呼芳娣，劉麗君，馬 驪，牛早霞，孫柏林，徐 佳，楊雯昕，劉 博，蒲媛媛，武軍艷，方 彥，李學(xué)才，沈金雄，孫萬(wàn)倉(cāng)

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅省油菜工程技術(shù)研究中心，省部共建干旱生境作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué))，甘肅省作物遺傳改良與種質(zhì)創(chuàng)新重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心，湖北 武漢 430070)

低溫是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育及地理分布起決定性作用[1]。甘藍(lán)型冬油菜是我國(guó)重要的油料作物，與白菜型冬油菜相比，具有產(chǎn)量好、品質(zhì)優(yōu)的特性，但由于其抗寒性較弱，嚴(yán)重影響了甘藍(lán)型冬油菜在我國(guó)北方地區(qū)的種植[2]。

下胚軸是連接兩個(gè)子葉和初生根(胚根)的幼莖[3]。植物下胚軸的伸長(zhǎng)是植物對(duì)環(huán)境脅迫的重要適應(yīng)機(jī)制[4]，其伸長(zhǎng)的程度主要受溫度、光照等環(huán)境因子和內(nèi)源激素的雙重調(diào)控[5-6]。甘藍(lán)型冬油菜下胚軸長(zhǎng)度與其抗寒性強(qiáng)弱密切相關(guān)，下胚軸越短，其抗寒性越強(qiáng)。相關(guān)研究表明，抗寒性強(qiáng)的品種將有機(jī)物運(yùn)輸至地下部，給予越冬期植物抵御低溫的能量保障，而抗寒性弱的品種將光合產(chǎn)物運(yùn)輸至地上部，易造成地上部的徒長(zhǎng)，導(dǎo)致下胚軸伸長(zhǎng)，降低其抗寒能力[7]。金姣姣[8]通過(guò)對(duì)不同抗寒性甘藍(lán)型冬油菜品種的下胚軸長(zhǎng)度觀察發(fā)現(xiàn)，在甘藍(lán)型冬油菜的幼苗時(shí)期，抗寒性不同品種的下胚軸伸長(zhǎng)長(zhǎng)度不同，強(qiáng)抗寒品種下胚軸伸長(zhǎng)較短，弱抗寒品種伸長(zhǎng)較長(zhǎng)。

生長(zhǎng)素是植物發(fā)育的主要調(diào)節(jié)因子，參與協(xié)調(diào)植物生長(zhǎng)的幾乎所有方面[9]。低溫脅迫下，植物體內(nèi)激素水平會(huì)發(fā)生變化進(jìn)而調(diào)控生理代謝活動(dòng)，激活抗寒基因表達(dá)[10]，增強(qiáng)植物抗寒性[11]。色氨酸轉(zhuǎn)氨酶(TAA)/YUCCA(YUC)途徑是生長(zhǎng)素生物合成的主要途徑[12]，YUCCA家族基因編碼的含黃素單加氧酶是該生物合成途徑的限速酶，能夠催化以色氨酸為前體的IPA轉(zhuǎn)化為IAA[13]。擬南芥藍(lán)光受體ZTL正向調(diào)節(jié)地上部分生長(zhǎng)素合成的IPA途徑中YUCCA8基因的表達(dá)，從而促進(jìn)下胚軸伸長(zhǎng)。相對(duì)于野生型，擬南芥ztl突變體下胚軸較短，YUCCA8表達(dá)水平降低[14]，表明YUCCA8基因在調(diào)控?cái)M南芥下胚軸長(zhǎng)短方面發(fā)揮重要作用。高溫誘導(dǎo)下，擬南芥生長(zhǎng)素生物合成基因YUCCA8被光信號(hào)途徑關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子PIF4激活從而調(diào)節(jié)高溫引起的下胚軸伸長(zhǎng)[15]。且yuc8突變可以在很大程度上抑制 PIF4 過(guò)表達(dá)植物的長(zhǎng)下胚軸的表型，也可以減少高溫誘導(dǎo)下下胚軸伸長(zhǎng)[16]。雖然YUCCA8基因在生長(zhǎng)素及下胚軸調(diào)控方面研究較多，但主要集中于高溫誘導(dǎo)下， 且YUCCA8通過(guò)調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)適應(yīng)低溫脅迫方面的研究鮮有報(bào)道。

