趙 軍，李 昕，謝靜華，師建平，常 虹

1 內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020；2 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院；3 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院

中國古代蒙醫(yī)籍中記載的傳統(tǒng)蒙藥藍(lán)刺頭（echinops latifolius），其味苦，性涼，效稀、柔、鈍、輕，有固骨質(zhì)、接骨愈傷、清熱解毒，殺“粘”止痛等功效，主治筋骨折傷、骨傷熱、刺痛、金創(chuàng)、瘡瘍等癥［1］。本研究在前期研究［2-3］的基礎(chǔ)上進(jìn)一步探究蒙藥藍(lán)刺頭對去卵巢大鼠骨密度（bone mineral density，BMD）、血清雌二醇（estradiol2，E2）、股骨頭中芳香化酶P450（aromatase cytochrome P450，CYP450）作用，闡述藍(lán)刺頭對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物5 月齡雌性Wistar 大鼠105 只，購于內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心，實(shí)驗(yàn)動物合格證號：SCXK（蒙）2002-0001，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，恒溫、恒濕，購回大鼠環(huán)境適應(yīng)7 天，開始制備動物去卵巢大鼠OP模型。

1.2 試藥與試劑蒙藥藍(lán)刺頭制劑原藥購于內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，由內(nèi)蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院制劑中心制備膠囊。強(qiáng)骨膠囊（北京岐黃制藥有限公司，批號：131204，規(guī)格：0.25 g/粒）。己烯雌酚片（合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號：20181120）。E2試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：201809213）；CYP450 試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：201809584）；DAB 顯色試劑盒（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：1292345）；PBS 緩沖液（北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號：1321250607）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法90 只大鼠飼養(yǎng)適應(yīng)7 天后按文獻(xiàn)［4］制備PMOP 大鼠模型。依據(jù)文獻(xiàn)［5-7］觀察大鼠陰道涂片，確定造模是否成功。造模成功后大鼠陰道涂片均處于動情間期，成功復(fù)制PMOP 動物模型90 只；假手術(shù)組只切除卵巢周邊脂肪，造模成功15 只。隨機(jī)法將90 只PMOP 大鼠分為己烯雌酚組，強(qiáng)骨膠囊組，蒙藥藍(lán)刺頭低、中、高劑量組，模型組6 組，每組15 只；另設(shè)假手術(shù)組15 只。藥物各組分別研磨細(xì)碎，配制使用蒸餾水。據(jù)人、鼠體質(zhì)量比及人、鼠代謝速率比行計(jì)算［3］，強(qiáng)骨膠囊23.437 5 mg/mL，己烯雌酚0.0313 mg/mL。蒙藥藍(lán)刺頭高、中、低劑量組濃度依次為27.500 0、13.750 0、6.875 0 mg/mL，高、中、低劑量比例為4∶2∶1，其中低劑量組為臨床有效劑量。為方便配藥，上藥計(jì)算為每日灌胃量0.02 mL/g，濃度配成。見圖1。

圖1 光鏡下雌鼠陰道涂片（HE×400）

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 標(biāo)本采集 1）麻醉大鼠后心臟取血，在心尖搏動胸骨左緣處，粗針頭斜向大鼠后背右上方向進(jìn)針，深度約1.5 cm，防止吸抽過程中紅細(xì)胞擠壓溶血，保持速度緩慢均勻，采血5 mL，進(jìn)行血清E2檢測；2）處死大鼠剖取雙側(cè)完整股骨，分離干凈附著的肌肉組織，保留完整骨膜，左側(cè)股骨雙能X線測BMD，4%甲醛液將右側(cè)股骨浸沒備免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)用；檢測CYP450 在右側(cè)股骨頭中表達(dá)［5-10］。

1.4.2 檢測影響骨代謝生化指標(biāo) 采用顯微CT（Micro-CT）對所有大鼠左側(cè)股骨近端干骺端BMD計(jì)量學(xué)指標(biāo)進(jìn)行分析；采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)法測定大鼠血清E2；行免疫組化染色觀察腎上腺CYP450表達(dá)，每組大鼠取5 張切片（n0），每張切片隨機(jī)選擇5個(gè)視野（n1），在光學(xué)顯微鏡下觀察各組染色情況。

