亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        益腎固本膏方對腎陽虛哮喘模型大鼠腎上腺皮質(zhì)類固醇合成酶及糖皮質(zhì)激素受體亞型的影響*

        2022-05-24 06:58:52王云方
        西部中醫(yī)藥 2022年4期
        關(guān)鍵詞:膏方腎陽虛皮質(zhì)激素

        王云方

        無錫市中醫(yī)醫(yī)院,江蘇 無錫 214000

        支氣管哮喘發(fā)病率逐年上升,嚴(yán)重危害患者健康,而頻繁的急性發(fā)作必將導(dǎo)致患者肺功能進(jìn)一步惡化,長期、反復(fù)、大量的應(yīng)用糖皮質(zhì)激素產(chǎn)生的毒副作用對人體的影響廣泛且嚴(yán)重。臨床研究發(fā)現(xiàn),腎虛(主要為腎陽虛)常貫穿支氣管哮喘發(fā)生發(fā)展的全過程,其成因既有先天稟賦的影響,也有疾病反復(fù)發(fā)作帶來的損傷,還有長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素的副作用。補(bǔ)腎類中藥可有效改善哮喘患者“腎虛”的病理狀態(tài)。

        益腎固本膏方是無錫市名中醫(yī)壯健的經(jīng)驗(yàn)方,具有溫補(bǔ)腎元、填精益髓、理虛祛痰之療效,前期臨床及實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),益腎固本膏方可增加腎陽虛哮喘模型大鼠血漿中促腎上腺皮質(zhì)激素(adrenocorticotropic hormone,ACTH)、皮質(zhì)酮(corticosterone,CORT)的釋放,支氣管哮喘緩解期患者使用益腎固本膏方可減少激素使用量及急性發(fā)作的次數(shù),同時(shí)減輕發(fā)作時(shí)咳嗽、氣喘嚴(yán)重程度,療效顯著,且未見不良反應(yīng)[1]。

        曾洋等[2]通過基因表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)自擬補(bǔ)腎陽復(fù)方能提高多種類固醇合成酶如HSD11B1、CYP7A1 的表達(dá);Western blot 亦顯示HSD11B1 蛋白表達(dá)升高,提示提高類固醇合成酶的表達(dá)可能是補(bǔ)腎陽復(fù)方升高腎陽虛證模型血漿皮質(zhì)酮水平的機(jī)制之一。由此我們推測益腎固本膏方通過促進(jìn)腎上腺皮質(zhì)類固醇合成酶表達(dá)而增加內(nèi)源性皮質(zhì)酮釋放,另外,益腎固本膏方增強(qiáng)激素效應(yīng)可能與促進(jìn)GRα 表達(dá)、同時(shí)抑制GRβ表達(dá)相關(guān)。本研究通過建立腎陽虛哮喘大鼠模型,測定腎上腺組織中HSD11B1、CYP11B1 及肺組織GRα、GRβ表達(dá),以期發(fā)現(xiàn)益腎固本膏方減少支氣管哮喘急性發(fā)作次數(shù)并增強(qiáng)激素效應(yīng)的作用機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物清潔型SD大鼠,40只,雄性,2月齡,體質(zhì)量(270±20)g,由江蘇省血吸蟲病防治所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào):SYXK(蘇)2017-0050。飼養(yǎng)條件:分籠飼養(yǎng)于江蘇省血吸蟲病防治所動(dòng)物飼養(yǎng)室(清潔Ⅱ級(jí))飼養(yǎng),自由飲水,室溫(20±2)℃,濕度55%~65%,定期紫外線消毒,通風(fēng)良好。

        1.2 實(shí)驗(yàn)藥物益腎固本膏方主要組成:熟地黃、山萸肉、山藥、淫羊藿、菟絲子、枸杞、肉桂、白芍、黨參、黃芪、黃精、蘇子、法半夏、穿山龍、陳皮、降香、炙甘草等,最后以鹿角膠、阿膠、冰糖熬制收膏總劑量3780 g,終濃度相當(dāng)于每1 mL 含生藥3.53 g,由無錫市中醫(yī)醫(yī)院煎藥室煎制,置于4℃冰箱中備用。

