感。近年來國(guó)內(nèi)外研究表明，PAR2、PKCε是TRPV1敏化介導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感性的關(guān)鍵之一，為了深入研究?jī)?nèi)臟高敏感IBS 模型大鼠鎮(zhèn)痛作用機(jī)制，本研究擬從PAR2、PKCε 蛋白的變化角度，觀察腸吉泰對(duì)內(nèi)臟高敏感IBS大鼠鎮(zhèn)痛作用的療效。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性新生SD 大鼠，SPF 級(jí)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK（2017-0005）。每籠飼養(yǎng)10 只新生大鼠和1只哺乳期母鼠。大鼠出生后第35天與母鼠分離并分籠飼養(yǎng)，每籠5只。

1.2 藥物及儀器腸吉泰（藥物組成：炒白術(shù)、白芍、陳皮、防風(fēng)、烏梅、甘草等），由曙光醫(yī)院中藥制劑中心采用水提法制成濃度為0.423 g/mL 的溶液。TRPV1 阻 斷 劑capsazepine（美 國(guó)abcam，批號(hào)：ab120025）。PAR2 抗體（1∶1000，Abcam，批號(hào)：ab180953），p-TRPV1 抗體（1∶1000，Abnova，批號(hào)：PAB8499），TRPV1 抗 體（1∶1000，NOVUS，批 號(hào)：NB100-1617），PKCε 抗 體（CST，批 號(hào)：2683，1∶1000）。酶標(biāo)儀（MK3，THERMO 公司）；thiss-24 型組織碾磨儀（上海凈信）；MIKRO220R 型低溫高速離心機(jī)（Hettich 公司）；DNP9082 型恒溫孵育箱（精宏公司）；MDF-382 型-80℃冰箱（Panasonic 公司）；1658033 型電泳儀（美國(guó)伯樂）；IMS-25 型制冰機(jī)（常熟雪科）；ChemiQ4600 型熒光化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)（上海勤翔儀器公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分組及造模 新生大鼠40 只，按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組和腸吉泰組，每組10 只。參照Alchaer 直腸醋酸刺激法制造IBS 模型［8］：乳鼠在出生第8 天即采用直腸內(nèi)注入醋酸的方法進(jìn)行刺激，使用冰醋酸配置0.5%的醋酸溶液，以連續(xù)硬膜外導(dǎo)管連接注射器經(jīng)石蠟油潤(rùn)滑插入大鼠肛門直腸2 cm，緩慢注入0.5%醋酸溶液1 mL，保留20 s。除空白組外，其余3組大鼠連續(xù)造模14天。

1.3.2 給藥方法 造模期間陽性對(duì)照組大鼠給予腹腔注射Capsazepine（2 mg/kg，醋酸刺激前30 min），其余各組除空白組外均給予相同體積的溶劑腹腔注射。從第8 周開始，腸吉泰組按0.423 g/（mL·d）的劑量給予腸吉泰中藥灌胃，其他組每日予以等量去離子水灌胃，持續(xù)灌胃4周。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 檢測(cè)大鼠腸道敏感性 采用結(jié)直腸氣囊擴(kuò)張法行腸道敏感性評(píng)估。用異氟烷氣麻后，將氣囊用甘油潤(rùn)滑后經(jīng)肛門插入約5 cm，用膠布把導(dǎo)管與鼠尾固定，置透明器具內(nèi)，大鼠不能轉(zhuǎn)身，但不影響抬腹等動(dòng)作。待大鼠蘇醒適應(yīng)10 min 后，進(jìn)行腸道擴(kuò)張檢測(cè)，壓力分別為20、40、60、80 mm Hg（1 mm Hg≈0.133 kPa），每次持續(xù)20 s，通過觀察大鼠腹壁反射（abdominal withdrawal reflex，AWR）情況評(píng)估各組大鼠的腸道敏感性，并記錄評(píng)分。對(duì)每一壓力值都重復(fù)進(jìn)行3次擴(kuò)張，每次擴(kuò)張間隔4 min，取3次測(cè)量所得壓力值的均數(shù)作為檢測(cè)值。

1.4.2 檢測(cè)大鼠結(jié)腸黏膜組織PAR2、PKCεTRPV1、p-TRPV1表達(dá)值 取結(jié)腸黏膜組織加入含蛋白酶等抑制劑的裂解液經(jīng)組織碾磨儀碾磨后提取總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度，蛋白變性，經(jīng)凝膠電泳（SDS-PAGE）分離目的蛋白，濕轉(zhuǎn)后，用TBST 溶液清洗后封閉2 h，加入一抗，4℃孵育過夜，加入二抗室溫下孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光顯色后置于凝膠成像儀中分析蛋白表達(dá)情況，采用Image 軟件評(píng)估各個(gè)蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料采用xˉ±s表示，組間變量比較采用單因素方差分析，經(jīng)正態(tài)分布檢驗(yàn)，如果方差齊者采用LSD法，方差不齊者采用Tamhane’s T2法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠內(nèi)臟敏感性當(dāng)氣囊壓力為40、60 mm Hg時(shí)，模型對(duì)照組大鼠AWR 評(píng)分較空白組明顯升高（P＜0.01），提示內(nèi)臟敏感性升高；腸吉泰組和陽性對(duì)照組AWR 評(píng)分與模型對(duì)照組比較均明顯降低（P＜0.05）。腸吉泰組AWR 評(píng)分與陽性對(duì)照組無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠AWR評(píng)分比較（±s） 分