1.4.3 大鼠股骨脫鈣過程、免疫組化法染色觀察 4%甲醛將大鼠右側(cè)股骨固定10天，EDTA脫鈣液配制，在1 000 mL 的燒杯中加入186 g EDTA-2Na·2H2O，189.4 g Na2HPO4、10.6 g NaH2PO4，加水約700 mL，將燒杯放置于加熱攪拌器上并通電，NaOH 20 g 再入，攪拌加熱至65℃，透明澄清液體顏色，測定調(diào)節(jié)溶液pH值為8.0，總量1000 mL定容。錐形瓶中移入大鼠右側(cè)股骨，脫鈣液EDTA 加入，液/骨體積比約4∶1，換液定時(shí)每2 日1 次，25℃左右室溫，脫鈣連續(xù)20 天，針尖刺入股骨，暢通無阻則完全脫鈣。常規(guī)行免疫組化染色觀察股骨CYP450表達(dá)［6］。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 股骨骨密度BMD 水平假手術(shù)組，蒙藥藍(lán)刺頭中、低劑量組，假手術(shù)組，強(qiáng)骨膠囊組，己烯雌酚組與模型組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；蒙藥藍(lán)刺頭高、低劑量組與模型組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組與蒙藥藍(lán)刺頭高劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組、強(qiáng)骨膠囊組、己烯雌酚組、假手術(shù)組組間兩兩相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組大鼠左側(cè)股骨近端干骺端骨密度比較（±s） g/cm3

表1 各組大鼠左側(cè)股骨近端干骺端骨密度比較（±s） g/cm3

注：與模型組比較，*表示P＜0.05；與假手術(shù)組比較，△表示P＜0.05

組別模型組假手術(shù)組藍(lán)刺頭高劑量組藍(lán)刺頭中劑量組藍(lán)刺頭低劑量組強(qiáng)骨膠囊組己烯雌酚組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15 15 BMD 0.189±0.032△0.400±0.072 0.249±0.235△0.313±0.025*0.245±0.272*0.298±0.437*0.396±0.058*

2.2 血清E2水平與假手術(shù)組相比，模型組血清E2水平下降明顯（P＜0.01）。與模型組相比，藍(lán)刺頭中、高劑量組，己烯雌酚組，強(qiáng)骨膠囊組血清E2水平均升高明顯（P＜0.01）；藍(lán)刺頭低劑量組血清E2水平上升，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與己烯雌酚組比，蒙藥藍(lán)刺頭中劑量組血清E2升高，藍(lán)刺頭高、低劑量組血清E2降低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與強(qiáng)骨膠囊組比較，藍(lán)刺頭中劑量組血清E2水平偏高，藍(lán)刺頭高、低劑量組血清E2水平偏低，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藍(lán)刺頭高、中、低劑量組之間比較，藍(lán)刺頭中劑量組血清E2水平高于藍(lán)刺頭高劑量組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藍(lán)刺頭低、中劑量組之間血清E2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），藍(lán)刺頭中劑量組血清E2表達(dá)提升明顯。己烯雌酚組E2表達(dá)比強(qiáng)骨膠囊組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清E2水平比較（±s） pg/mL

表2 各組大鼠血清E2水平比較（±s） pg/mL

注：與假手術(shù)組比較，#表示P＜0.05；與模型組比較，△表示P＜0.05；與藍(lán)刺頭中劑量組比較，☆表示P＜0.05

組別模型組假手術(shù)組藍(lán)刺頭高劑量組藍(lán)刺頭中劑量組藍(lán)刺頭低劑量組強(qiáng)骨膠囊組己烯雌酚組鼠數(shù)15 15 15 15 15 15 15 E2 21.75±0.37#40.51±2.53 24.45±2.32△35.66±3.46△23.06±1.74☆29.05±2.29△29.94±2.56△

