吳旭東，黃仕新，吳 鵬，徐長安，龍 騰 ，唐 旭

（1. 福建中煙工業(yè)有限責任公司技術中心，福建 廈門，361021；2. 自然資源部第三海洋研究所，福建 廈門，361005）

0 引言

【研究意義】近年來，卷煙工業(yè)企業(yè)不斷優(yōu)化提升產品結構，如何進一步提高煙葉質量和可用性、滿足卷煙品牌原料需求成為工業(yè)企業(yè)亟需解決的關鍵問題。篩選優(yōu)質的煙用產纖維素酶菌株有助于緩解煙草行業(yè)中煙葉的等級結構矛盾、部位結構矛盾和區(qū)域結構矛盾?！厩叭搜芯窟M展】纖維素是構成煙葉細胞組織和骨架的基本物質。煙葉中纖維素的含量一般在11%左右，隨著煙葉等級的降低而增加[1]。纖維素含量較高時，會使卷煙制品組織粗糙，煙葉燃燒后產生較強的嗆咳刺激感[2-4]。微生物及發(fā)酵酶制劑技術可以降低煙葉、煙草薄片及煙梗中纖維素等物質的含量，促進其內部大分子有機物質的分解和轉化，從而改善品質，減少有害物質產生[5-7]。國內外學者利用生物技術對降低煙葉及煙梗中纖維素進行了大量的研究工作。Gravely等[8]提出用曲霉屬（Asetgillusspp.）微生物來降解煙梗中的纖維素方法；葉建斌等[9]利用煙草中分離的類芽孢桿菌（Paenibacillusspp.）對再造煙葉原料進行發(fā)酵處理，發(fā)現(xiàn)再造煙葉香氣增加，刺激性明顯減輕，感官品質提升；于少藤等[10]使用從煙葉表面分離篩選到的產纖維素酶菌株（Pseudomonas gessardii）yc10對煙葉進行發(fā)酵試驗，發(fā)現(xiàn)煙葉纖維素降解率達23.49%，總糖含量增加，煙葉中香氣成分增加；王瑩等[7]和范堅強等[11]從煙草中篩選了多個可降解大分子物質的微生物，并利用所產纖維素酶和果膠酶混合處理煙絲，處理后煙絲纖維素失重率達到41.23%，煙氣細膩柔和，香氣飽滿，能有效提高煙草品質?！颈狙芯壳腥朦c】為提高纖維素降解菌在卷煙生產過程中實際應用的可行性?！緮M解決的關鍵問題】以37份片煙樣品作為研究對象，通過剛果紅染色法初篩，搖瓶液體復篩，測定菌株的CMC酶活，以分離篩選出適用于煙葉原料的高效降解纖維素菌株，通過形態(tài)特征觀察、生理生化和分子生物學方法，對篩選出的菌株進行菌種鑒定，同時對該菌株所產纖維素酶的酶學特性進行研究，為卷煙工業(yè)企業(yè)煙葉原料的保值增值提供優(yōu)質菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品 實驗所用樣品片煙來自云南、福建等國內外煙葉主產區(qū)，見表1。

表1 樣品片煙來源Table 1 Source of flue-cured tobacco strip samples

1.1.2 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2～7.4。

液體富集培養(yǎng)基：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）5 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，NH4NO31 g，酵母膏 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，K2HPO41 g，瓊脂 18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

產纖維素酶發(fā)酵培養(yǎng)基：CMC-Na 5 g，胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.0。

1.1.3 主要儀器和試劑 儀器：GR60DF全自動立式高壓滅菌鍋（廈門致微儀器有限公司），MQT-60R振蕩培養(yǎng)箱（上海旻泉儀器有限公司），SW-CJIFD超凈工作臺（蘇州凈化有限公司），生化培養(yǎng)箱（寧波萊福科技有限公司），徠卡顯微鏡DM570（徠卡儀器有限公司）。

試劑：剛果紅、3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、葡萄糖等常規(guī)試劑均為國產分析純。PCR引物由上海生工合成。細菌基因組DNA提取試劑盒購自上海賽百盛基因有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌株的富集與篩選 稱取碾碎后的片煙2 g置于50 mL液體富集培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h后，取富集后的培養(yǎng)液稀釋涂布至篩選培養(yǎng)基平板上，37 ℃培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)48～72 h，再進行剛果紅染色，選擇生長較好、透明圈較大的菌株接于斜面和LB固體培養(yǎng)基中。