        1.3 試劑與儀器注射用氫化可的松琥珀酸鈉(湖北人民制藥有限公司,批號(hào):H20058653);卵蛋白、AlOH3凝膠(Sigma公司,卵蛋白批號(hào):O1641,AlOH3凝膠批號(hào):1017502);PCR 反應(yīng)試劑盒(TAKARA 公司,批號(hào):RR091A);HSD11B1 兔抗多克隆抗體(藍(lán)基公司,批號(hào):AF3397);CYP11B1抗多克隆抗體(Santa Cruz 公司,批號(hào):SC-374096);GRα 兔抗多克隆抗體(Abcam 公司,批號(hào):ab3580);GRβ兔抗多克隆抗體(Biorbyt 公司,批號(hào):orb314758);Western BlotⅡ抗(Abcam 公司,批號(hào):ab6721);NE-C900型霧化機(jī)(Omron公司)。

        1.4 實(shí)驗(yàn)方法

        1.4.1 造模及分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)2 天后,采用隨機(jī)數(shù)字表法將40 只大鼠分為空白對照組,模型對照組,益腎固本膏方低、中、高劑量組,每組8只。1)空白對照組腹腔注射生理鹽水1 mL(只/天);模型對照組及益腎固本膏方各劑量組制備腎陽虛哮喘大鼠模型,腹腔注射氫化可的松琥珀酸鈉25 mg/(kg·d),連續(xù)20 天。2)實(shí)驗(yàn)第21、27天空白對照組分六點(diǎn)注射生理鹽水2 mL(雙側(cè)腹股溝、背部皮下、雙側(cè)后足趾皮下、腹腔);模型組分六點(diǎn)注射AlOH3及OVA 混合液2 mL。3)實(shí)驗(yàn)第34 天至實(shí)驗(yàn)第47 天,空白對照組予生理鹽水霧化,模型組予10 g/L 卵蛋白霧化,各組每次給藥30 min,隔日1 次,共7 次。4)造模成功表現(xiàn):模型組大鼠體質(zhì)量低于空白對照組,空白對照組大鼠毛發(fā)順滑,體質(zhì)量日漸增加,雙目有神,反應(yīng)、活動(dòng)靈活敏捷,叫聲響亮,大小便正常,正常進(jìn)食飲水。模型組大鼠體質(zhì)量增長緩慢,目光無神,易抓取,脫毛,拱背,蜷縮,抱團(tuán),自主活動(dòng)減少,爪甲顏色變淺,飲食、飲水減少,大便清稀,多尿,出現(xiàn)豎毛、身體蜷縮、扎堆,眼睛半瞇、小便次數(shù)多等現(xiàn)象,證實(shí)腎陽虛哮喘動(dòng)物模型造模成功。

        1.4.2 給藥方法 造模成功后,空白對照組及模型對照組灌服蒸餾水2 mL(只/天),連續(xù)20 天。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果,分別予益腎固本膏方低、中、高劑量灌胃并經(jīng)人與動(dòng)物劑量換算標(biāo)準(zhǔn)確定大鼠灌胃劑量。益腎固本膏方低、中、高劑量組分別灌服益腎固本膏方2.15、10.73、21.45 g/(kg·d),連續(xù)20天。

        1.4.3 標(biāo)本處理 灌胃結(jié)束后(給藥最后一次16 h 后),稱取大鼠體質(zhì)量,采用3%戊巴比妥鈉溶液(45 mg/kg)腹腔麻醉大鼠,心臟取血后在冰面上迅速剪開胸腔,分離出腎上腺及肺組織,制備成組織勻漿用作檢測HSD11B1、CYP11B1、GRα、GRβmRNA及蛋白表達(dá)。

        1.5 觀察指標(biāo)

        1.5.1 RT-PCR測定大腎上腺組織HSD11B1、CYP11B1、GRα、GRβmRNA 設(shè)計(jì)并合成引物:獲取大鼠HSD11B1、CYP11B1、GRα、GRβ相關(guān)檢測指標(biāo)的基因序列,基因引物序列及其相關(guān)參數(shù)見表1。提取腎上腺組織HSD11B1 RNA、CYP11B1 RNA 及肺組織GRαRNA、GRβRNA測定濃度鑒定質(zhì)量后,每組取1μg RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,20 μL 反應(yīng)體系,將反轉(zhuǎn)錄條件設(shè)置為37℃15 min和85℃5 s,進(jìn)行RT-PCR反應(yīng),兩步法擴(kuò)增,最終結(jié)果由軟件自動(dòng)求出。

