劉 俊，李 龍，陳玉龍，吳耀松，劉 燕，任閃閃，董誠明

杜仲基因家族全基因組鑒定與進化表達分析

劉 俊1, 4, 5，李 龍3，陳玉龍1，吳耀松1，劉 燕1，任閃閃1，董誠明2

1.河南中醫(yī)藥大學(xué) 中醫(yī)藥科學(xué)院，河南省中醫(yī)方證信號傳導(dǎo)重點實驗室，河南 鄭州 450046 河南中醫(yī)藥大學(xué) 河南省道地藥材生態(tài)種植工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046 西北農(nóng)林科技大學(xué)林學(xué)院，陜西 楊凌 712100 國際竹藤中心 國家林業(yè)和草原局竹藤科學(xué)與技術(shù)重點開放實驗室，北京 100102 國際竹藤中心 安徽太平試驗中心，安徽 黃山 245716

通過對杜仲基因家族進行全面鑒定，以期為基因功能深入研究提供依據(jù)。以杜仲基因組數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)，利用生物信息學(xué)方法，對杜仲基因家族進行全面鑒定和表達模式分析。從杜仲基因組中共鑒定到19個，分為Class I與Class II 2大類，進一步劃分為6個亞家族（Ia、Ib、Ic、Id與IIa、IIb）。理化性質(zhì)分析顯示：EuLBDs編碼152～293個氨基酸，理論等電點分布于4.62～9.91，相對分子質(zhì)量區(qū)域為17 420～31 820，均為親水性蛋白，以α-螺旋和不規(guī)則卷曲為主，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。EuLBD基因家族含有類鋅指、亮氨酸拉鏈和甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸（GAS）保守結(jié)構(gòu)域。表達模式分析顯示，參與杜仲葉片發(fā)育，隨著葉片發(fā)育，水平逐漸降低，基因表達不受葉片膠含量的影響。從杜仲基因組水平對基因家族進行了全面鑒定和生物信息學(xué)分析，為進一步研究杜仲基因功能奠定基礎(chǔ)。

杜仲；LBD基因家族；系統(tǒng)進化；基因表達；

杜仲Oliver為杜仲科杜仲屬落葉喬木，是中國特有的單科、單屬、單種的名貴中藥材，集“經(jīng)濟、生態(tài)、社會效益于一體[1]，為我國二級保護植物。杜仲主要以樹皮入藥，具有抗疲勞、抗腫瘤、預(yù)防太空骨質(zhì)疏松，還具有利膽止血、抗菌、利尿、免疫鎮(zhèn)靜等作用[2]。LBD蛋白（lateral organ boundaries domain/ASYMMETRIC LEAVES2- Like）是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子[3-6]，-末端含有由100個氨基酸殘基3個基序（C-block、GAS-block和leu zipper coiled coil）組成的保守LOB結(jié)構(gòu)域。C-block由4個半胱氨酸殘基（CX2CX6CX3C）組成，主要參與DNA與順式作用元件結(jié)合，GAS-block由49個氨基酸殘基組成，以FX2VH序列開始，DP（V/I）序列結(jié)束[7]，Leu zipper coiled coil包含1個“LX6LX3LX6C”序列的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)，主要參與蛋白質(zhì)二聚化過程[8]?；蚣易宸譃镃lass I和Class II 2大類，研究報道顯示，Class I類基因主要在側(cè)生器官的原基邊緣表達，調(diào)控根、葉、花和胚胎生長發(fā)育[9]；Class II類基因主要參與植物花青素的合成以及氮代謝調(diào)控[10-17]。