1.2.2 DNS試劑制備 甲液配制：6.9 g結晶苯酚溶于15.2 mL 10% 氫氧化鈉，加蒸餾水稀釋至69 mL，再加6.9 g 亞硫酸氫鈉溶解備用；乙液配制：225 g酒石酸鉀鈉溶于300 mL 10% 氫氧化鈉，加入880 mL 1% 3,5-二硝基水楊酸。將甲、乙液混合于棕色瓶靜置7～10 d即可。

1.2.3 粗酶液的制備 將篩選得到的菌株接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min-1振蕩活化過夜后，按5%接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵24 h，獲得的發(fā)酵液在 4 ℃、10 000 r·min-1離心 6 min，所得上清液即為粗酶液，后續(xù)進行酶活測定。

1.2.4 酶活力測定

1.2.4.1 葡萄糖標準曲線的繪制 取6支10 mL刻度試管并編號，按表2分別加入質量濃度為1.5 mg·mL-1的葡萄糖溶液、蒸餾水和DNS試劑，配成不同葡萄糖含量的反應液。將各管搖勻后，沸水浴10 min，冷卻后加純水定容至10 mL，顛倒混勻后吸取200 μL至96孔板檢測OD540值，以葡萄糖質量（mg）為橫坐標，扣除空白后的OD540值為縱坐標繪制標準曲線。

表2 葡萄糖標準曲線制作參數(shù)Table 2 Parameter of glucose standard curve

1.2.4.2 CMC酶活測定 參考羅燕青等[12]的方法，進行略微改動。在10 mL刻度試管中（3支實驗管）加入0.2 mL稀釋酶液，加入1.8 mL 1%的CMC-Na溶液（pH 5），搖勻，于60 ℃條件下水浴10 min，取出冷卻至室溫，加入1.5 mL DNS試劑，迅速混勻后沸水浴反應10 min，冷卻后，加水定容至10 mL，輕輕上下?lián)u勻，另取稀釋酶液0.2 mL和0.1 mol·L-1pH為5的緩沖溶液1.8 mL作為空白，不加CMC溶液，同樣依上述步驟，用空白調零點，于波長540 nm測吸光度值。

酶活力單位定義：在60 ℃，pH 5.0條件下，催化1% CMC-Na每分鐘生成1 μg還原糖所需的酶量作為 1 個酶活力單位 U（μg·min-1·mL-1）。

式中G：由標準曲線查得的葡萄糖質量（mg）；N1：粗酶液稀釋倍數(shù)；N2：比色時反應液稀釋倍數(shù)；103：毫克與微克的轉換；10：酶水解反應時間（min）；0.2：測定酶活力時所用粗酶液的體積（mL）。

1.2.5 菌株的鑒定

1.2.5.1 形態(tài)觀察及生理生化特性 參照《伯杰氏菌手冊》[13]、《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]觀察菌株的培養(yǎng)形態(tài)、革蘭氏染色與芽孢染色，并測定其生理生化特征。

1.2.5.2 分子生物學鑒定 按細菌基因組DNA提取試劑盒（上海賽百盛）提取總DNA，使用標準引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴增 16S rRNA序列，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測為單一明亮條帶，切下條帶經膠回收試劑盒（上海生工）回收PCR產物送測序公司（廣州基迪奧）進行測序，測序結果上傳NCBI進行BLAST分析，采用MEGA 5.1軟件中的鄰接法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.6 纖維素酶酶學特性研究

1.2.6.1 最適反應溫度的測定 在10 mL刻度試管中加入稀釋酶液與1%的CMC溶液（pH 5）后，于不同溫度 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃條件下水浴，其他條件同“1.2.4”的方法，測定不同溫度下CMC酶活。

1.2.6.2 最適反應pH的測定 在上一步得出最適溫度條件下，設置加入1%的CMC溶液的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，其他條件同“1.2.4”的方法，進行酶活反應測定。

1.2.6.3 酶的熱穩(wěn)定性的測定 在進行酶活反應前，先將酶液分別置于 30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃ 溫度下保溫 30 min，再按照“1.2.4”的方法，進行酶活反應測定。其中以未處理的酶液酶活力為100%，得到該纖維素酶對溫度的耐受力結果。

1.2.6.4 酶的酸堿穩(wěn)定性的測定 在進行酶活反應前，先將酶液分別于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中，4 ℃保溫30 min后，再按照“1.2.4”的方法，進行酶活反應測定。其中以未處理的酶液酶活力為100%，得到該纖維素酶對溫度的耐受力結果。

2 結果與分析

2.1 菌株的分離與篩選

經分離純化得到的菌株于篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h后，通過剛果紅染色，比較水解圈直徑（H）和菌落直徑（C）大小，選擇比值較大的菌株進行復篩，最終得到一株酶活力為56.261 U·mL-1的菌株，編號為FX-1，其剛果紅染色結果見表3，纖維素酶水解圈見圖1，以此作為后續(xù)研究對象。