蒲媛媛[2]將甘藍(lán)型油菜‘16VHNTS158’種植于蘭州上川(36°03′N(xiāo)、海拔2150 m)，地膜覆蓋以后發(fā)現(xiàn)其越冬率為10.6%，‘16VHNPZ269’為11.7%，‘天油 2288’為0%，其半致死溫度和春化率見(jiàn)表1，由表1可知‘16VHNTS158’和‘天油 2288’抗寒性具有差異。本文從甘藍(lán)型冬油菜中克隆獲得BnYUCCA8基因，對(duì)其進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，并分析了其在不同組織及低溫脅迫下表達(dá)量的變化。檢測(cè)了低溫脅迫下根和葉中內(nèi)源 IAA 含量的變化。對(duì)表達(dá)量、內(nèi)源 IAA 含量和下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行了相關(guān)性分析，以期為探究甘藍(lán)型冬油菜抗寒性與下胚軸長(zhǎng)度之間的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

表1 試驗(yàn)材料抗寒特性及來(lái)源

1 材料和方法

1.1 材料

于2020年9月17日，將甘藍(lán)型油菜品系‘16VHNTS158’、‘16VHNPZ269’和‘天油 2288’播種于甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)百草園試驗(yàn)基地，待長(zhǎng)至五葉期，即同年11月12日，選取各材料中完整性好的單株，取第5片真葉，3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，于-80℃冰箱備用，用于基因克隆。待其越冬抽薹后，即2021年4月23日，取成熟根、莖、葉、下胚軸、花、花蕾、角果于-80℃冰箱備用，每個(gè)組織部位3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于組織表達(dá)分析。2021年3月11日，將‘16VHNTS158’和‘天油2288’進(jìn)行盆栽，待油菜長(zhǎng)至5～6葉期時(shí)，各取3盆取其植株的根、莖、葉、下胚軸，液氮冷凍后放入-80℃冰箱備用，用于組織表達(dá)分析，將剩余盆栽材料全部置于22℃培養(yǎng)箱處理48 h后，分別放置于常溫(22℃)、4℃、0℃、-4℃培養(yǎng)箱，每隔0、3、6、24 h取樣，各處理?xiàng)l件下分別取葉和根的3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，用于低溫脅迫下熒光定量PCR及內(nèi)源IAA含量的測(cè)定。

1.2 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)北京天根生物公司RNAprep Pure Plant Kit 植物總RNA提取試劑盒提取試驗(yàn)材料各組織總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA條帶，按PrimeScript RTrea-gent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(大連TaKaRa公司)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到單鏈cDNA，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 YUCCA8基因的克隆

根據(jù)NCBI甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)中所預(yù)測(cè)的YUCCA8(ID:106359824)基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)基因克隆引物，YUCCA8-F：5′-ATGGAGAGTATGTTTCGTTTGATG-3′，YUCCA8-R：5′-TTAGAATTGTTGGGAGATACATCTTCTAT-3′；以葉片cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，53.6℃退火30 s，72℃延伸60 s，循環(huán)35次；72℃終延伸10 min；4℃保存。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，采用北京天根的膠回收試劑盒進(jìn)行純化回收，回收產(chǎn)物與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，結(jié)合藍(lán)白斑篩選和菌落PCR鑒定結(jié)果，挑選出陽(yáng)性單菌落送上海生工生物工程公司測(cè)序。

1.4 YUCCA8基因的生物信息學(xué)分析

利用DNAMAN軟件進(jìn)行克隆基因的多重序列比對(duì)和氨基酸同源性分析；Expasy在線(xiàn)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；SignalP-5.0 Server預(yù)測(cè)蛋白信號(hào)肽；SOPMA在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)；SWISS-MODEL在線(xiàn)預(yù)測(cè)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)；MEGA7.0軟件分析系統(tǒng)進(jìn)化；TMHMM Server v.2.0在線(xiàn)預(yù)測(cè)跨膜結(jié)構(gòu)；Wolf-psort在線(xiàn)預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；NCBI在線(xiàn)工具Conserved Domain Search Service進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)分析。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)反應(yīng)體系為20 μL：SYBR Premix Ex Taq TM Ⅱ 10 μL、正向引物/反向引物各0.8 μL、cDNA 2.0 μL、ddH2O 6.4 μL。內(nèi)參基因?yàn)锳ctin[17]。采用2-ΔΔCT對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算，并用Duncan法進(jìn)行差異顯著性分析。

