劉 旭，鐘國(guó)威，劉天晟，喻 嶸, *，譚丹妮，向 琴，劉 秀

? 藥理與臨床?

白虎加人參湯對(duì)MKR轉(zhuǎn)基因2型糖尿病小鼠創(chuàng)面感染的作用

劉 旭1，鐘國(guó)威3，劉天晟4，喻 嶸1, 2*，譚丹妮1，向 琴1，劉 秀2

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208 2.中醫(yī)方證研究轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410208 3.湖南大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410082 4.湖南師范大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410081

探討白虎加人參湯對(duì)2型糖尿病動(dòng)物模型骨骼肌特異性胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體功能缺失（loss of skeletal muscle-specific insulin-like growth factor-1 receptor function，MKR）小鼠創(chuàng)面感染的作用及機(jī)制。MKR小鼠經(jīng)鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）干預(yù)與創(chuàng)面滴加耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）懸液，構(gòu)建2型糖尿病創(chuàng)面感染模型，隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（0.11 g/kg）組和白虎加人參湯低、高劑量（14、28 g/kg）組，采用同齡FVB/N小鼠作為對(duì)照組，每組5只；給藥12 d，每4天測(cè)量各組小鼠體質(zhì)量、創(chuàng)面大小、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清中胰島素、C肽、糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-1β水平，以及血清與胰腺中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）活性；采用蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染色觀察小鼠胰腺和皮膚創(chuàng)面形態(tài)；采用免疫組化染色觀察小鼠皮膚組織核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）抗原表達(dá)；采用Western blotting法檢測(cè)皮膚組織Nrf2和血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）蛋白表達(dá)。與模型組比較，白虎加人參湯高劑量組小鼠傷口顯著愈合（＜0.01）；糖代謝水平顯著改善（＜0.01）；血清炎性因子TNF-α、IL-6和IL-1β水平顯著下降（＜0.05、0.01）；血清與胰腺中抗氧化因子SOD、CAT和GPx活性顯著上升（＜0.05、0.01）；胰島β細(xì)胞凋亡減少（＜0.01）；皮膚組織中Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。白虎加人參湯可能通過(guò)改善糖代謝、緩解炎癥反應(yīng)、提高抗氧化能力，保護(hù)胰島β細(xì)胞的數(shù)量與功能，激活Nrf2/HO-1通路，從而發(fā)揮治療2型糖尿病創(chuàng)面感染的作用。

白虎加人參湯；MKR小鼠；糖尿??；創(chuàng)面感染；核因子E2相關(guān)因子2/血紅素氧合酶-1

據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)盟最新報(bào)告，2021年全球糖尿病患者已達(dá)5.37億人，平均每10人中就有1人為糖尿病患者[1]。目前，多達(dá)25%的糖尿病患者一生面臨慢性不愈合傷口的風(fēng)險(xiǎn)，如糖尿病足潰瘍（diabetic foot ulcers，DFUs）使患者面臨截肢的風(fēng)險(xiǎn)，這其中有至少68%的患者會(huì)在5年內(nèi)死亡[2]。大量的研究表明，氧化應(yīng)激在阻止糖尿病患者創(chuàng)面愈合進(jìn)程中扮演著重要角色[3-4]。糖尿病創(chuàng)面氧化應(yīng)激的特點(diǎn)是創(chuàng)面局部活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平顯著升高，這是由于ROS的生成途徑增加以及ROS的清除機(jī)制發(fā)生紊亂[5]。適度的氧化應(yīng)激已被證明有利于細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）的生成，而高水平的ROS會(huì)阻礙ECM的正常合成，并且對(duì)已經(jīng)存在的ECM產(chǎn)生一系列損害，從而導(dǎo)致糖尿病傷口遷延難愈[6-7]。核因子E2相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是細(xì)胞防御多種應(yīng)激損傷的關(guān)鍵因子，在生理?xiàng)l件的ROS刺激下，Nrf2發(fā)生磷酸化反應(yīng)被激活，進(jìn)而啟動(dòng)其下游調(diào)節(jié)蛋白血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）共同清除ROS。但是不受控的、過(guò)量生成的ROS導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而抑制Nrf2的激活，損害細(xì)胞功能，促進(jìn)多種疾病的發(fā)生發(fā)展。因此抗氧化應(yīng)激，促進(jìn)Nrf2、HO-1的激活表達(dá)，成為改善糖尿病傷口遷延難愈的有效方法。

白虎加人參湯出自東漢張仲景所著《傷寒雜病論》，是治療消渴病的經(jīng)典名方。大量臨床應(yīng)用及本課題組前期研究表明，白虎加人參湯具有降血糖、抗炎、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)胰島β細(xì)胞等作用，可有效改善糖尿病、延緩相關(guān)并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展[8-10]。本研究以鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）干預(yù)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（methicillin-resistant staphylococcus aureus，MRSA）感染的骨骼肌特異性胰島素樣生長(zhǎng)因子-1受體功能缺失（loss of skeletal muscle-specific insulin-like growth factor-1 receptor function，MKR）小鼠為研究對(duì)象，探討白虎加人參湯對(duì)MKR小鼠糖代謝、氧化應(yīng)激、創(chuàng)面愈合等方面的作用，并且進(jìn)一步探討了白虎加人參湯對(duì)Nrf2/HO-1通路表達(dá)的影響，為糖尿病創(chuàng)面感染治療及白虎加人參湯的臨床應(yīng)用提供了新思路。