        表1 基因引物序列

        1.5.2 Western Blot測定大鼠腎上腺組織HSD11B1、CYP11B1 及肺組織GRα、GRβ蛋白的表達(dá) 用干凈的剪刀將組織塊剪碎,加400μL單去污劑裂解液(含PMSF)于勻漿器中,低溫勻漿,裂解液移至1.5 mLEP管中,然后在4℃下,以離心半徑5 cm,12 000 r/min離心5 min,取上清分裝并置于-20℃保存。上樣前用裂解液及上樣緩沖液調(diào)整蛋白濃度,煮沸蛋白樣品(10 min),使蛋白充分變性,蛋白上樣量為40μg。分別在樣品孔內(nèi)加入樣品及蛋白Marker。電泳條件:100 V,電泳至溴酚藍(lán)剛跑出即可終止電泳。PVDF 膜經(jīng)甲醇處理15 s 激活后,將其與分離膠以100V 轉(zhuǎn)膜1 h。用TBST 稀釋的5%脫脂奶粉浸泡PVDF 膜,封閉1 h。用TBST 洗去多余奶粉后,將PVDF 膜與一抗孵育過夜(一抗用TBST 以1∶500 稀釋)。用TBST 在室溫下洗3 次,每次10 min以洗去多余的一抗。將PVDF膜與二抗(1∶4000)室溫孵育1 h。同樣的方法將多余的二抗洗去。將配置好的發(fā)光液均勻滴加至PVDF膜上,反應(yīng)1~2 min進(jìn)行顯色。用醫(yī)用X光膠片采集熒光信號(hào)。

        1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以±s表示,采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料以率表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 大鼠腎上腺組織HSD11B1、CYP11B1 mRNA及蛋白表達(dá)與空白對照組比較,模型對照組HSD11B1、CYP11B1 mRNA 表達(dá)偏低,兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。益腎固本膏方各劑量組HSD11B1、CYP11B1 mRNA表達(dá)均高于模型組(P<0.01),HSD11B1 mRNA與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),CYP11B1 mRNA 表達(dá)高于空白對照組(P<0.01)。見圖1。HSD11B1、CYP11B1 蛋白表達(dá)結(jié)果顯示,空白對照組>益腎固本膏方各劑量組>模型對照組。見圖2。

        圖1 各組大鼠腎上腺組織HSD11B1、CYP11B1 mRNA比較

        圖2 各組大鼠腎上腺組織HSD11B1、CYP11B1蛋白表達(dá)電泳圖

        2.2 大 鼠 肺 組 織GRα、GRβ mRNA 及 蛋 白 表達(dá)GRα mRNA表達(dá)表現(xiàn)為益腎固本膏方中、高劑量組>益腎固本膏方低劑量組>空白對照組>模型對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。GRβmRNA表達(dá)表現(xiàn)為空白對照組及益腎固本膏方各劑量組均低于模型對照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);益腎固本膏方各劑量組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。模型對照組GRα表達(dá)最低,空白對照組GRα 表達(dá)最高,益腎固本膏方各劑量組GRα 表達(dá)介于兩者之間。關(guān)于GRβ蛋白表達(dá)結(jié)果提示模型對照組GRβ蛋白表達(dá)>益腎固本膏方低、中劑量組>益腎固本膏方高劑量組>空白對照組。見圖4。

        圖3 各組大鼠腎上腺組織GFα、GFB mRNA表達(dá)情況

        圖4 各組大鼠腎上腺組織GFα、GFβ蛋白表達(dá)電泳圖

        3 討論

        哮病的發(fā)生為痰伏于肺,每因外邪侵襲、飲食不當(dāng)、情志刺激、體虛勞倦等誘因引動(dòng)而觸發(fā),素質(zhì)不強(qiáng),長期反復(fù)發(fā)作,久病體弱,傷及腎陽,攝納失常,陽虛水泛為痰,上干于肺,另外腎虛命門之火不能上濟(jì)于心,則心陽亦同時(shí)受累,甚至發(fā)生喘脫危候。朱丹溪云:“未發(fā)以扶正氣為主,既發(fā)以攻邪氣為急?!惫氏浴鞍l(fā)時(shí)治標(biāo),平時(shí)治本”為基本原則。平時(shí)應(yīng)扶正治本,腎陽虛者以補(bǔ)腎為要,現(xiàn)代臨床研究中,補(bǔ)腎治療被廣泛應(yīng)用于支氣管哮喘緩解期。

        益腎固本膏方功效為溫補(bǔ)腎元、填精益髓。在前期研究中,本課題組以本方干預(yù)腎陽虛哮喘模型組大鼠,發(fā)現(xiàn)其能夠升高腎陽虛哮喘模型組大鼠血漿ACTH、CORT 含量,亦在臨床實(shí)驗(yàn)中取得很好的療效。