自第一個基因從擬南芥中發(fā)現(xiàn)以后，其他物種LBD蛋白也相繼被報道。研究顯示，LBD轉(zhuǎn)錄因子參與植物側(cè)生器官發(fā)育、激素調(diào)節(jié)、氮素代謝等多種生物學(xué)過程[5,18]。在擬南芥中，1（36）、4（）和5（12）參與分生組織側(cè)枝器官發(fā)育[8,19-20]，29（16）、18（20）和16（18）主要在側(cè)根中表達[21-22]；18和33形成異源二聚體，激活下游基因轉(zhuǎn)錄[23]，促使根部側(cè)生分生組織細(xì)胞進入細(xì)胞周期，影響擬南芥?zhèn)雀l(fā)育[24-25]。41在擬南芥葉片發(fā)育中發(fā)揮重要作用[20]，2主要在幼嫩花器官近軸面特異表達[6,26]，調(diào)控花器官發(fā)育[27]。基因特異性調(diào)控小麥組織發(fā)育，Class Ib亞家族主要參與鹽脅迫響應(yīng)[28]。丹參23異源轉(zhuǎn)化擬南芥，導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株花青素和總酚酸含量降低，干擾植株葉中黃酮含量升高，根中黃酮含量降低；16導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因擬南芥花青素和總酚酸含量升高，由此說明，丹參基因參與花青素和總酚酸代謝調(diào)控[5,29]。

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因已在多個物種中進行了研究（表1），然而杜仲基因家族還未報道。本研究以杜仲基因組數(shù)據(jù)[30]為基礎(chǔ)，從基因組水平對基因家族進行全面鑒定、理化性質(zhì)分析、進化關(guān)系、保守基序以及表達模式分析，以期為進一步探索杜仲基因功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料

杜仲材料種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)苗圃（陜西楊凌），經(jīng)西北農(nóng)林科技大學(xué)李龍博士鑒定為杜仲Oliver。取生長正常，長勢一致的2年生“秦仲1號”“Qinzhong 1”杜仲幼苗的葉芽（莖尖）、生長葉（3 cm 長葉片）、幼葉（完全展開的新葉）、老葉（完全展開60 d葉片）；采集高產(chǎn)膠杜仲品種“秦仲2號”“Qinzhong 2”和低產(chǎn)膠杜仲品種“小葉”“Xiaoye”成熟葉片，設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，經(jīng)液氮處理后凍存于?80 ℃ 冰箱，用于RNA提取。無菌水、乙醇、TRIzol、液氮、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR SYBR試劑盒等。

表1 不同物種LBD基因家族分布

2 方法

2.1 杜仲LBD基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

從杜仲基因組數(shù)據(jù)庫Genome Warehouse（https://bigd.big.ac.cn/gwh/Assembly/13/show）中下載LBD蛋白候選序列，利用NCBI在線分析軟件[Conserved Domain Search Service（CD Search）]分析序列的結(jié)構(gòu)域，保留含有完整LOB結(jié)構(gòu)域的蛋白序列。通過在線軟件ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白的理化性質(zhì)，使用Plant-mPLoc（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/ plant-multi/）預(yù)測EuLBDs蛋白的亞細(xì)胞定位，利用在線工具ExPASY（https://www.expasy.org/tools）預(yù)測EuLBDs氨基酸數(shù)量、相對分子質(zhì)量、理論等電點[45]，通過Expasy（https://web.expasy.org/ protscale/）軟件分析蛋白的親疏水性，利用SOPMA（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.plpage= npsa_sopma.html）[46]和Phyre 2 （http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index）[47]軟件分別預(yù)測蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)。

2.2 杜仲LBDs蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

通過Clustal X1.83[48]軟件對杜仲、水稻、擬南芥和毛果楊LBDs氨基酸序列進行多序列比對，利用MEGA 6.0的鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)次數(shù)設(shè)置為1000次，其他參數(shù)為默認(rèn)值[49]。

2.3 保守基序及啟動子分析

為了分析EuLBDs蛋白的保守基序，通過MEME（http://meme-suite.org/）在線軟件對基因家族成員進行基序分析（參數(shù)為any number of Repetitions（anr），maximum number of Motifs＝10，minimum width≥6，and maximum width≤50）[50]。為了解析啟動子區(qū)域順式作用元件，對基因ATG上游2000 bp的序列進行查找分離，利用Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/htmL/）軟件進行啟動子分析[51]。

