鐘彥亨，姚景春，孫成宏，張貴民，李法升, 2*

人參固本口服液對(duì)小鼠股骨骨折術(shù)后認(rèn)知功能的影響及機(jī)制探討

鐘彥亨1，姚景春4，孫成宏4，張貴民3*，李法升1, 2*

1.暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院，廣東 廣州 510630 2.河源市深河人民醫(yī)院（暨南大學(xué)附屬第五醫(yī)院），廣東 河源 517475 3.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司，中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 臨沂 276006 4.魯南制藥集團(tuán)股份有限公司新藥藥理中心，山東 臨沂 276006

探討人參固本口服液對(duì)小鼠股骨骨折術(shù)后認(rèn)知功能的影響及作用機(jī)制。60只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、人參固本口服液（0.50 mL/只）組、手術(shù)組和手術(shù)＋人參固本口服液低、中、高劑量（0.05、0.10、0.50 mL/只）組。小鼠麻醉后制備骨折模型，各給藥組ig相應(yīng)藥物；術(shù)后第3天，采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄小鼠逃避潛伏期，Y迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶次數(shù)，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其情緒行為；行為學(xué)完成后，小鼠處死取海馬組織，采用ELISA法檢測(cè)小鼠海馬區(qū)腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）水平；采用qRT-PCR法測(cè)定海馬區(qū)B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，）mRNA表達(dá)；采用TUNEL法檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況。與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組小鼠術(shù)后第3天的平均逃避潛伏期顯著縮短（＜0.05），學(xué)習(xí)記憶次數(shù)顯著減少（＜0.05），穿越次數(shù)顯著增加（＜0.05）；血清中TNF-α和IL-6水平明顯降低（＜0.05）；海馬區(qū)mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）；海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)顯著減少（＜0.05）。人參固本口服液能夠通過抑制炎癥反應(yīng)，降低海馬神經(jīng)元凋亡，從而改善小鼠股骨骨折術(shù)后認(rèn)知功能障礙。

人參固本口服液；骨折；認(rèn)知功能；炎癥反應(yīng)；凋亡

術(shù)后認(rèn)知功能障礙（postoperative cognitive dysfunction，POCD）是發(fā)生在高齡患者術(shù)后的重要并發(fā)癥，可發(fā)生在不同類型的手術(shù)，常表現(xiàn)為意識(shí)、認(rèn)知、記憶、定向、感知、運(yùn)動(dòng)行為等方面的功能障礙，往往預(yù)后不良，影響療效與遠(yuǎn)期生存[1-3]。隨著社會(huì)老齡化，老年人髖部骨折的發(fā)生率呈上升趨勢(shì)，其中以股骨頸骨折和股骨轉(zhuǎn)子間骨折發(fā)病率最高，且具有極高的致殘率及死亡率[4]。目前，手術(shù)治療能夠有效降低病死率，促使患者早日恢復(fù)并減少并發(fā)癥發(fā)生，因此老年髖部骨折現(xiàn)多采取手術(shù)治療。但臨床觀察發(fā)現(xiàn)，老年患者髖部骨折術(shù)后常并發(fā)POCD，其發(fā)生率高達(dá)35%～65%[5]。對(duì)POCD相關(guān)因素的研究是對(duì)其病因和發(fā)病機(jī)制的一種探索，掌握危險(xiǎn)因素可以對(duì)患者發(fā)生POCD的可能性進(jìn)行預(yù)測(cè)，并提出有效的防治措施，有利于患者術(shù)后的早期功能鍛煉和康復(fù)。

人參固本口服液具有滋陰益氣、固本培元的功效。研究表明，人參固本口服液對(duì)小鼠有明顯的抗疲勞、耐缺氧作用，能夠提高小鼠腹腔內(nèi)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，同時(shí)提高機(jī)體免疫功能[6]。然而其在POCD中的作用尚未見報(bào)道。為明確人參固本口服液在POCD中的治療作用，本研究旨在考察人參固本口服液治療POCD的機(jī)制，為臨床治療POCD提供科學(xué)理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性C57BL/6J小鼠60只，18月齡，體質(zhì)量20 g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)210726211101477878，動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（粵）2017-0174。動(dòng)物在暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，飼養(yǎng)于無特定病原體環(huán)境，室溫保持在22～25 ℃，室內(nèi)相對(duì)濕度為（55±5）%，遵循12 h/d光照、12 h/d黑暗周期，并保持給予充足的飼料和滅菌飲用水，手術(shù)前后6 h禁食禁水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)暨南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)20200902-09）。