1.6 IAA提取及含量測(cè)定

使用美國(guó)Waters Arc型高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。色譜條件為：色譜柱：Symmetry C18色譜柱(4.6×250 mm、5 μm)；流動(dòng)相：甲醇+0.1%磷酸(百分?jǐn)?shù)為體積比)；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30℃。

激素提取方法：參照趙楊靜等[18]的方法，略有改良。取油菜根部0.1 g，放入研缽，液氮中研磨成粉末加入6 ml提取液A(正丙醇∶水∶HCl=2∶1∶0.002,體積比)。4℃搖床100 r·min-1震動(dòng)30 min，加入3 mL提取液B(二氯甲烷)，4℃搖床100 r·min-1震動(dòng)30 min；取出后4℃ 13 000 r·min-1離心5 min，此時(shí)溶液分層，用巴氏滴管吸取有機(jī)層溶液，氮?dú)獯蹈桑尤?0%甲醇水溶液1 ml；過(guò)0.22 μm有機(jī)針孔濾膜，裝入樣品瓶中置于4℃冰箱待測(cè)。

2 結(jié)果分析

2.1 BnYUCCA8基因的cDNA克隆

采用同源克隆技術(shù)，以甘藍(lán)型冬油菜cDNA為模板，利用擴(kuò)增特異性引物，對(duì)目的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到與預(yù)期大小相符的條帶(圖1)，將目的片段純化回收，回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后測(cè)序，得到全長(zhǎng)片段為1281bp的CDS序列，與預(yù)期結(jié)果相吻合。命名為BnYUCCA8。

M： DNA marker;1： ‘16VHNTS158’;2： ‘16VHNPZ269’;3： ‘天油 2288’ ‘Tianyou 2288’

2.2 BnYUCCA8基因生物信息學(xué)分析

對(duì)從‘16VHNPZ269’中克隆得到的BnYUCCA8基因序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析表明，基因的起始密碼子ATG，終止密碼子TAA，編碼含426aa的蛋白質(zhì)(圖2)，相對(duì)分子質(zhì)量約47.78 kD，理論等電點(diǎn)為9.02。基因由20種氨基酸組成，其中Val、Leu、Gly 3種氨基酸所占比例最高，分別為9.1%、8.7%、7.5%，負(fù)電荷殘基總數(shù)(Asp+Glu)為47，正電荷殘基總數(shù)(Arg+Lys)為57；分子式為C2134H3379N585O615S22，總親水性平均系數(shù)為-0.237，蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為49.54，是一個(gè)不穩(wěn)定的疏水性蛋白(圖3A)，屬于CzcO超家族(圖3D)。跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)表明BnYUCCA8蛋白存在一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)(圖3F)，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)主要位于細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，不含信號(hào)肽，推測(cè)其為非分泌蛋白(圖3E)。

注：(A) 圖中黃色方框?yàn)閮?nèi)含子區(qū)域。(B) 圖中上游起始密碼子ATG用方框表示；*為終止密碼子TAA的位置。

YUCCA8蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，無(wú)規(guī)則卷曲(Randomcoil)含量最豐富，為41.45%，其次是33.02%的α-螺旋(α-Helix)，延伸鏈(Extended strand)和β-轉(zhuǎn)角(β-turn)含量最少，分別為17.56%和7.96%(圖3C)。以6sek.1為模板，對(duì)BnYUCCA8基因編碼蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行模型構(gòu)建，模型序列一致性達(dá)到23.28%(圖3B)。

圖3 甘藍(lán)型冬油菜‘16VHNNPZ269’ BnYUCCA8蛋白質(zhì)特性分析

甘藍(lán)型冬油菜‘16VHNPZ269’中BnYUCCA8基因?qū)?yīng)的氨基酸序列與甘藍(lán)型油菜數(shù)據(jù)庫(kù)中YUCCA8基因?qū)?yīng)的氨基酸序列相似性為98.13%、與擬南芥AtYUCCA8基因?qū)?yīng)的氨基酸序列相似度為88.11%、與‘16VHNTS158’和‘天油2288’對(duì)應(yīng)序列相似性分別為98.59%和89.72%，‘16VHNTS158’與‘天油2288’對(duì)應(yīng)序列相似性為89.72%(圖4)。

圖4 不同材料氨基酸序列多重比對(duì)