2.4 杜仲EuLBD基因家族表達模式分析

從NCBI的Short Read Arshive（SRA）數(shù)據(jù)庫中下載杜仲葉片不同發(fā)育時期（葉芽、初生葉、幼葉、老葉）[52]及不同膠含量（低含量、高含量）[53]轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，基因在不同組織中的相對表達豐度用FPKM值表示，對該數(shù)值取對數(shù)（Log2）進行統(tǒng)計分析，通過MeV4-9-0工具繪制基因表達圖譜，表達量最高的用紅色方框表示，表達量最低的用綠色方框表示。

2.5 杜仲LBDs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

利用STRING軟件（https://string-db.org/）上傳EuLBDs蛋白序列，選擇擬南芥數(shù)據(jù)庫進行序列比對，根據(jù)已知擬南芥蛋白互作關(guān)系，通過Blast比對杜仲同源蛋白，通過Cytoscape 3.7.0軟件進一步分析，對EuLBD基因家族蛋白互作信息進行評估和預(yù)測[54]。

3 結(jié)果與分析

3.1 杜仲LBD基因家族鑒定及理化性質(zhì)分析

利用Genome Warehouse數(shù)據(jù)庫，通過生物信息學(xué)方法，從杜仲基因組中鑒定到19個基因（表2），通過Pfam和NCBI的Conserved Domain Search在線分析軟件對EuLBDs蛋白結(jié)構(gòu)域進行檢測。結(jié)果顯示，19個EuLBDs蛋白均含有保守LOB特征結(jié)構(gòu)域，分別命名為EuLBD1～EuLBD19。通過ExPASy工具，對EuLBD家族成員進行蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析，最長蛋白EuLBD12編碼293個氨基酸，最短蛋白EuLBD3編碼152個氨基酸，相對分子質(zhì)量分布區(qū)域為17 420～31 820，等電點范圍是4.62（EuLBD8）～9.91（EuLBD9）。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，EuLBDs均定位在細(xì)胞核中（表2）。

3.2 杜仲LBD轉(zhuǎn)錄因子親疏水性分析

利用ProtScale在線軟件分析杜仲LBDs轉(zhuǎn)錄因子的親疏水性。結(jié)果如圖1所示，19條EuLBDs蛋白均存在明確的親疏水區(qū)域，親水區(qū)域多于疏水區(qū)域，表明EuLBDs多肽鏈均為親水性蛋白。EuLBD1的最低值為?2.133，在218位，最高值為2.011，位于第47氨基酸殘基處；EuLBD2在145位處于最低值為?3.489，于88位氨基酸殘基處達到最高值是1.922，其他蛋白的最低值、最高值及具體位置見圖1。

表2 杜仲LBD基因家族基本信息

圖1 杜仲LBDs轉(zhuǎn)錄因子親疏水性預(yù)測

3.3 杜仲LBDs蛋白結(jié)構(gòu)分析

EuLBDs蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示，α-螺旋、無規(guī)則卷曲、延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角在杜仲LBD蛋白家族中均有分布。α-螺旋在DNA結(jié)合基序中發(fā)揮重要作用，無規(guī)則卷曲易受側(cè)鏈相互作用，構(gòu)成活性部位和功能部位。杜仲LBDs蛋白二級結(jié)構(gòu)有2種類型，其中α螺旋＞無規(guī)則卷曲＞延伸鏈＞β轉(zhuǎn)角的數(shù)量最多，有11個基因，所占比例為57.89%；8個基因二級結(jié)構(gòu)順序為無規(guī)則卷曲＞α螺旋＞延伸鏈＞β轉(zhuǎn)角，比例是42.11%，具體情況見表3。