表1 各組大鼠AWR評(píng)分比較（±s） 分

注：空白組比較，*表示P＜0.05，**表示P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，△表示P＜0.05，△△表示P＜0.01

組別空白組模型對(duì)照組陽性對(duì)照組腸吉泰組鼠數(shù)10 10 10 10氣囊壓20 mm Hg 0.500±0.527 0.800±0.789 0.600±0.699 0.800±0.789 40 mm Hg 1.700±0.675 2.800±0.632**2.000±0.816△1.800±0.632△△60 mm Hg 2.700±0.675 3.800±0.422**3.000±0.816△△3.100±0.568△80 mm Hg 3.500±0.527 3.900±0.316 3.700±0.483 3.900±0.316

2.2 大鼠結(jié)腸黏膜組織PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表達(dá)與空白組比較，模型對(duì)照組PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表達(dá)顯著升高（P＜0.05）。與模型對(duì)照組比較，陽性對(duì)照組及腸吉泰組PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1的表達(dá)均顯著降低（P＜0.05）。見圖1—2。

圖2 各組大鼠PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1蛋白表達(dá)

3 討論

IBS 內(nèi)臟高敏感屬祖國(guó)醫(yī)學(xué)“痛瀉”范疇。本病病機(jī)為脾虛肝乘，肝脾不和，運(yùn)化失常所致。《丹溪心法》之痛瀉藥方乃治療“痛瀉”的經(jīng)典方劑，由陳皮、白術(shù)、白芍、防風(fēng)組成。上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院全國(guó)名中醫(yī)蔡淦教授根據(jù)“痛責(zé)之肝；肝責(zé)之實(shí)”的理論，在痛瀉藥方的基礎(chǔ)上加入甘草、烏梅兩味藥，即構(gòu)成“腸吉泰”組方。方中甘草配伍芍藥即《傷寒論》芍藥甘草湯，具有調(diào)和肝脾、緩急止痛之功效；而烏梅味酸，入肝脾二經(jīng)，與甘草合用，可酸甘化陰，亦可益肝陰。全方共奏疏肝健脾，緩急止瀉之效，治療IBS療效滿意［5］。

前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究［6-7］證實(shí)，腸吉泰方可以減少IBS 內(nèi)臟高敏感模型大鼠結(jié)腸黏膜內(nèi)肥大細(xì)胞數(shù)目，從而有效控制肥大細(xì)胞受P 物質(zhì)刺激后脫顆粒狀態(tài)；使得IBS模型大鼠結(jié)腸黏膜TRPV1 mRNA的表達(dá)降低，改善內(nèi)臟痛覺敏感。

新近研究發(fā)現(xiàn)，PAR2、PKCε 在TRPV1 敏化介導(dǎo)的內(nèi)臟高敏感性導(dǎo)致IBS 的過程中扮演著重要的角色。PAR2 廣泛表達(dá)于胃腸組織的上皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及相關(guān)的神經(jīng)、免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，通過感知興奮感覺神經(jīng)元，激發(fā)神經(jīng)源性疼痛［8-11］。PKCε是蛋白激酶C（protein kinaseC，PKC）家族中的一種亞型，其可通過磷酸化TRPV1 降低離子通道開放閾值而在痛覺敏感中發(fā)揮重要的作用［12］。IBS 患者腸道存在肥大細(xì)胞（mast cell，MC）增多及PAR2的過度表達(dá)［13］。IBS活檢組織樣本的分析結(jié)果顯示，胃腸道MC 數(shù)量平均增加1.2～2.5 倍，提示IBS 患者黏膜存在MC 增生，通過透射電子顯微鏡上的過敏性脫顆粒的超微結(jié)構(gòu)特征顯示，MCs在IBS 中的盲腸和直腸中具有更高的活化率［14］。當(dāng)MC 被活化并脫顆粒后，釋放大量胰蛋白酶、類胰蛋白酶等，可激活自身PAR2 進(jìn)行傷害信號(hào)放大，同時(shí)類胰蛋白酶剪切并結(jié)合PAR2，激活下游磷酸酯酶Cβ（phosopholipase Cβ，PLC），將膜上的脂酰肌醇4，5-二磷酸（phosphatidylinositol biphosphate，PIP2）分解為二酰甘油（diacylgycerol，DAG）和1，4，5-三磷酸肌醇（IP3），IP3 動(dòng)員細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+到細(xì)胞質(zhì)中與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，而DAG 在Ca2+的協(xié)同下激活PKCε，PKCε 活化可致敏TRPV1 受體，使其發(fā)生磷酸化，Ca2+內(nèi)流增加，導(dǎo)致胞膜去極化，引起神經(jīng)元的興奮，釋放傷害性神經(jīng)遞質(zhì)SP 與降鈣素基因相關(guān)肽（calcitoningene-related peptide，CGRP），引起內(nèi)臟疼痛感知異常，最終導(dǎo)致內(nèi)臟高敏感性的發(fā)生［15-18］。因此，抑制PAR2、PKCε 可下調(diào)TRPV1 的表達(dá)，從而減少傷害性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，降低內(nèi)臟敏感。

本研究結(jié)果表明，腸吉泰對(duì)模型大鼠結(jié)腸黏膜組織中PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1 的表達(dá)有顯著下調(diào)作用，提示腸吉泰可能是通過下調(diào)PAR2、PKCε、TRPV1、p-TRPV1 的表達(dá)，抑制其活化，改善IBS的內(nèi)臟高敏感狀態(tài)，從而取得鎮(zhèn)痛的療效。