段桂姣，王振常，吳珊珊

1 廣西玉林第一人民醫(yī)院，廣西 玉林 537000；2 廣西國際壯醫(yī)醫(yī)院

肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，由于多種致病因素長期慢性刺激肝臟組織，使肝竇內(nèi)肝星狀細胞活化，導(dǎo)致膠原等細胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）代謝失衡而沉積和肝組織重構(gòu)所致［1］。在進展的適當階段干預(yù)可逆轉(zhuǎn)或阻斷肝纖維化，從而延緩向肝硬化及肝癌進展［2］。肝纖維化是臨床常見病，是肝癌發(fā)生的重要階段［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，肝星狀細胞的活化分為啟動階段和持續(xù)階段，肝細胞受損凋亡后激活Kuffer細胞，促使其分泌過氧化物酶、超氧化物歧化 酶（superoxide dismutase，SOD）和 丙 二 醛（malondialdehyde，MDA）等因子，這些因子開啟肝星狀細胞活化［5］?；罨蟮腍SC 繼續(xù)分泌細胞因子使其進入持續(xù)階段。持續(xù)階段由自分泌和旁分泌共同調(diào)節(jié)，打破ECM 合成與降解的平衡，造成ECM 的過度沉積和肝纖維化的形成?？梢姼卫w維化的發(fā)展是一個由多種細胞因子、多種蛋白傳導(dǎo)通路參與的全身性病理過程。目前，肝纖維化動物模型的建立方法很多，其中四氯化碳（CCl4）模型是國內(nèi)外最廣泛應(yīng)用的肝纖維化和肝損傷模型，這種建立動物模型的方法具有成模效率高、可重復(fù)性好、死亡率低、操作簡單等優(yōu)點，是一種簡單實用的動物模型方法［6-7］。

柔肝化纖顆粒是在全國名老中醫(yī)林沛湘（壯肝逐瘀煎）及關(guān)幼波教授治療肝炎肝硬化有效驗方基礎(chǔ)上組方而成的，以“補腎柔肝、活血化瘀”為主，兼顧“健脾、解毒、化痰軟堅”，臨床應(yīng)用顯示出良好的保肝、防治肝纖維化、肝硬化作用［8-9］。研究證實，柔肝化纖顆?？梢钥怪|(zhì)過氧化、調(diào)節(jié)機體各種免疫應(yīng)答、保護肝細胞、促進肝內(nèi)膠原蛋白降解［10］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，通過分析柔肝化纖顆粒對CCl4所致肝纖維模型大鼠血液生化指標和肝臟內(nèi)SOD和MDA含量的影響，探討柔肝化纖顆粒對肝纖維化大鼠模型的保護機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物SPF 級SD 大鼠50 只，雄雌各半，體質(zhì)量150～180 g，2月齡。大鼠購自廣西醫(yī)科大學實驗動物研究所，實驗動物許可證號：SYXK（桂）2003—0001。飼養(yǎng)條件：飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)學分子生物學實驗室，分籠飼養(yǎng)并保持實驗室溫度和相對濕度分別為20～24℃和40%～45%，保持通風光照良好。飼料為標準固體混合無菌飼料，飲水為高壓滅菌蒸餾水，飼養(yǎng)期間每天日照12 h。本研究所涉及的動物相關(guān)操作均在廣西中醫(yī)藥大學動物倫理委員會的批準下進行。

1.2 藥物及試劑柔肝化纖顆粒（廣西中醫(yī)學藥大學第一附屬醫(yī)院藥劑科提供），藥物組成：生黃芪45 g，生牡蠣30 g，黃精20 g，枸杞子20 g，薏苡仁45 g，橘紅12 g，澤蘭30 g，鱉甲30 g，雞內(nèi)金15 g，虎杖20 g，黑棗15 g。CCl4（廣東汕頭達濠精細化學品公司，批號：20090513）；秋水仙堿（西雙版納藥業(yè)有限公司，批號：090205）；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT），天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）（四川邁克生物科技股份有限公司，批號：20100318）。透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）、層黏連蛋白（LN）、Ⅲ型前膠原（P3NP）、Ⅳ型膠原（CⅣ）放射免疫分析藥盒（北京北方生物技術(shù)研究所，批號：100320）；膠原Ⅰ第一抗體（Ab-2）（美國Santa Cruz公司，批號：20090315）；膠原Ⅲ第一抗體（武漢博士德生物工程有限公司，批號：20090505）。