采用Phyre2在線軟件進行杜仲LBDs蛋白高級結(jié)構(gòu)同源建模預(yù)測，結(jié)果如圖2所示，除EuLBD17三級結(jié)構(gòu)出現(xiàn)特異性外，其余蛋白三級結(jié)構(gòu)非常相似，均由α-螺旋、β-折疊和隨機卷曲等組成，19個EuLBDs中隨機卷曲所占比例最大，空間結(jié)構(gòu)不同，決定EuLBDs蛋白功能的差異。

表3 杜仲LBD基因家族二級結(jié)構(gòu)分析

圖2 杜仲LBDs蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

3.4 杜仲LBDs蛋白系統(tǒng)進化分析

利用MEGA 6.0分析軟件，對19個杜仲EuLBDs，35個水稻OsLBDs[31]，43個擬南芥AtLBDs[8]和57個毛果楊PtLBDs[55]蛋白進行1000次重復(fù)搜索，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果如圖3所示，154個LBDs蛋白分為Class I和Class II 2個大亞家族，其中Class I亞家族進一步劃分為：Ia、Ib、Ic、Id和Ie小亞家族；Class II亞家族劃分為：IIa和IIb。154個LBDs蛋白共分為7個小亞家族（如圖3所示），Class Ia亞家族所含LBDs成員數(shù)量最多，共有37個LBDs蛋白，分別包含3個EuLBDs，13個AtLBDs，8個OsLBDs和13個PtLBDs蛋白；其次是Class Id亞家族，由31個LBDs蛋白組成，Class Ib亞家族含有28個LBDs蛋白；29個LBDs蛋白屬于Class Ic亞家族，Class Ie亞家族所含蛋白數(shù)量最少，僅有3個AtLBDs；Class IIa和Class IIb亞家族分別含有14、13個LBDs。EuLBDs在Class Ic亞家族中的分布最多，有7個蛋白，所占比例為36.8%，除Class Ic亞家族外，EuLBDs在7個亞家族中的蛋白數(shù)量最少，這可能與EuLBDs在4個物種中數(shù)量最少有關(guān)。

利用MEGA 6.0的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，不同物種的LBDs蛋白用不同顏色點標(biāo)記，紅色方形代表擬南芥，綠色三角形代表水稻，紫色圓形代表毛果楊，杜仲LBDs蛋白由黑色菱形標(biāo)記

3.5 杜仲LBD轉(zhuǎn)錄因子基序分析

為了解析基因結(jié)構(gòu)多樣性和進化關(guān)系，利用MEME在線分析軟件，對19條EuLBDs蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行分析。結(jié)果如圖4所示，EuLBDs蛋白由1～10個Motifs組成（表4），均含有保守LOB結(jié)構(gòu)域（Motif 1和Motif 2），表明19個EuLBDs均屬于LBD家族成員。EuLBDs蛋白（除EuLBD5外）均含有Motif 3，有些Motifs只存在于特定亞家族，Motif 5僅在Class Ib亞家族中存在，Motif 4、Motif 7和Motif 10只存在于Class Ic亞家族，只有Class IIa亞家族含有Motif 9，這可能與不同亞家族功能不同相關(guān)。

A-利用MEGA 6.0的鄰接法構(gòu)建EuLBD基因家族系統(tǒng)進化樹B-EuLBDs基因結(jié)構(gòu)分析 C-保守基序氨基酸分布

表4 杜仲LBDs蛋白保守基序分布

3.6 杜仲LBDs蛋白序列保守性分析

利用DNAMAN7.0工具對19個EuLBDs蛋白保守結(jié)構(gòu)域進行比對，結(jié)果如圖5所示，EuLBDs蛋白N端均含有1個由15個氨基酸殘基組成的CX2CX6CX3C保守基序，暗示其可能與下游基因順式元件的結(jié)合有關(guān)，Class II類蛋白C端含有賴氨酸組成的類似亮氨酸拉鏈（LX6LX3LX6L）二級結(jié)構(gòu)（圖5），參與轉(zhuǎn)錄因子二聚化。Class Ia、Ib和Ic亞家族含有1個GAS模塊（GAS-block），該模塊C端含有保守的脯氨酸（P）和甘氨酸（G），脯氨酸在LBD基因家族生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用[56]。