1.2 藥品與試劑

人參固本口服液（10 mL/支，批號(hào)29190332）購自魯南厚普制藥有限公司；三溴乙醇（批號(hào)T48402）購自美國Sigma公司；凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C10617）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA試劑盒（批號(hào)BMS607-3）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA試劑盒（批號(hào)BMS603-2）、動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒（批號(hào)K157002）購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)K1691）、qRT-PCR試劑盒（批號(hào)46610）購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器

骨折模型架（美國NYU Impactor ModelⅡ）；Morris水迷宮、Y迷宮（上海吉量軟件科技有限公司分析系統(tǒng)）；曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)視頻分析系統(tǒng)（上海軟隆科技發(fā)展有限公司）；KDC-40型低速離心機(jī)（科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司）；5810R型冷凍超速離心機(jī)（德國Eppendorf公司）；Varioskan LUX多功能酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；PCR擴(kuò)增儀（美國Bio-Rad公司）；倒置白光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 分組與給藥

用隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、人參固本口服液（0.50 mL/只）組、手術(shù)組和手術(shù)＋人參固本口服液低、中、高劑量（0.05、0.10、0.50 mL/只）組，每組10只。手術(shù)組和手術(shù)＋人參固本口服液低、中、高劑量組大鼠麻醉后制備骨折模型；各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和手術(shù)組ig等體積生理鹽水，1次/d。

2.2 小鼠股骨骨折髓內(nèi)固定模型的制備

小鼠ip三溴乙醇（13 μL/g）麻醉，仰臥位固定，右下肢以10%安爾碘消毒準(zhǔn)備手術(shù)。取髕旁內(nèi)側(cè)切口約3 mm，使髕骨脫位以暴露股骨髁間。以帶不銹鋼導(dǎo)針的26 G不銹鋼針，于股骨髁間開口并鉆入股骨髓腔，擴(kuò)髓至股骨粗隆部，并將導(dǎo)針留于髓腔內(nèi)。將帶導(dǎo)針的小鼠大腿置于骨折模型架的沖撞臺(tái)上，肢體平貼于臺(tái)兩側(cè)，根據(jù)3點(diǎn)折彎作用，打擊質(zhì)量350 g，打擊高度6 cm，打擊深度為沖撞臺(tái)上1.5 mm，制造閉合性股骨骨折。經(jīng)導(dǎo)針將26 G不銹鋼針插入骨折的股骨髓腔，行骨折髓內(nèi)固定，剪斷鋼針柄，推進(jìn)使尾部平齊股骨髁關(guān)節(jié)面。立即在X線下觀察，確定骨折類型。小鼠蘇醒后置于籠中飼養(yǎng)，并進(jìn)行1周的抗生素喂養(yǎng)。

2.3 行為學(xué)分析

2.3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)記錄小鼠逃避潛伏期 骨折模型建立后第3天進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試，觀察受試小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力，記錄小鼠逃避潛伏期，確定小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的變化。具體操作如下：水迷宮為直徑100 cm、高30 cm的圓形水池，水深25 cm，水溫保持在（24±1）℃，水中加適量二氧化鈦粉末，使水渾濁。池壁上標(biāo)有東南西北4個(gè)入水點(diǎn)，將水池等分為4個(gè)象限，水池第一象限正中處放1個(gè)直徑為10 cm、低于水平面0.5 cm的透明圓形平臺(tái)。迷宮上方安置帶有顯示系統(tǒng)的攝像機(jī)，用以同步記錄小鼠運(yùn)動(dòng)軌跡。迷宮外參照物保持不變，以供小鼠定位平臺(tái)。將小鼠面朝池壁輕輕放入水中，記錄小鼠從入水至找到平臺(tái)的時(shí)間（逃避潛伏期）。如果90 s內(nèi)找不到平臺(tái)，潛伏期記為90 s，并將小鼠置于平臺(tái)上休息30 s。訓(xùn)練結(jié)束后，將小鼠置于籠中，并注意保暖，用電取暖器烘干鼠毛。