2.3 BnYUCCA8的序列進(jìn)化分析

利用MEGA 7.0軟件將克隆獲得的甘藍(lán)型油菜YUCCA8蛋白的氨基酸序列與從NCBI下載的11種植物的YUCCA8蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)(圖5)，結(jié)果表明，甘藍(lán)型油菜該蛋白與薺菜同源性最高，其次為擬南芥，與白芥和薺藍(lán)的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

圖5 不同植物YUCCA8蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析

2.4 甘藍(lán)型冬油菜BnYUCCA8基因的組織部位表達(dá)分析

組織表達(dá)分析結(jié)果顯示(圖6)，BnYUCCA8基因在所有組織部位均有表達(dá)，且其表達(dá)量表現(xiàn)出組織部位差異和生長(zhǎng)時(shí)期差異。BnYUCCA8基因在下胚軸伸長(zhǎng)較短的‘16VHNTS158’的苗期階段(圖6A)，葉和根中表達(dá)量最高，莖和下胚軸中表達(dá)量次之；花期階段，根和葉中表達(dá)量最高，其次為莖、下胚軸、花蕾，花和角果中表達(dá)量相對(duì)較低。下胚軸伸長(zhǎng)較長(zhǎng)的‘天油 2288’與下胚軸伸長(zhǎng)較短的‘16VHNTS158’具有相同的表達(dá)模式(圖6B)，即在苗期和花期兩個(gè)時(shí)期都表現(xiàn)出根和葉中的表達(dá)量高，其次依次為莖、下胚軸、花蕾、花、角果。

注：不同字母表示BnYUCCA8基因相對(duì)表達(dá)量分別在苗期和花期的不同組織部位間差異顯著(P<0.05)

兩個(gè)材料同一組織部位比較結(jié)果顯示，除花期莖中‘16VHNTS158’基因表達(dá)量高于‘天油 2288’，其他組織部位基因表達(dá)量皆為下胚軸較長(zhǎng)的‘天油 2288’高于下胚軸較短的‘16VHNTS158’。在油菜苗期和花期的生育進(jìn)程中，BnYUCCA8基因表達(dá)量表現(xiàn)為苗期高于花期。

2.5 低溫脅迫下BnYUCCA8基因在根和葉中的表達(dá)量變化

低溫脅迫下BnYUCCA8基因表達(dá)量分析結(jié)果見(jiàn)圖7，由圖7A可得，在‘16VHNTS158’的根中，隨著溫度降低，BnYUCCA8基因表達(dá)量總體呈降低趨勢(shì)，0℃較4℃時(shí)基因表達(dá)量略有升高，且隨著低溫脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)其基因表達(dá)量降低，低溫脅迫處理24 h時(shí)基因表達(dá)量在不同溫度梯度處理下的變化幅度較常溫(22℃)更為明顯，在4℃、0℃、-4℃的降幅分別為43%、17%、87%，且由圖7C可得，‘天油2288’根中，4℃、0℃、-4℃的降幅分別為45%、20%、54%。相同處理溫度及時(shí)間下，‘天油2288’的基因表達(dá)量高于‘16VHNTS158’。

對(duì)葉中BnYUCCA8基因表達(dá)量分析表明，在相同處理時(shí)間下，隨溫度降低其基因表達(dá)量變化模式與根中一致，處理時(shí)間越長(zhǎng)，低溫脅迫下表達(dá)量變化趨勢(shì)越大，表達(dá)量越低。由圖7B可得，處理24 h時(shí)，‘16VHNTS158’葉中，4℃、0℃、-4℃下的表達(dá)量較常溫(22℃)分別降低了29%、28%、73%，由圖7D可得，‘天油2288’分別降低了43%、28%、64%。相同處理溫度及時(shí)間下，‘天油2288’較‘16VHNTS158’BnYUCCA8基因表達(dá)量高，由此表明BnYUCCA8基因可能通過(guò)調(diào)控下胚軸伸長(zhǎng)進(jìn)而參與甘藍(lán)型冬油菜抗寒性的調(diào)控。