圖5 杜仲LBDs蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列比對

3.7 杜仲LBDs啟動子順式作用元件分析

為了探索基因的功能和表達調(diào)控模式，利用PlantCARE在線軟件對起始密碼子（ATG）上游2000 bp進行順式作用元件分析，結(jié)果如圖6所示，啟動子不僅含有基本順式作用元件，還存在3種類型元件：（1）生長發(fā)育調(diào)控元件，如赤霉素響應(yīng)元件ABRE；生長素響應(yīng)元件AuxRR-core；水楊酸響應(yīng)元件CGTCA-motif；（2）脅迫響應(yīng)調(diào)控元件，如干旱脅迫響應(yīng)元件MBS、低溫響應(yīng)元件LTR和厭氧脅迫相關(guān)元件ARE；（3）光響應(yīng)元件，如GT1-motif、GATA-motif、Sp1、G-Box和ACE等，推測可能在杜仲生長發(fā)育、逆境脅迫以及光周期調(diào)控中發(fā)揮重要作用?；蛑泄忭憫?yīng)元件數(shù)量最多，共有232個，包含55個Box 4，34個G-box元件，暗示s基因的轉(zhuǎn)錄可能受光周期調(diào)控。基因啟動子區(qū)域含有48個ABRE元件，表明可能參與ABA調(diào)控。

圖6 杜仲LBDs啟動子順式作用元件分析

3.8 杜仲LBD基因家族表達模式分析

為了探索基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期及杜仲膠形成中的功能，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，檢測基因表達模式（圖中顯示基因編號與文中基因命名一致）。結(jié)果如圖7和8所示，不同基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期及杜仲膠含量中表達豐度存在顯著差異，大部分基因在杜仲葉片發(fā)育中表達豐度較低，其中有4個基因（3、9、13和15）在杜仲葉片中不表達，表明3、9、13和15在杜仲葉片發(fā)育中不發(fā)揮作用。基因隨著杜仲葉片發(fā)育，表達水平逐漸降低，12FPKM值在葉芽中是357.0，幼葉中為62.0，成熟葉中是2.2，老葉中僅為0.2，表明大部分基因參與杜仲葉片發(fā)育，特別在葉片發(fā)育的早期階段。

T1-1～T1-3-葉芽 T2-1～T2-3-初生葉 T3-1～T3-3-幼葉 T4-1～T4-3-老葉，熱圖右側(cè)為色標(biāo)，綠色表示低表達豐度，紅色表示高轉(zhuǎn)錄水平

L-1～L-3：低膠含量葉片；H-1～H-3：高膠含量葉片。熱圖右側(cè)為色標(biāo)，綠色表示低表達豐度，紅色表示高轉(zhuǎn)錄水平

為了檢測在杜仲膠形成中發(fā)揮的作用，利用不同膠含量的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，檢測的表達水平。結(jié)果如圖8所示，基因在杜仲不同膠含量中的表達水平均較低，幾乎檢測不到，轉(zhuǎn)錄水平不隨膠含量的高低而改變，由此說明在杜仲膠形成過程中發(fā)揮的作用較小，這可能與在杜仲成熟葉中表達量較低有關(guān)。