2.3 股骨頭CYP450表達(dá)骨細(xì)胞組織切片顯示：矮柱狀、立方形的成骨細(xì)胞分布藍(lán)刺頭中劑量組比模型組明顯增多；多核型破骨細(xì)胞藍(lán)刺頭中劑量組比模型組明顯減少。表明藍(lán)刺頭中劑量組CYP450表達(dá)明顯增高。見圖2。

圖2 各組大鼠股骨頭CYP450表達(dá)（HE×400）

與假手術(shù)組相比，模型組右側(cè)股骨頭免疫組化CYP450 表達(dá)明顯減弱（P＜0.01）。與模型組相比，己烯雌酚組，強(qiáng)骨膠囊組，藍(lán)刺頭中、高劑量組股骨頭CYP450 均升高明顯（P＜0.05）；藍(lán)刺頭低劑量組股骨頭CYP450 升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同己烯雌酚組比，藍(lán)刺頭中劑量組股骨頭CYP450 升高，藍(lán)刺頭低、高劑量組CYP450 減少，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。同強(qiáng)骨膠囊組比較，藍(lán)刺頭中劑量組股骨頭CYP450 升高，藍(lán)刺頭低、高劑量組CYP450 減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。藍(lán)刺頭中劑量組股骨頭CYP450表達(dá)比高劑量組明顯，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；藍(lán)刺頭低、中劑量組股骨頭CYP450表達(dá)明顯升高，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。強(qiáng)骨膠囊組股骨頭CYP450 比己烯雌酚組高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組大鼠右側(cè)股骨頭CYP450表達(dá)比較（±s）μm2

表3 各組大鼠右側(cè)股骨頭CYP450表達(dá)比較（±s）μm2

注：與假手術(shù)組比較，#表示P＜0.05；與模型組比較，△表示P＜0.05；與藍(lán)刺頭中劑量組比較，☆表示P＜0.05

組別模型組假手術(shù)組藍(lán)刺頭高劑量組藍(lán)刺頭中劑量組藍(lán)刺頭低劑量組強(qiáng)骨膠囊組己烯雌酚組視野數(shù)25 25 25 25 25 25 25平均光密度值CYP450測定0.109±0.024#0.377±0.037 0.279±0.057△☆0.325±0.035△0.271±0.013△☆0.308±0.075△0.297±0.038△

3 討論

植物來源的食物中，亞麻籽中木脂素的量最高，具有弱的雌激素和抗雌激素活性；木脂素的結(jié)構(gòu)與他莫昔芬相似，有益于骨代謝［11-17］。DOYLE等［18］通過ERβ化學(xué)活性螢光素酶表達(dá)法研究了產(chǎn)自哥斯達(dá)黎加的17 種草藥防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的作用及機(jī)制。結(jié)果發(fā)現(xiàn)6 種草藥提取物可與雌激素結(jié)合，其中4 種草藥可以刺激雌激素基因表達(dá)；6種草藥能夠調(diào)節(jié)MCF-7細(xì)胞內(nèi)源基因表達(dá)，4種可用作雌激素激動劑，其中眾香樹和菝葜屬植物主要通過增強(qiáng)雌激素調(diào)節(jié)蛋白pS2 mRNA 的表達(dá)、降低孕激素受體和PTGES mRNA 表達(dá)來發(fā)揮雌激素激動劑或拮抗劑作用，達(dá)到治療圍絕經(jīng)期綜合征、防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的目的。補(bǔ)腎、活血化瘀中藥也含有植物雌激素，具有抑制骨吸收和促進(jìn)骨形成的作用［19-21］。

綜上所述，蒙藥藍(lán)刺頭適當(dāng)濃度具有類雌激素樣作用；藍(lán)刺頭能增強(qiáng)股骨頭CYP450 表達(dá)；藍(lán)刺頭適當(dāng)濃度具有升高股骨頭CYP450 產(chǎn)生的作用。本研究結(jié)果顯示，藍(lán)刺頭與強(qiáng)骨膠囊效果相當(dāng)，說明藍(lán)刺頭具類雌激素樣作用，其優(yōu)勢體現(xiàn)在防治PMOP 方面，為蒙醫(yī)藥“補(bǔ)暖補(bǔ)精-清鎮(zhèn)赫依-固骨質(zhì)壯骨”理論提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。