2.3.2 采用Y迷宮檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)記憶次數(shù) Morris水迷宮測(cè)試完成后進(jìn)行Y迷宮檢測(cè)。Y迷宮采用燈光和電刺激，使小鼠形成回避條件反射，通過觀察和記錄回避條件反射和空間辨別能力，來判斷小鼠的學(xué)習(xí)記憶和空間認(rèn)知等方面的能力。Y迷宮由3個(gè)輻射式迷路箱（等長I、II、III臂，及3者交界區(qū)）和1個(gè)控制儀組成。學(xué)習(xí)訓(xùn)練：設(shè)置電刺激參數(shù)，采取隨機(jī)休息模式，記錄其正確反應(yīng)次數(shù)。觀察指標(biāo)：所需訓(xùn)練次數(shù)。所需訓(xùn)練次數(shù)反映其回避條件反射盒空間分辨反應(yīng)的學(xué)習(xí)成績，所需次數(shù)越少證明小鼠學(xué)習(xí)速度越快或?qū)W習(xí)能力越強(qiáng)。正確反映率反映記憶的保存能力，正確率高說明小鼠對(duì)信息的保持和提取能力較強(qiáng)。

2.3.3 采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其情緒行為 開場(chǎng)裝置包括1個(gè)60 cm×60 cm的正方形地面以及四面的40 cm高的壁構(gòu)成，中心區(qū)域定義為距離周壁大于15 cm的正方形區(qū)域。裝置的正上方有白色冷光源（4 W，距地面80 cm）。測(cè)試開始時(shí)，只打開此光源，將小鼠面向周壁放置到同一個(gè)角落，通過視頻追蹤系統(tǒng)記錄5 min內(nèi)小鼠的活動(dòng)情況。每只小鼠試驗(yàn)結(jié)束后，用酒精擦洗清理裝置周壁和底面，清理干凈后進(jìn)行下一只小鼠實(shí)驗(yàn)，排除上一只小鼠殘留信息對(duì)本次測(cè)試結(jié)果的影響。開場(chǎng)實(shí)驗(yàn)廣泛應(yīng)用于評(píng)估動(dòng)物焦慮以及探究行為，主要分別記錄5 min內(nèi)小鼠在裝置中的水平、垂直方向的運(yùn)動(dòng)（包括在總區(qū)域，外周區(qū)和中間區(qū)的運(yùn)動(dòng)距離），評(píng)估小鼠于中心區(qū)域活動(dòng)占總活動(dòng)的百分比。

2.4 ELISA檢測(cè)小鼠海馬區(qū)的炎癥因子TNF-α和IL-6水平

行為學(xué)測(cè)試完成后，小鼠ip三溴乙醇（13 μL/g）麻醉，去除小鼠顱骨后分離其腦部組織，用冰凍生理鹽水灌洗腦部組織，迅速剝離覆蓋在海馬組織上的大腦皮層，暴露并取出小鼠海馬組織。海馬勻漿，于2～8 ℃、5000 r/min離心5 min，取上清液，采用ELISA試劑盒說明書測(cè)定TNF-α及IL-6水平。

2.5 qRT-PCR測(cè)定海馬神經(jīng)元B淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2）和Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）mRNA表達(dá)

通過動(dòng)物總RNA快速提取試劑盒從海馬組織提取總RNA。然后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA合成。以18S rRNA作為內(nèi)參，引物序列：上游引物5’-GCCGAAATGTTTGCTGACG-3’，下游引物5’-CCGATCTCGAAGGAAGTCCA-3’；上游引物5’-ACTTTGCCGAGATGTCCAGC-3’，下游引物5’-ATCCCAGCCTCCGTTATCCT-3’；18S rRNA上游引物5’-GAAGGGCACCACCAGGAGT-3’，下游引物5’-CAGACAAATCACTCCACCAA-3’。最后，使用qRT-PCR試劑盒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，應(yīng)用2???Ct法分析數(shù)據(jù)。

2.6 Tunnel法檢測(cè)海馬神經(jīng)元凋亡情況

取小鼠海馬組織，于4%多聚甲醛中固定后進(jìn)行石蠟包埋，將包埋后的海馬組織進(jìn)行切片，厚度為5 mm。然后，將切片按照TUNEL凋亡檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行染色，DAB進(jìn)行顯色。將染色好的標(biāo)本置于顯微鏡下進(jìn)行觀察，細(xì)胞核為棕黃色或棕褐色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，每個(gè)標(biāo)本取10個(gè)高倍視野（×400）記錄陽性細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算平均值。