3.9 杜仲LBDs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

表達模式分析顯示，6和19在杜仲葉片不同發(fā)育階段和杜仲膠形成中表達量較高，表明6和19在杜仲葉片發(fā)育和膠形成過程中發(fā)揮重要作用。為了檢測EuLBD6和EuLBD19與其他蛋白的互作關(guān)系，利用STRING數(shù)據(jù)庫，預(yù)測EuLBD6和EuLBD19互作蛋白。結(jié)果如圖9-A所示，EuLBD6可以與10個蛋白發(fā)生相互作用，其中8個屬于EuLBD家族，一個是MYB-like轉(zhuǎn)錄因子，另一個為NLP7蛋白；EuLBD19可與5個蛋白產(chǎn)生互作關(guān)系（圖9-B），其中3個為EuLBD蛋白，一個Auxin-like轉(zhuǎn)錄因子，一個MYB-like蛋白，暗示EuLBD6和EuLBD19可能參與杜仲生長素信號調(diào)控。

為了探索基因家族潛在調(diào)控關(guān)系，構(gòu)建了EuLBD家族共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。結(jié)果如圖10所示，調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中共有14個節(jié)點（代表EuLBDs蛋白）和19條邊（代表蛋白質(zhì)之間的相互作用），表明19個EuLBDs中有14個蛋白表現(xiàn)出共表達相關(guān)性，其中EuLBD12互作蛋白數(shù)量最多，可與8個EuLBDs蛋白發(fā)生互作關(guān)系，暗示EuLBD12可能是EuLBD基因家族的核心蛋白，EuLBD6、EuLBD4和EuLBD1，分別可以與4個EuLBDs蛋白互作，其余EuLBDs蛋白互作關(guān)系較少。

4 討論

杜仲全基因組測序完成以后，已有多個基因家族進行了分析報道，例如[57]、[58]、[59]、[60]、[61]、[62]基因家族等。LBD轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，在植物側(cè)生器官發(fā)育、激素響應(yīng)、逆境脅迫、花青素和氮素代謝等途徑中發(fā)揮了重要作用[63]。本研究以杜仲基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過全基因組查找和生物信息學(xué)分析，鑒定出19個含有完整LOB結(jié)構(gòu)域的LBD轉(zhuǎn)錄因子，基因數(shù)量均少于二穗短柄草（28個）[34]、擬南芥（43個）[8]、水稻（35個）[31]、玉米（44個）[32]、楊樹（57個）[6]、番茄（46個）[4]、辣椒（56個）[37]、煙草（45個）[40]、葡萄（98個）[42]，杜仲基因組大小是1.18 Gb[64]，是水稻（441 Mb）[65]的2倍多，為二穗短柄草（300 Mb）[66]的3倍多，是擬南芥（164 Mb）的7倍，為番茄（850 Mb）的1倍多，然而基因數(shù)量與基因組大小不成正比，這可能與杜仲和雙子葉共同祖先發(fā)生分化后，進行全基因組復(fù)制（WGD）及基因丟失事件有關(guān)。

圖9 EuLBD6 (A) 和EuLBD19 (B) 蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)

圖10 EuLBD基因家族蛋白互作網(wǎng)絡(luò)

擬南芥、水稻、杜仲和毛果楊LBD蛋白聚類分析結(jié)果顯示，19個EuLBDs分為2個大亞家族，分別是Class I和Class II，進一步劃分為7個小亞家族（Ia、Ib、Ic、Id、Ie、IIa和IIb）（圖3）。Class I大亞家族含有16個EuLBDs蛋白，Ia亞家族中所含EuLBDs蛋白數(shù)量最多，有7個EuLBDs，Ie亞家族不含EuLBDs。Class II大亞家族含有3個EuLBDs（分別是EuLBD6、EuLBD9、EuLBD12）。系統(tǒng)進化結(jié)果顯示，杜仲EuLBD5、EuLBD6、EuLBD11和EuLBD15與擬南芥AtLBD37（AtASL39）、AtLBD38（AtASL40）和AtLBD39（AtASL41）聚為一支，屬于Class II大亞家族。37、38和39參與擬南芥花青素合成和氮代謝[5,13,23]，推測5、6、11和15可能具有功能相似性。14是6的同源基因，6（2）參與擬南芥花序發(fā)育調(diào)控[67]，暗示14在杜仲花序發(fā)育中可能發(fā)揮重要作用。16（18）、17（15）和9（16）與杜仲1和13互為同源基因，16（18）、17（15）和9（16）誘導(dǎo)愈傷組織形成，參與植物的再生過程[68-69]，表明1和13在杜仲愈傷組織形成中可能具有相似的功能。