        HSD11B1 是一種腎上腺皮質(zhì)類固醇合成酶,廣泛存在于肝臟、腎臟、脂肪和骨骼等各種組織中,它屬于短鏈脫氫/還原酶蛋白超家族(SDR),為相對分子質(zhì)量(Mr)為34 000 的糖蛋白,是糖皮質(zhì)激素的關(guān)鍵代謝酶,可以催化糖皮質(zhì)激素C11 位的酮基與羥基之間的氧化還原反應(yīng),使有生物活性的皮質(zhì)醇與無活性11-脫氫皮質(zhì)酮(以下簡稱皮質(zhì)酮)相互轉(zhuǎn)化[3]。

        循環(huán)中糖皮質(zhì)激素的主要形式是皮質(zhì)醇,所有HSD11B1 通過雙向轉(zhuǎn)換作用調(diào)節(jié)機(jī)體局部糖皮質(zhì)激素的水平和活性[4]。韓鈞等[5]指出,短期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以直接促進(jìn)11β-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá),而長期應(yīng)用糖皮質(zhì)激素可以間接抑制11β-羥基類固醇脫氫酶的表達(dá),我們此次實(shí)驗(yàn)也證實(shí)通過持續(xù)使用氫化可的松琥珀酸鈉腹腔注射建立的腎陽虛哮喘大鼠模型HSD11B1 表達(dá)下降,皮質(zhì)醇含量下降,臨床表現(xiàn)為哮喘反復(fù)發(fā)作,激素使用效果欠佳。

        通過益腎固本膏方干預(yù)腎陽虛哮喘模型大鼠,使得腎陽虛哮喘模型大鼠HSD11B1 表達(dá)增加,將細(xì)胞內(nèi)的無活性的皮質(zhì)酮還原成有活性的皮質(zhì)醇,放大激素效應(yīng),改善腎陽虛哮喘患者發(fā)作的頻次與癥狀。

        人腎上腺皮質(zhì)中皮質(zhì)醇生成的最后一步依賴于CYP11B1,可分別催化11-去氧皮質(zhì)醇及11-去氧皮質(zhì)酮生成皮質(zhì)醇和皮質(zhì)酮,CYP11B1 在腎上腺束狀帶和網(wǎng)狀帶中的表達(dá),是皮質(zhì)醇和醛固酮生成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[6]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,益腎固本膏方低、中、高劑量組干預(yù)動(dòng)物模型后均可使模型大鼠CYP11B1 表達(dá)增加,進(jìn)一步促進(jìn)動(dòng)物體內(nèi)產(chǎn)生皮質(zhì)醇及皮質(zhì)酮,從而改善大鼠腎陽虛狀態(tài),減少哮喘發(fā)作,減少外源性激素使用,進(jìn)一步改善患者肺功能。

        大量臨床研究證實(shí),補(bǔ)腎陽法治療腎陽虛型哮喘無明顯不良反應(yīng),在臨床運(yùn)用中,不僅可減少患者緩解期急性發(fā)作次數(shù),在與外源性激素合用時(shí),還可減少外源性激素使用量,增強(qiáng)激素效應(yīng)。劉仁慧等[7]通過實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)補(bǔ)腎藥協(xié)同抗炎及抑制激素的副作用與影響GR 亞型及上調(diào)肺轉(zhuǎn)錄因子有關(guān)。糖皮質(zhì)激素發(fā)揮主要需依賴與體內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體的結(jié)合,內(nèi)源性糖皮質(zhì)激素受體主要有兩種,其中GRα 包含777 個(gè)氨基酸,具有與激素結(jié)合的能力,可發(fā)揮激素正性效應(yīng),是生理?xiàng)l件下GR 的主要存在形式。GRβ 只有742 個(gè)氨基酸,缺乏完整的激素結(jié)合區(qū),在體內(nèi)無生物活性,但可競爭性抑制GRα 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活化以及在炎癥反中誘發(fā)糖皮質(zhì)激素抵抗[8-9]。支氣管哮喘發(fā)作是體內(nèi)多種炎癥介質(zhì)、細(xì)胞因子等共同作用的結(jié)果,而多種細(xì)胞因子以及激素治療過程中激素本身對GRα 的下調(diào)、GRβ的上調(diào)作用等均可影響組織細(xì)胞對GC的敏感性[10-11]。