1.3 實驗儀器7180 型全自動生化分析儀（日本日立公司）；BeckmanSJ-21 型冷凍離心機（北京光明醫(yī)療儀器廠）；SN-697 型全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)器（上海核所日環(huán)光電儀器有限公司）；Cx3112L02 型生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；AG135型精密電子天平儀（瑞士Nikon公司）；Z-7803型全自動組織包埋機（上海躍進醫(yī)療器械廠）。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模及處理 造模方法根據(jù)文獻［7］報道及預(yù)實驗確定。取健康SD大鼠50只，隨機分為空白組（12 只）和模型組（38 只）。空白組皮下注射生理鹽水，余大鼠皮下注射40 g/L CCl4橄欖油溶液造模，用量0.3 mL/100 g，首劑加倍，每周2 次，連續(xù)4 周，4 周后造模結(jié)束。隨機抽取模型組2 只大鼠進行肝組織病理學檢查，驗證大鼠肝纖維化模型造模成功，將造模成功的大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組、秋水仙堿組和柔肝化纖顆粒組，每組12 只。實驗期間給予各組動物標準飼料，在同樣條件下飼養(yǎng)，灌胃給藥每日1 次，連續(xù)灌胃給藥4 周，空白組和模型組給予等劑量的生理鹽水，柔肝化纖顆粒組按4 g/kg比例給予柔肝化纖顆粒水溶液灌胃，秋水仙堿組按0.25 mg/kg 秋水仙堿水溶液灌胃。

1.4.2 標本采集 末次給藥后，不禁水禁食，以10%水合氯醛0.3 g/kg 腹腔注射麻醉，經(jīng)股動脈脈采血，制備血清，用于相關(guān)指標檢測。取血后，每只大鼠剖取肝臟，在同一肝葉位置切取小塊肝組織置入10%甲醛緩沖液固定，蘇木素-伊紅（HE）染色行病理組織學檢查。

1.5 觀察指標

1.5.1 一般情況 觀察各組大鼠皮毛光澤度、精神狀態(tài)、飲食、活動度及體質(zhì)量改善程度。

1.5.2 肝功能指標 分別采用TBA-40FR 全自動生化檢測儀檢測大鼠ALT、AST 水平，測定嚴格按照使用說明書操作。

1.5.3 肝纖維化指標 在SN-697 全自動雙探頭放射免疫γ計數(shù)器上，采用放射免疫法測定各組血清中HA、LN、P3NP、CⅣ的含量。

1.5.4 肝臟指數(shù)、MDA及SOD測定 取肝組織，稱取肝臟質(zhì)量，每克組織加9 mL生理鹽水，置勻漿機上10 000 r/min×10 s×3 次，制 備10% 勻漿，4000 r/min 離心10 min，取上清液置液氮中保存。運用比色法分別測定腎組織SOD、MDA的含量。

1.5.5 肝組織病理學 將制備好的大鼠肝組織切片置于60°C 烤箱內(nèi)烤片約30 min，取出后常規(guī)脫蠟至水，蘇木素染色5 min，清水沖洗后以1%鹽酸酒精分化，隨后以1%伊紅染液浸染3 min，染色完成后以梯度酒精脫水，二甲苯透明、中性樹膠封片并于顯微鏡下觀察、拍照。觀察各組大鼠肝纖維沉積情況。

1.6 統(tǒng)計學方法運用統(tǒng)計學軟件SPSS 21.0進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組均數(shù)比較采用方差分析，組間差異的顯著性采用配對樣本t檢驗，計數(shù)資料采用秩和檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 造模完成后，空白組大鼠一般狀態(tài)良好；造模組大鼠第一周出現(xiàn)易激怒，精神明顯萎靡，皮毛光澤度欠佳，食欲不振，體質(zhì)量減輕。實驗期間模型組死亡2 只，考慮是灌胃刺破食道血管所致；秋水仙堿組死亡1 只，考慮是過度飲食致腦出血或灌胃刺破食道血管所致；柔肝化纖顆粒組死亡1只，考慮是灌胃刺破食道血管死亡。

2.2 大鼠肝臟指數(shù)與空白組比較，模型組肝臟指數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒組肝臟指數(shù)上升，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.3 大鼠血清ALT、AST 水平與空白組比較，模型組大鼠血清ALT、AST 含量顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒組大鼠血清ALT、AST 含量均降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)，血清ALT、AST水平比較（±s）

表1 各組大鼠肝臟指數(shù)，血清ALT、AST水平比較（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；-表示無數(shù)值