基因結(jié)構(gòu)決定基因功能，EuLBDs蛋白結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，同一亞家族含有相似的結(jié)構(gòu)域，LX6LX3LX6L結(jié)構(gòu)域（Motif 1）存在于所有EuLBDs轉(zhuǎn)錄因子中，表明EuLBDs轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)具有保守性。不同EuLBDs轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)存在差異，除EuLBD4和EuLBD11不含CX2CX6CX3C結(jié)構(gòu)域（Motif 2）外，其他EuLBDs蛋白均含有Motif 2，Class I大亞家族基因結(jié)構(gòu)較為復(fù)雜，不僅含有保守的LOB結(jié)構(gòu)域，還含有特異結(jié)構(gòu)域，這可能與基因功能的多樣性有關(guān)。

研究報道，水稻、小麥、擬南芥、毛果楊、番茄、辣椒、巨桉等物種LBD蛋白參與植物葉片發(fā)育、側(cè)生根形成、次生木質(zhì)部和韌皮部發(fā)育、細(xì)胞分裂素、生長素以及非生物脅迫等生物學(xué)過程[15, 24, 43, 70-71]?；虮磉_與其功能特征密切相關(guān)，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析基因在杜仲葉片不同發(fā)育時期（圖7）以及杜仲膠含量中的表達模式（圖8）。結(jié)果顯示，基因在杜仲葉芽中轉(zhuǎn)錄水平最高，隨著葉片發(fā)育，表達水平逐漸減低，推測參與杜仲葉片發(fā)育，特別是葉芽形成期。6、12和16在葉片4個發(fā)育階段表達量均較高，表明6、12和16在杜仲葉片生長發(fā)育中發(fā)揮重要作用，這為進一步探索基因在杜仲葉片發(fā)育中的功能提供了重要的候選基因。4、9、13、15和18轉(zhuǎn)錄水平較低，在各發(fā)育階段表達豐度幾乎為0，暗示4、9、13、15和18在杜仲葉片中發(fā)揮的作用較小。6參與擬南芥旗葉形成，超表達6導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株葉片細(xì)小、卷曲[12]。在水稻中，降低37和38表達水平，影響水稻抽穗時間關(guān)鍵基因1的表達，導(dǎo)致水稻延遲抽穗[72]。在巨桉中，37在韌皮部高量表達[6]，超表達37導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因植株次生木質(zhì)部增厚，韌皮纖維增多[73]，表明LBD基因家族在植物葉片發(fā)育、花序形成、次生發(fā)育等過程發(fā)揮重要作用。