2.7 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮、Y迷宮和曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表1所示，人參固本口服液組與對(duì)照組小鼠術(shù)后第3天平均逃避潛伏期、平均學(xué)習(xí)記憶次數(shù)和中心區(qū)域活動(dòng)占比比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，手術(shù)組小鼠術(shù)后第3天平均逃避潛伏期顯著延長（＜0.05），平均學(xué)習(xí)記憶次數(shù)顯著增加（＜0.05），中心區(qū)域活動(dòng)顯著減少（＜0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組術(shù)后第3天平均逃避潛伏期顯著縮短（＜0.05），平均學(xué)習(xí)記憶次數(shù)顯著減少（＜0.05），中心區(qū)域活動(dòng)顯著增加（＜0.05）。

3.2 各組小鼠海馬區(qū)TNF-α和IL-6水平

如表2所示，對(duì)照組與人參固本口服液組小鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF-α與IL-6水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，其余各組TNF-α與IL-6水平明顯升高（＜0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF-α與IL-6水平顯著降低（＜0.05）。

3.3 各組小鼠海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)

如表3所示，對(duì)照組與人參固本口服液組小鼠海馬區(qū)和mRNA表達(dá)水平相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，手術(shù)組小鼠海馬區(qū)mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區(qū)mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.05），mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.05）。

表1 各組小鼠術(shù)后第3天的平均逃避潛伏期、學(xué)習(xí)記憶次數(shù)和中心區(qū)域活動(dòng)占比(, n = 10)

Table 1 Average escape latency, number of learning and memory and percentage of activities in central area of mice in each group on 3rd day after surgery (, n = 10)

表1 各組小鼠術(shù)后第3天的平均逃避潛伏期、學(xué)習(xí)記憶次數(shù)和中心區(qū)域活動(dòng)占比(, n = 10)

組別劑量/(mL·只?1)逃避潛伏期/s學(xué)習(xí)記憶次數(shù)/次中心區(qū)域活動(dòng)占比/% 對(duì)照—21.97±3.2629.70±4.7810.60±2.19 人參固本口服液0.5020.75±3.6129.20±4.2810.82±2.23 手術(shù)—31.60±4.58#56.74±4.35#3.83±1.17# 手術(shù)＋人參固本口服液0.0532.78±10.8353.43±3.413.52±0.79 0.1031.07±4.1953.37±4.903.58±0.91 0.5024.67±2.96*41.73±3.36*7.65±0.88*

與對(duì)照組比較：#＜0.05；與手術(shù)組比較：*＜0.05，下表同

#< 0.05control group;*< 0.05surgery group, same as below tables

表2 各組小鼠海馬區(qū)TNF-α和IL-6水平(, n = 10)

Table 2 TNF-α and IL-6 levels in hippocampus of mice in each group (, n = 10)

表2 各組小鼠海馬區(qū)TNF-α和IL-6水平(, n = 10)

組別劑量/(mL·只?1)TNF-α/(pg·mL?1)IL-6/(pg·mL?1) 對(duì)照—253.04±13.611 689.52±129.67 人參固本口服液0.50251.42±15.211 833.47±132.81 手術(shù)—360.89±18.54#3 048.50±276.14# 手術(shù)＋人參固本口服液0.05338.73±18.153 013.45±238.26 0.10335.42±27.322 966.17±221.13 0.50316.81±21.12*2 730.03±256.74*

表3 各組小鼠海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)(, n = 10)

Table 3 Bax and Bcl-2 mRNA expressions in hippocampal neurons of mice in each group (, n = 10)

表3 各組小鼠海馬神經(jīng)元Bax和Bcl-2 mRNA表達(dá)(, n = 10)

組別劑量/(mL·只?1)mRNA相對(duì)表達(dá)量 BaxBcl-2 對(duì)照—1.000±0.0201.000±0.015 人參固本口服液0.501.009±0.0111.012±0.019 手術(shù)—3.241±0.017#0.736±0.014# 手術(shù)＋人參固本口服液0.053.236±0.0150.732±0.012 0.103.001±0.0160.785±0.014 0.501.914±0.018*0.907±0.012*