注：不同小寫(xiě)字母表示BnYUCCA8基因相對(duì)表達(dá)量在相同處理時(shí)間不同溫度間差異顯著(P<0.05)。

2.6 低溫脅迫對(duì)甘藍(lán)型冬油菜內(nèi)源IAA含量的影響

內(nèi)源IAA含量的測(cè)定結(jié)果表明(圖8)，隨著溫度降低，內(nèi)源IAA含量降低。在處理24 h時(shí)，相比于對(duì)照(22℃)，‘16VHNTS158’中IAA含量在4℃、0℃、-4℃時(shí)分別降低了68%、92%、97%(圖8A)?！煊?288’中分別降低了77%、89%、94%(圖8B)。相同處理時(shí)間及溫度下‘16VHNTS158’內(nèi)源IAA含量較‘天油2288’低,其中在處理24 h時(shí)，‘16VHNTS158’較‘天油2288’IAA含量在常溫(22℃)、4℃、0℃、-4℃分別低19%、14%、40%、39%。

圖8 甘藍(lán)型冬油菜根中內(nèi)源IAA含量對(duì)低溫的響應(yīng)

2.7 甘藍(lán)型冬油菜BnYUCCA8基因表達(dá)量、生長(zhǎng)素含量與下胚軸長(zhǎng)度之間的相關(guān)關(guān)系

由表2可知，下胚軸伸長(zhǎng)較短的強(qiáng)抗寒性品種‘16VHNTS158’中BnYUCCA8基因相對(duì)表達(dá)量和生長(zhǎng)素含量之間存在顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.682，下胚軸長(zhǎng)度與BnYUCCA8基因相對(duì)表達(dá)量、生長(zhǎng)素含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.540和0.427；下胚軸伸長(zhǎng)較長(zhǎng)的弱抗寒性品種‘天油 2288’中BnYUCCA8基因相對(duì)表達(dá)量和生長(zhǎng)素含量之間存在極顯著正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.812，下胚軸長(zhǎng)度與BnYUCCA8基因相對(duì)表達(dá)量、生長(zhǎng)素含量之間存在正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)分別為0.410和0.591。

表2 甘藍(lán)型冬油菜BnYUCCA8基因表達(dá)量、生長(zhǎng)素含量與下胚軸長(zhǎng)度的Pearson相關(guān)

3 討 論

YUCCA是植物IAA合成過(guò)程中的限速酶，其生物學(xué)功能在多種植物中得到了廣泛挖掘[19-20]，YUCCA8基因?qū)儆赮UCCA家族成員，目前，在甘藍(lán)型冬油菜中未見(jiàn)有YUCCA8基因相關(guān)研究報(bào)道。本文克隆的YUCCA8基因CDS序列為1 281 bp，編碼426個(gè)氨基酸，利用生物信息學(xué)分析其是一個(gè)不穩(wěn)定的疏水性蛋白，不同物種間具有高度保守性，袁美同等[21]通過(guò)對(duì)梨YUCCA基因家族鑒定得出PbYUCCA8蛋白編碼423個(gè)氨基酸，不穩(wěn)定指數(shù)為48.17，總親水性平均系數(shù)為-0.167，也是一個(gè)不穩(wěn)定的疏水性蛋白。

甘藍(lán)型冬油菜BnYUCCA8基因時(shí)空表達(dá)特征分析結(jié)果表明，其在葉和根中表達(dá)量最高，莖和下胚軸中次之，花、花蕾和角果中表達(dá)量相對(duì)較低。擬南芥中YUCCA8轉(zhuǎn)錄水平在幼葉中最高，在成熟的葉、根和花芽中較低，莖中幾乎檢測(cè)不到[22]，與本文在莖中的表達(dá)量不同可能與物種間差異有關(guān)。YUCCA8過(guò)表達(dá)的擬南芥下胚軸較長(zhǎng)[23]，而yuc8突變可以抑制光信號(hào)途徑的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子 PIF4過(guò)表達(dá)，從而抑制其下胚軸伸長(zhǎng)[16]，本文研究發(fā)現(xiàn)，YUCCA8基因的表達(dá)量在‘天油2288’(下胚軸伸長(zhǎng)較長(zhǎng))較‘16VHNTS158’(下胚軸伸長(zhǎng)較短)中低，表明YUCCA8基因在調(diào)控下胚軸長(zhǎng)短的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。