進化分析顯示，6是擬南芥38的同源基因，在N/NO3缺失條件下，超表達38強烈抑制花青素合成關(guān)鍵調(diào)控因子PAP1和PAP2，以及類黃酮合成過程中花青素特異基因的表達；相反，38突變體在N/NO3充足條件下積累花青素，組成性表達花青素生物合成基因，38抑制多種氮應(yīng)答基因表達，表明38是花青素生物合成和氮有效性利用的新抑制因子[74]。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，EuLBD6不僅可以與LBD蛋白發(fā)生相互作用，還可與MYBL2蛋白互作，在擬南芥中mir858a通過翻譯抑制花青素生物合成關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子MYBL2的表達，是擬南芥幼苗花青素生物合成的正調(diào)控因子[75]，推測6在杜仲花青素合成中可能也發(fā)揮重要作用。19與1互為同源基因，1在韌皮部和形成層中表達量最高，顯性抑制因子PtaLBD1通過與抑制因子SRDX區(qū)域融合，減少楊樹直徑增長，抑制韌皮部發(fā)育，并且高度不規(guī)則，表明1在楊樹次生木質(zhì)部生長過程中具有廣泛的調(diào)控作用[76]，暗示19在杜仲次生生長過程中可能也發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究以杜仲全基因組數(shù)據(jù)為背景，對杜仲LBD轉(zhuǎn)錄因子家族進行了全面的生物信息學(xué)分析，共鑒定出19個基因，分為Class I與Class II 2大類，劃分為6個亞家族（Ia、Ib、Ic、Id與IIa、IIb）。理化性質(zhì)分析顯示：EuLBDs編碼152～293個氨基酸，理論等電點分布于4.62～9.91，相對分子質(zhì)量區(qū)域為17 420～31 820，均為親水性蛋白，以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，亞細(xì)胞定位于細(xì)胞核中。EuLBDs蛋白含有類鋅指、亮氨酸拉鏈和甘氨酸-丙氨酸-絲氨酸（GAS）保守結(jié)構(gòu)域。表達模式分析顯示，參與杜仲葉片發(fā)育，隨著葉片發(fā)育，轉(zhuǎn)錄水平逐漸降低，基因表達不受葉片膠含量的影響，本研究為深入研究杜仲基因功能奠定了理論基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Identification, evolution and expression analysis ofgene family in

LIU Jun1, 4, 5, LI Long3, CHEN Yu-long1, WU Yao-song1, LIU Yan1, REN Shan-shan1, DONG Cheng-ming2

1.Henan Key Laboratory of TCM Prescription and Syndrome Signaling, Academy of Chinese Medicine, Henan University of Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China Henan Province Genuine Medicinal Materials Ecological Planting Engineering Technology Research Center, Henan Universityof Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China College of Forestry, Northwest Agriculture and Forestry University, Yangling 712100, China Key Open Laboratory of Bamboo and Rattan Science and Technology, International Center for Bamboo and Rattan, China National Forestry and Grassland Administration, Beijing 100102, China Anhui Taiping ExperimentalStation of International Center for Bamboo and Rattan, Huangshan 245716, China

In order to provide a basis for further research on the function ofgene, thegene family ofwas comprehensively identified in this study.Based ongenome database, this study used bioinformatics methods to identify and analyzegene family.A total of 19were identified fromgenome, which were divided into Class I and Class II groups and further divided into six subfamilies (Ia, Ib, Ic, Id and IIa, IIb).EuLBDs encodes 152—293 amino acids, and the theoretical isoelectric points distribution were 4.62—9.91, molecular weight between 17 420—31 820 by physicochemical analysis, all of EuLBD proteins were hydrophilic proteins.α-Helix and irregular curl were the main structure of the secondary structure in thegene family which was mainly expressed in nucleus.gene family had sinusoidal structure, the leucine zipper and the glycine-alanine-serine (GAS) structure domain.Expression pattern analysis showed thatinvolved inleaves development, and the transcription level ofgradually decreased with leaf development, which were not affected by the leaf gum content.In this study, the members of the LBD family were comprehensively identified and bioinformatics analysis from the genomic level of,which laid a foundation for further functional research ofgenes.

Oliver; LBD gene family; phylogeny analysis; gene expression;

R286.12

A

0253 - 2670(2022)10 - 3142 - 14

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.025

2021-10-03

河南省高等學(xué)校重點科研項目（22A360005）；國家林業(yè)和草原局/北京市共建竹藤科學(xué)與技術(shù)重點實驗室開放基金(ICBR-2020-05)；國際竹藤中心安徽太平試驗中心開放課題基金(1632021006-4)；河南中醫(yī)藥大學(xué)博士科研基金資助項目（RSBSJJ2019-04）

劉 ?。?990—），女，助理研究員，博士，主要從事藥用植物分子生物學(xué)研究。E-mail: liujun_0325@163.com

[責(zé)任編輯 時圣明]