3.4 各組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

如圖1和表4所示，對(duì)照組與人參固本口服液組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡細(xì)胞數(shù)相近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與對(duì)照組比較，手術(shù)組小鼠術(shù)后海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)顯著增多（＜0.05）；與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組小鼠術(shù)后海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡個(gè)數(shù)顯著減少（＜0.05），手術(shù)＋人參固本口服液低、中劑量組呈降低趨勢(shì)。

圖1 各組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

表4 各組小鼠海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況

4 討論

老年髖部骨折分為老年股骨頸骨折和老年股骨轉(zhuǎn)子骨折，以關(guān)節(jié)置換和髓內(nèi)釘內(nèi)固定為主要手術(shù)治療方式。臨床觀察發(fā)現(xiàn)，老年患者髖部骨折術(shù)后常并發(fā)POCD，其發(fā)生率高達(dá)35%～65%[5]。老年髖部手術(shù)的POCD發(fā)生使患者對(duì)于各種不良因素的反應(yīng)減弱，更容易發(fā)生墜積性肺炎、下肢深靜脈炎、褥瘡等并發(fā)癥，間接影響手術(shù)的治療效果。大量臨床研究和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所證實(shí)，POCD的持續(xù)時(shí)間越長，遠(yuǎn)期恢復(fù)效果越差。Edelstein等[7]對(duì)老年髖部骨折患者行手術(shù)治療，隨訪發(fā)現(xiàn)術(shù)后發(fā)生POCD的患者其住院時(shí)間延長，患肢功能恢復(fù)緩慢。Marcantonio等[8]報(bào)道發(fā)生POCD的患者的術(shù)后6個(gè)月死亡率是未發(fā)生患者的3倍。因此，本研究通過構(gòu)建一種穩(wěn)定的小鼠股骨骨折髓內(nèi)固定的POCD模型，用以研究人參固本口服液對(duì)POCD的影響。

人參固本口服液是由人參固本丸改變劑型而成，具有補(bǔ)益元?dú)狻⒐瘫九嘣墓π6,9]。有研究表明，補(bǔ)益脾胃元?dú)夥剿幦藚?、洗心湯、大補(bǔ)元煎含藥腦脊液可拮抗腦組織β淀粉樣蛋白誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激，且其有效成分易透過血腦屏障，對(duì)大鼠海馬神經(jīng)干/祖細(xì)胞活力與遷移能力具有促進(jìn)作用[10]；補(bǔ)益脾胃元?dú)夥剿帉?duì)快速老化癡呆模型小鼠空間識(shí)別和學(xué)習(xí)記憶能力有明顯的改善作用，可能與人參皂苷Rg1密切相關(guān)[10-11]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，手術(shù)組小鼠平均逃避潛伏期延長，學(xué)習(xí)記憶次數(shù)增加，穿越次數(shù)減少，表明股骨骨折髓內(nèi)固定小鼠學(xué)習(xí)記憶功能受損，出現(xiàn)術(shù)后認(rèn)知功能的改變。而手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組較手術(shù)組平均逃避潛伏期縮短，平均學(xué)習(xí)記憶次數(shù)減少，平均穿越次數(shù)增加，提示高劑量人參固本口服液可明顯改善股骨骨折髓內(nèi)固定小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能損傷，其功能的改善可能與人參固本口服液中的人參皂苷密切相關(guān)。

目前普遍認(rèn)為POCD的發(fā)生是在中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老的基礎(chǔ)上由麻醉和手術(shù)刺激誘發(fā)，多種因素綜合作用的結(jié)果，而炎癥反應(yīng)在其中發(fā)揮著重要的作用[12]。有研究發(fā)現(xiàn)在胃腸道大手術(shù)患者血清中IL-6顯著升高，且與POCD發(fā)生率相關(guān)[13]。Cibelli等[14]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)手術(shù)可致外周血中IL-1β、IL-6、TNF-α等水平升高，進(jìn)而使與海馬相關(guān)的記憶受損。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，手術(shù)組血清中TNF-α與IL-6水平明顯升高，提示股骨骨折髓內(nèi)固定可誘發(fā)強(qiáng)烈的無菌性炎癥反應(yīng)；與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區(qū)炎癥因子TNF-α與IL-6水平降低，提示高劑量人參固本口服液可改善股骨骨折髓內(nèi)固定老齡小鼠POCD，可能與降低海馬區(qū)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