目前，YUCCA8基因響應(yīng)溫度的研究主要集中于高溫誘導(dǎo)下YUCCA8調(diào)控下胚軸長(zhǎng)短[15]，而對(duì)低溫條件下YUCCA8與生長(zhǎng)素及下胚軸的相關(guān)關(guān)系研究甚少，因此，本文通過(guò)對(duì)甘藍(lán)型冬油菜進(jìn)行低溫脅迫處理，測(cè)定BnYUCCA8基因的表達(dá)量變化，結(jié)果表明隨著溫度降低，BnYUCCA8基因表達(dá)量整體呈降低趨勢(shì)，在0℃較4℃時(shí)表達(dá)量略有升高，與內(nèi)源IAA對(duì)低溫脅迫的適應(yīng)趨勢(shì)基本一致。表明BnYUCCA8基因可能通過(guò)生長(zhǎng)素的調(diào)控機(jī)制參與了對(duì)油菜低溫脅迫的響應(yīng)。

低溫脅迫通常會(huì)引起植物體內(nèi)激素水平發(fā)生變化，從而對(duì)植物生理代謝活動(dòng)作出調(diào)節(jié)反應(yīng)[10]。本文通過(guò)對(duì)低溫脅迫下內(nèi)源IAA含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，隨著溫度降低，2個(gè)抗寒性不同的甘藍(lán)型冬油菜內(nèi)源IAA含量不斷降低，且下胚軸伸長(zhǎng)較長(zhǎng)的弱抗寒品種‘天油2288’較下胚軸伸長(zhǎng)較短的強(qiáng)抗寒品種‘16VHNTS158’內(nèi)源IAA含量高，表明內(nèi)源IAA含量與甘藍(lán)型冬油菜的抗寒性呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。韋霞霞等[24]通過(guò)對(duì)葡萄抗寒性與生長(zhǎng)素積累相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)素(IAA)在抗寒性越強(qiáng)的品種中含量越低。許耀照等[25]研究表明，不同抗寒性白菜型冬油菜品種葉片IAA含量隨著生育進(jìn)程中氣溫的降低均呈先升高后降低的趨勢(shì)，進(jìn)入越冬階段之后，弱抗寒品種葉片和根中IAA含量均高于強(qiáng)抗寒品種。劉世紅等[26]采用ELISA技術(shù)測(cè)定自然降溫過(guò)程中油棕葉片內(nèi)源激素含量變化，研究發(fā)現(xiàn)，從26℃降到18℃，IAA含量基本不變，低于18℃后，IAA含量顯著增加，抗寒性強(qiáng)的品種IAA含量高，表明IAA含量的增加利于提高抗寒力，這可能與10℃以上低溫處理過(guò)程有關(guān)。

通過(guò)對(duì)甘藍(lán)型冬油菜BnYUCCA8基因表達(dá)量、內(nèi)源IAA含量和下胚軸長(zhǎng)度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明2個(gè)抗寒性不同材料的甘藍(lán)型冬油菜3個(gè)指標(biāo)間的相關(guān)性表現(xiàn)一致，BnYUCCA8的基因表達(dá)量和內(nèi)源IAA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，下胚軸長(zhǎng)度與BnYUCCA8基因表達(dá)量和IAA含量呈正相關(guān)關(guān)系，證實(shí)BnYUCCA8是生長(zhǎng)素調(diào)控關(guān)鍵基因，且其在下胚軸伸長(zhǎng)程度方面發(fā)揮正向調(diào)節(jié)作用。但是關(guān)于該基因在甘藍(lán)型冬油菜低溫處理過(guò)程中的作用機(jī)制及相關(guān)功能還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本研究從甘藍(lán)型冬油菜中克隆到Y(jié)UCCA8基因，命名為BnYUCCA8，CDS序列為1 281 bp，編碼426個(gè)氨基酸，是一個(gè)不穩(wěn)定的疏水性蛋白，不同物種間具有高度保守性。時(shí)空表達(dá)分析表明，其在根和葉中表達(dá)量最高，花和角果中相對(duì)較低。低溫脅迫下BnYUCCA8表達(dá)量整體呈降低趨勢(shì)，內(nèi)源IAA含量與其表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，且‘天油2288’(下胚軸伸長(zhǎng)較長(zhǎng)且抗寒性較弱)較‘16VHNTS158’(下胚軸伸長(zhǎng)較短且抗寒性較強(qiáng))的BnYUCCA8表達(dá)量低，內(nèi)源IAA含量也低。BnYUCCA8表達(dá)量與內(nèi)源IAA含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系，下胚軸長(zhǎng)度與BnYUCCA8表達(dá)量和內(nèi)源IAA含量呈正相關(guān)關(guān)系，表明甘藍(lán)型冬油菜BnYUCCA8基因可能在調(diào)控下胚軸長(zhǎng)度和內(nèi)源IAA含量中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。