圖1 菌株FX-1纖維素酶水解圈Fig. 1 Cellulase hydrolysis circle of FX-1

表3 FX-1菌株剛果紅染色結果Table 3 Congo red staining of FX-1

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株的形態(tài)及生理生化鑒定 菌株FX-1在LB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落為灰白色、干燥、表面有不規(guī)則隆起褶皺，邊緣毛刺狀，結果如圖2-A所示；透射電鏡觀察顯示菌體呈棒狀或近棒狀，長約為 1.6～2.2 μm，粗約 0.8～1.0 μm，多為 2 個或2個以上菌體鏈狀連接，結果如圖2-B所示；革蘭氏染色陽性，菌體呈現(xiàn)為桿狀，芽孢染色為綠色，菌體為紅色，芽孢中生，橢圓形，不膨大，結果如圖2-C、D所示；其部分生理生化特性見表4。根據這些特征，可初步判斷該菌株為芽孢桿菌屬（Bacillusspp.）細菌。

圖2 菌株 FX-1 形態(tài)特征Fig. 2 Morphological characteristics of FX-1

2.2.2 分子生物學鑒定 FX-1的16S rRNA序列長度為1 416 bp，NCBI比對顯示FX-1的16S rRNA序列與Bacillus subtilis相似度最高（100%），進一步使用MEGA軟件（版本5.1）利用NJ法構建FX-1系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖3所示。結果顯示FX-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillustequilensis）（相似度99.79%）處于同一分支，置信度為86%，結合生理生化特征（表4），將FX-1鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

表4 菌株FX-1的生理生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of FX-1

圖3 FX-1菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of FX-1

2.3 酶活力測定

2.3.1 葡萄糖標準曲線 由圖4可見，標準曲線y=0.309 4x-0.010 2，線性相關系數(shù)R2為0.998 4，線性良好，可以用于纖維素酶活測定。

圖4 葡萄糖標準曲線Fig. 4 Standard curve of glucose

2.3.2 纖維素酶活性分析 用不同發(fā)酵時間的粗酶液測定FX-1菌株的CMC酶活力，同時測定相應時間菌株的生長量情況，結果如圖5，表明FX-1菌株在發(fā)酵48 h時纖維素酶酶活力最高，達56.261 U·mL-1，而其生物量最高時是在36 h。在48 h后，菌株的產酶活性隨著生物量的下降而有所降低，在一定時間內二者呈正相關。由此可見，該纖維素酶合成模式屬于延續(xù)合成型[15]。

圖5 培養(yǎng)時間對菌株生長和產酶的影響Fig. 5 Effect of incubation time on growth and enzyme production of FX-1

2.4 菌株FX-1所產纖維素酶的酶活特性

2.4.1 FX-1纖維素酶最適反應溫度 以羧甲基纖維素鈉為底物，溫度為30～75 ℃，測定不同溫度下CMC酶活力，結果如圖6，表明FX-1所產生的纖維素酶在60 ℃條件下酶活力達最大值，且在30～70 ℃均有活性。這說明該酶最適反應溫度為60 ℃，具有良好的耐熱性。

圖6 FX-1纖維素酶不同反應溫度條件下酶活變化情況Fig. 6 FX-1 cellulase activity at different reaction temperatures

2.4.2 FX-1纖維素酶最適反應pH 在得出最適溫度條件下，以不同pH的羧甲基纖維素鈉溶液為底物，測定CMC酶活力，結果如圖7，表明FX-1菌株產生的纖維素酶的最適反應pH為5.0，且該酶在pH 3.0～8.0均有活性，與王霞等[16]獲得的地衣芽孢桿菌CMC-4所產纖維素酶適應性pH范圍相似，且范圍更大，說明該菌株所產纖維素酶pH適應范圍較廣，具有較好的耐酸性與耐堿性。

圖7 FX-1纖維素酶不同pH條件下酶活變化情況Fig. 7 FX-1 cellulase activity under different pH conditions

2.4.3 FX-1纖維素酶的熱穩(wěn)定性 在進行酶活反應前，先將酶液分別置于30、35、40、45、50、55、60、65、70、75 ℃溫度下保溫30 min，再測定CMC酶活力，結果如圖8，表明CMC在30～55 ℃下熱穩(wěn)定較好，相對酶活有90%以上；當在溫度≥60 ℃保溫30min時，酶活力迅速下降，但相對酶活依然高于30%，說明該酶具有一定的耐熱性。