組別空白組模型組秋水仙堿組柔肝化纖組鼠數(shù)12 10 11 11給藥劑量--0.25 mg/kg 4 g/kg肝臟指數(shù)（%）4.5±1.3*3.2±0.7▲3.2±0.9 3.6±1.4*ALT（U/L）42.32±6.76 117.03±9.54*68.33±17.89▲55.86±17.23*▲AST（U/L）146.65±12.39 414.07±18.55*209.86±15.79▲179.65±21.66*▲

2.4 大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ水平與空白組比較，模型組大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ含量較高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒組大鼠血清透HA、LN、P3NP、CⅣ含量均降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

2.5 大鼠肝組織內(nèi)SOD、MDA 水平與空白組比較，模型組大鼠肝組織內(nèi)SOD降低，MDA含量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，柔肝化纖顆粒組大鼠SOD降低，MDA含量降低（P＜0.05），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ，肝組織SOD及MDA水平比較（±s）

表2 各組大鼠血清HA、LN、P3NP、CⅣ，肝組織SOD及MDA水平比較（±s）

注：*表示與空白組比較，P＜0.05；▲表示與模型組比較，P＜0.05；-表示無數(shù)值

組別空白組模型組秋水仙堿組柔肝化纖組鼠數(shù)12 10 11 11給藥劑量--0.25 mg/kg 4 g/kg HA（mg/L）52.21±15.75 309.10±23.62*124.19±5.21▲111.21±13.81*▲LN（μg/L）6.27±2.03 38.45±0.88*11.21±1.21▲9.63±0.79*▲P3NP（μg/L）19.21±1.57 92.68±3.57*28.77±4.21▲29.02±1.75*▲CⅣ（μg/L）7.88±1.54 52.07±3.75*15.88±1.75▲13.25±1.56*▲SOD（u/L）211.51±12.76 122.53±7.68*169.11±3.26▲181.23±4.89*▲MDA（u/L）1.12±0.15 5.59±0.33*3.14±0.27▲2.23±0.19*▲

2.6 大鼠肝臟病理變化空白組大鼠肝細胞體積較大，核大而圓，核膜完整，位于細胞中央，肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射狀排列，肝細胞間連接緊密。模型組大鼠肝小葉界限不清，胞質(zhì)內(nèi)見大小不等多個的脂肪空泡，炎性細胞浸潤，肝細胞排列紊亂。秋水仙堿組大鼠肝小葉結(jié)構(gòu)明顯改善，纖維間隔較少，可見少許肝細胞壞死、炎性細胞浸潤，肝小葉多呈放射狀分布，僅少數(shù)不完全性假小葉。柔肝化纖顆粒組肝組織結(jié)構(gòu)明顯改善，肝細胞脂肪變性減輕，少許炎性細胞浸潤與假小葉形成。見圖1。

圖1 各組大鼠肝組織病理學表現(xiàn)（HE×20）

3 討論

肝纖維化是各種慢性損肝因素（如肝炎病毒、脂肪肝、藥物、毒物、酒精、血吸蟲、膽汁淤積）等多種損傷因素長期刺激肝臟，造成的一種常見慢性肝臟疾病，損傷與修復(fù)過程中，細胞外基質(zhì)的合成增加而降解減少，最終導(dǎo)致細胞外基質(zhì)在肝內(nèi)過度沉積。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的必經(jīng)階段，是所有慢性肝病的共同病理基礎(chǔ)，肝纖維化有逆轉(zhuǎn)的可能［11-12］。其形成的機制可能是通過某些致病因子（如肝炎病毒、脂肪肝、藥物、毒物、酒精等）激活肝枯否氏細胞，進而分泌多種細胞因子，并與肝竇內(nèi)皮細胞分泌多種細胞因子共同激活肝星狀細胞（hepatic stellate cell，HSC），使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，使HSC 增殖，產(chǎn)生大量的細胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致其在肝內(nèi)大量沉積，逐漸形成肝纖維化［13-14］。CCl4誘發(fā)的肝纖維化典型動物造模，此造模方法能用于肝纖維化組織病理改變及抗纖維化藥物篩選的相關(guān)體內(nèi)研究［15］。當大鼠出現(xiàn)肝纖維化時，會表現(xiàn)為肝功能損傷、肝組織纖維樣變等典型病變。