        本研究同時(shí)測定了GRα 和GRβ 的表達(dá),進(jìn)一步探討益腎固本膏方即補(bǔ)腎陽法協(xié)同抗炎、減輕副作用、增強(qiáng)激素效應(yīng)的具體機(jī)制。首先,長期反復(fù)的使用糖皮質(zhì)激素使得腎陽虛哮喘模型組大鼠GRα 受體表達(dá)下降、GRβ 受體表達(dá)上升,誘發(fā)激素抵抗,降低激素使用效果,益腎固本膏方干預(yù)后,與模型對照組相比,GRα 表達(dá)上調(diào)、GRβ表達(dá)下調(diào),益腎固本膏方通過增加GRα 蛋白表達(dá)、抑制GRβ表達(dá)來發(fā)揮協(xié)同抗炎、減輕副作用、增強(qiáng)激素效應(yīng)的作用。

        益腎固本膏方是無錫市名中醫(yī)壯健主任醫(yī)師經(jīng)驗(yàn)方,以該方為基礎(chǔ)方,加減治療各種哮喘,效果明顯。方中以熟地黃、山萸肉、山藥、淫羊藿、菟絲子、枸杞、肉桂等取右歸丸之意溫補(bǔ)腎元、填精益髓;黃芪、黨參、白術(shù)、茯苓等補(bǔ)肺健脾;蘇子、法半夏、穿山龍、陳皮、降香等兼以祛痰下氣、止咳平喘;輔以阿膠、鹿角膠、冰糖等收膏,并進(jìn)一步固本培元。全方益腎固本尤以補(bǔ)腎陽法為主兼以理虛祛痰。在疾病緩解期應(yīng)用益腎固本膏方,可有效改善哮喘患者“腎虛”的病理狀態(tài),減少其哮喘急性發(fā)作的頻率和嚴(yán)重程度,并在支氣管哮喘急性發(fā)作時(shí)發(fā)揮協(xié)同抗炎、減輕副作用、增強(qiáng)激素效應(yīng)的作用。

        猜你喜歡
        膏方腎陽虛皮質(zhì)激素
        促腎上腺皮質(zhì)激素治療腎病綜合征的研究進(jìn)展
        糖皮質(zhì)激素聯(lián)合特布他林治療慢阻肺急性加重期的臨床效果觀察
        巴戟天及其炮制品對腎陽虛大鼠HPA軸功能的改善作用
        中成藥(2018年11期)2018-11-24 02:57:22
        名醫(yī)膏方補(bǔ)氣血
        特別健康(2018年3期)2018-07-04 00:40:24
        冬令進(jìn)補(bǔ)有膏方
        探討溫腎化瘀利水法治療慢性腎功能衰竭腎陽虛、瘀水互結(jié)型的有效性及安全性
        有一種膏方叫“量身定制”
        生發(fā)Ⅰ號(hào)聯(lián)合局部注射糖皮質(zhì)激素治療斑禿患者禿眉的臨床觀察
        溫陽解郁湯治療脾腎陽虛型抑郁癥30例
        治療脾腎陽虛型潰瘍性結(jié)腸炎30例
        婷婷亚洲国产成人精品性色| 日本边添边摸边做边爱喷水| 国产男女猛烈无遮挡免费网站| 杨幂AV污网站在线一区二区| 久久久调教亚洲| 日韩女优视频网站一区二区三区| 国产成人精品日本亚洲专区61| 久久午夜伦鲁片免费无码| 就国产av一区二区三区天堂| 日本视频一区二区三区| 无码人妻一区二区三区免费看| 无码a∨高潮抽搐流白浆| 日本精品免费一区二区三区| 自拍偷区亚洲综合激情| 永久亚洲成a人片777777| 玩两个丰满老熟女| 免费a级毛片无码a∨免费| 国产精品一区二区三区在线观看| 国模吧无码一区二区三区| 欧美成人精品第一区二区三区| 杨幂Av一区二区三区| 91色区在线免费观看国产| 亚洲熟妇少妇任你躁在线观看无码| 久久久窝窝午夜精品| 亚洲精品在线观看一区二区| 女色av少妇一区二区三区| av无码天堂一区二区三区| 99久久国产亚洲综合精品| 亚洲av无一区二区三区综合| 97se亚洲国产综合自在线观看 | 黑人玩弄人妻中文在线| WWW拍拍拍| 国产精品成人av大片| 国产尤物av尤物在线观看 | 永久免费毛片在线播放| 国产一区白浆在线观看| 亚洲国产午夜精品理论片在线播放| 亚洲不卡无码高清视频| 日韩激情视频一区在线观看| 特黄大片又粗又大又暴| 国产精品无码精品久久久|