Bcl-2家族蛋白在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮著重要作用，Bcl-2是一種抑凋亡蛋白[15-16]，而Bax是促凋亡蛋白之一，兩者的表達(dá)含量及表達(dá)比率決定著細(xì)胞最終的生命走向[17-18]。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，手術(shù)組小鼠海馬區(qū)mRNA表達(dá)水平升高，mRNA表達(dá)水平降低，Bax/Bcl-2值升高，海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)明顯增多，提示手術(shù)造成小鼠海馬神經(jīng)凋亡傾向增加；與手術(shù)組比較，手術(shù)＋人參固本口服液高劑量組小鼠海馬區(qū)mRNA表達(dá)水平降低，mRNA表達(dá)水平升高，Bax/Bcl-2值降低，海馬組織神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)減少，凋亡率降低，提示高劑量人參固本口服液可降低小鼠海馬神經(jīng)凋亡的發(fā)生。

本研究表明，高劑量人參固本口服液可改善老齡小鼠股骨骨折POCD，可能與人參固本口服液中的人參皂苷通過降低炎癥因子TNF-α、IL-6水平，抑制炎癥反應(yīng)，從而降低海馬神經(jīng)元凋亡有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect and mechanism of Ginseng Guben Oral Liquid on cognitive function of mice after femoral fracture operation

ZHONG Yan-heng1, YAO Jing-chun4, SUN Cheng-hong4, ZHANG Gui-min3, LI Fa-sheng1, 2

1.The First Affiliated Hospital of Jinan University, Guangzhou 510630, China 2.Shenhe People’s Hospital (The Fifth Affiliated Hospital of Jinan University), Heyuan 517475, China 3.State Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Pharmaceutical Generic Technology, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China 4.Center for New Drug Pharmacology, Lunan Pharmaceutical Group Co., Ltd., Linyi 276006, China

To investigate the effect and mechanism of Ginseng Guben Oral Liquid (人參固本口服液, RSGB) on cognitive function of mice after femoral fracture surgery.Sixty C57BL/6 mice were randomly divided into control group, RSGB (0.50 mL/mice) group, surgery group and surgery + RSGB low-, medium- and high-dose (0.05, 0.10, 0.50 mL/mice) groups.Mice were anesthetized to prepare a fracture model, and each administration group was given corresponding drugs.On 3rd day after operation, escape latency of mice was recorded by Morris water maze test, learning and memory times of mice were detected by Y-maze, and emotional behavior of mice was detected by open field test; After behavioral study, mice were sacrificed and hippocampal tissue was taken.ELISA method was used to detect tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-6 (IL-6) levels in hippocampus of mice; qRT-PCR was used to determine the mRNA expressions of B-cell lymphoma 2 () and Bcl-2 associated X protein () in hippocampus; TUNEL method was used to detect the apoptosis of hippocampal neurons.Compared with operation group, average escape latency of mice in operation + RSGB high-dose group was significantly shortened on 3rd day after operation (< 0.05), learning and memory times were significantly reduced (< 0.05), and crossing times were significantly increased (< 0.05); TNF-α and IL-6 levels in serum were significantly decreased (< 0.05);mRNA expression in hippocampus was significantly decreased (< 0.05), andmRNA expression was significantly increased (< 0.05); Number of apoptotic neurons in hippocampus was significantly decreased (< 0.05).RSGB can inhibit inflammatory response and reduce apoptosis of hippocampal neurons, thereby improving the cognitive dysfunction in mice after femoral fracture.

Ginseng Guben Oral Liquid; fracture; cognitive function; inflammatory response; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3078 - 06

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.018

2022-01-27

中藥制藥共性技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金資助項(xiàng)目（202009）

鐘彥亨（1991—），男，碩士，醫(yī)師，研究方向?yàn)榧怪?、?chuàng)傷骨科疾病。Tel: (020)38688617 E-mail: 784826926@qq.com

通信作者：李法升（1989—），男，本科，主管技師，研究方向?yàn)楣强葡嚓P(guān)疾病的影像研究。Tel: 13802423266 E-mail: 412447633@qq.com

張貴民（1969—），男，研究員，研究方向?yàn)閯?chuàng)新藥物研發(fā)研究。Tel: (0539)5030565 E-mail: lunanzhangguimin@yeah.net

[責(zé)任編輯 李亞楠]