前期通過臨床研究［16］發(fā)現(xiàn)，柔肝化纖顆粒可降低患者MDA 及血清纖維化各項指標的含量，增強GSH-PX、SOD 活性。病理學研究證實柔肝化纖顆粒有抗炎保肝、抗氧化應(yīng)激及改善非酒精性脂肪性肝纖維化患者臨床癥狀的作用。SOD 是一種抗氧化的酶，廣泛存在于需氧有機體中，主要功能是避免氧化性損傷。MDA 是氧化應(yīng)激常用的標志物，常被用來間接反映機體的自由基代謝變化及細胞的損傷程度。本研究結(jié)果顯示，柔肝化纖顆粒能夠顯著降低肝臟組織中MDA 水平，減輕對機體的損傷。經(jīng)柔肝化纖顆粒治療后，肝臟組織中SOD 水平明顯升高，使細胞有足夠能力清除氧自由基，對抗過氧化反應(yīng)，保護細胞膜免受自由基的攻擊。通過檢測實驗大鼠血清中ALT、AST、HA、LN、P3NP、CⅣ含量，觀察肝臟指數(shù)、肝臟病理組織學改變，發(fā)現(xiàn)柔肝化纖顆粒能明顯改善CCL4肝纖維化模型大鼠肝臟肝纖維化、肝功能指標；同時使大鼠肝臟病理學組織的炎性浸潤和脂肪空泡消失、匯管區(qū)無纖維素沉積，說明柔肝化纖顆粒具有保護肝臟的作用，為臨床治療提供了動物實驗基礎(chǔ)。

在壯醫(yī)學中，肝纖維化屬于“咪疊蠱”范疇，壯醫(yī)的基礎(chǔ)理論主要由“陰陽為本，天地人三氣同步”的天人合一自然觀、“三道”（氣道、水道、谷道）“兩路”（龍路、火路）的生理病理觀、“毒虛致百病”的病因病機和“調(diào)氣、補虛、祛毒”的治療原則及“主藥、公藥、母藥、幫藥”的方劑配伍用藥原則組成。柔肝化纖顆粒以生黃芪為主藥，勁補后天脾氣，又兼補肺健脾以通“氣道”，利水托邪毒外出，振奮后天中州脾土之氣，有“鼓舞脾臟之氣，顧護中州，防止肝之邪毒向脾臟傳變”之意；薏苡仁、澤蘭、虎杖為公藥，可利水滲濕、散瘀止痛解毒以通調(diào)“水道”；黃精、枸杞子、生牡蠣、鱉甲為母藥，可補氣養(yǎng)陰、滋補肝腎、益陰潛陽、軟堅散結(jié)；雞內(nèi)金、橘紅共為幫藥，可行氣消食健脾，兼補脾腎之精，通調(diào)“谷道”；黑棗調(diào)和諸藥。諸藥合用共奏攻毒補虛，柔肝化纖之效。壯醫(yī)認為，“氣道”“谷道”“水道”以通為用，三道通暢，調(diào)節(jié)有度，人體之氣就能與天地之氣保持同步協(xié)調(diào)平衡，機體就能呈現(xiàn)健康狀態(tài)。柔肝化纖顆粒攻毒補虛，使三道通暢，天地人三氣同步，體內(nèi)陰陽平衡，確為治療“咪疊蠱”（肝纖維化）之良方。

課題組前期研究［17-20］發(fā)現(xiàn)，柔肝化纖顆粒可抑制CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型肝組織中基質(zhì)金屬蛋白酶-2 表達下降，細胞外基質(zhì)沉積增多。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)CCL4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化模型肝組織活性氧類物質(zhì)表達上調(diào)，磷酸化PKCα、細胞核Nrf2表達下調(diào)，轉(zhuǎn)化生長因子-β1、I型膠原表達上調(diào)。柔肝化纖顆?？缮险{(diào)CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化大鼠模型肝組織PKCα 及細胞核Nrf2 表達，抑制活性氧類物質(zhì)生成，下調(diào)肝組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1、I型膠原蛋白的表達［21-23］?；谇捌谘芯?，課題組認為柔肝化纖顆?？赡苁峭ㄟ^降低HA、LN、P3NP、CⅣ含量，使ALT、AST 恢復(fù)正常，降低CCL4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠血清中MDA和SOD含量，從而發(fā)揮其抗氧化作用，減輕肝纖維化嚴重程度的。但前期研究重在對現(xiàn)象進行描述，未能對其協(xié)同增效及深層次作用機制進行研究，這還需要在后期的研究中逐一完善，對其改善肝硬化、促進肝再生的作用機制仍需繼續(xù)深入研究。