圖8 FX-1纖維素酶在不同溫度環(huán)境下的耐受情況Fig. 8 Tolerance of FX-1 cellulase to elevated temperatures

2.4.4 FX-1纖維素酶的酸堿耐受能力 在進行酶活反應前，先將酶液分別于pH 3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的緩沖液中，4 ℃保溫30 min，再測定CMC酶活，結果如圖9，表明pH 為3.0～7.0，CMC酶較穩(wěn)定，當pH為8.0時，酶活迅速下降，但相對酶活依然高于60%，說明該酶具有一定的耐酸堿能力，但主要過程pH值還是較為偏酸性，可知該酶為酸性酶[17]。

圖9 FX-1纖維素酶在不同酸堿環(huán)境下的耐受情況Fig. 9 Tolerance of FX-1 cellulase to acidic and alkaline conditions

3 結論與討論

纖維素降解菌廣泛分布于自然界，細菌、真菌、放線菌等微生物在一定條件下都能合成、分泌纖維素酶[18]。細菌是微生物中種類最多，數(shù)量廣泛的類群。與真菌相比，細菌生長更迅速，環(huán)境適應能力更強，其中芽孢桿菌具有良好的穩(wěn)定性、環(huán)境適應性以及產酶活性高等優(yōu)點，有利于工農業(yè)應用[18,19],，也更適于煙草行業(yè)。目前，關于芽孢桿菌產纖維素酶活性的研究多有報道，如薛磊等[20]研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬細菌是云南煙草種植區(qū)的優(yōu)勢菌群，篩選到的芽孢桿菌YN14產纖維素酶活性高；Abd等[21]在對土壤和灌溉水產纖維素酶細菌的分離篩選研究中，發(fā)現(xiàn)能夠分泌纖維素酶的40株菌株中，纖維素酶活力最高的5株菌皆為芽孢桿菌；Yang等[22]表明在所有的纖維素分解細菌分離物中，蠟樣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌的纖維素酶活性最高。

分離篩選到可有效降解纖維素的纖維素酶高產菌株是實現(xiàn)應用的前提。本研究從37份片煙樣品中分離篩選到了一株產纖維素酶菌株FX-1，該菌株能在以羧甲基纖維素鈉（CMC）為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長，剛果紅染色后有明顯的透明圈。菌落為灰白色、干燥、表面有不規(guī)則隆起褶皺；透射電鏡觀察顯示菌體呈棒狀或近棒狀的桿菌；部分生理生化測試結果顯示菌株FX-1為革蘭氏陽性，接觸酶實驗陽性，V-P試驗測定陽性，能還原硝酸鹽和檸檬酸鹽。上述形態(tài)觀察和生理生化特征與芽孢桿菌屬Bacillus細菌的表型特征相似。從16S rRNA序列與Bacillus subtilis相似性（相似度最高100%）和系統(tǒng)發(fā)育進化樹分析，F(xiàn)X-1與枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、特基拉芽孢桿菌（Bacillus tequilensis）（相似度99.79%）處于同一分支，置信度為86%。綜上，結合生理生化、16S rRNA基因序列同源性、系統(tǒng)發(fā)育樹等方面分析，將FX-1初步鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）。

從枯草芽孢桿菌FX-1產纖維素酶的生長特性可以看出，發(fā)酵48小時，纖維素酶酶活性可以達到56.261 U·mL-1。此前很多煙草源產纖維素酶菌株的篩選研究中，楊宗燦等[23]從原煙表面分離篩選得到的煙葉纖維素降解菌株XC-19-1，其發(fā)酵產纖維素酶活性為6.6 U·mL-1；鄒芳等[24]從煙稻輪作區(qū)獲得的枯草芽孢桿菌YC-2的CMC酶活力為38.65 U·mL-1；梅金飛[25]從煙草秸稈廢棄物中獲得的嗜熱芽孢桿菌SL-2A的 CMC最大酶活力為 48.72 U·mL-1?？梢娍莶菅挎邨U菌FX-1具有較高的纖維素酶活性。對其酶學特性研究也表明，F(xiàn)X-1菌株所產纖維素酶活穩(wěn)定，在pH 3.0～7.0、溫度30～55 ℃保溫30 min后仍有較高活力，說明其具有較強的耐酸能力和耐熱能力。該酶催化的最適pH值為5.0，最適溫度為60 ℃，可知該酶為中溫酸性酶。綜上，本研究所得菌株FX-1是1株能高產酸性纖維素酶的枯草芽孢桿菌，經進一步開發(fā)后，將在煙草行業(yè)中具有良好的產業(yè)化應用前景。