1 材料

1.1 動(dòng)物與菌株

SPF級(jí)雄性MKR小鼠，體質(zhì)量（17±2）g，6周齡，由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院糖尿病研究中心提供，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)SPF級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心［SYXK（湘）2013-0005］。SPF級(jí)雄性FVB/N小鼠，6周齡，體質(zhì)量（17±2）g，購(gòu)自北京斯貝福生物技術(shù)公司［SCXK（京）2019-0010］。小鼠被安置于標(biāo)準(zhǔn)化動(dòng)物房中，自由進(jìn)食飲水。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均根據(jù)湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南執(zhí)行，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)ZYFY20201229）。

MRSA標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43300由湖南大學(xué)生物學(xué)院劉斌教授與童春義教授課題組惠贈(zèng)。

1.2 藥材

白虎加人參湯組方藥材石膏（批號(hào)SAO247）、知母（批號(hào)202106150）、人參（批號(hào)210429）、炙甘草（批號(hào)210502）飲片購(gòu)自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院門(mén)診中藥房，粳米為市售。經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院吳勇軍副教授鑒定分別為硫酸鹽類(lèi)礦物石膏族石膏、百合科植物知母Bge.的干燥根莖、五加科植物人參C.A.Mey.的干燥根和根莖、豆科植物甘草Fisch.的干燥根和根莖的炮制品、禾本科植物稻L.的干燥種子，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

鹽酸二甲雙胍片（國(guó)藥準(zhǔn)字H44024853，批號(hào)2012008，0.25 g/片）購(gòu)自深圳市中聯(lián)制藥有限公司；小鼠胰島素ELISA檢測(cè)試劑盒（批號(hào)210415）購(gòu)自上海碧云天公司；糖化血清蛋白（glycated serum protein，GSP）測(cè)定試劑盒（批號(hào)20210317）購(gòu)自南京建成生物工程研究所有限公司；小鼠C肽ELISA試劑盒（批號(hào)210218）購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；STZ（批號(hào)20210316）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)S8211）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C3209）、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶（glutathion peroxidase，GPx）活性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)G5174）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)F26031595）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒（批號(hào)F27031596）、IL-1β檢測(cè)試劑盒（批號(hào)G13031594）購(gòu)自武漢華美生物公司；Nrf2抗體（批號(hào)12721）購(gòu)自美國(guó)CST公司；HO-1抗體（批號(hào)27282-1-AP）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（批號(hào)10494-1-AP）、HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)SA00001-2）購(gòu)自美國(guó)ProteinTech公司；多聚甲醛固定液、蘇木素-伊紅（hematoxylin-eosin，HE）染液購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.4 儀器

GA-3型血糖儀（三諾生物公司）；5418R/5702R型高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）；EnSpire 2300型多功能酶標(biāo)分析儀（新加坡PerkinElmer公司）；8000型電熱恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Scientific公司）；DYY-6C型電泳儀（中國(guó)北京六一公司）；DYCZ-40D型轉(zhuǎn)膜系統(tǒng)（中國(guó)北京六一公司）；YP1002N型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；JSM-6700F型掃描顯微鏡（日本JEOL公司）。

2 方法

2.1 白虎加人參湯的制備

白虎加人參湯根據(jù)《傷寒雜病論》記載，按照現(xiàn)代劑量換算，參照普通高等教育“十五”國(guó)家級(jí)規(guī)劃教材《方劑學(xué)》，取知母18 g、石膏50 g、人參10 g、炙甘草6 g、粳米9 g。以8倍量蒸餾水浸泡上述藥物30 min，煎煮30 min，藥液留存待用；投入6倍量蒸餾水再次煎煮30 min，合并2次水煎液，濾過(guò)殘?jiān)ㄟ^(guò)旋轉(zhuǎn)蒸餾儀濃縮為含生藥量4 g/mL濃縮液，分裝保存于4 ℃?zhèn)溆?。?jīng)高效液相色譜法測(cè)定，提取物中含鈣離子7.03%、知母多糖3.82%、芒果苷2.09%、人參總皂苷0.36%、甘草酸0.17%[8,11]。

2.2 菌液的制備

MRSA菌株接種于新鮮LB培養(yǎng)基中，在37 ℃細(xì)菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期階段挑取單個(gè)生長(zhǎng)良好的菌落，加入0.85%無(wú)菌生理鹽水震蕩混勻，使用濁度儀調(diào)整菌液濃度為1×108CFU/mL，保存于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分組、造模與給藥

20只6周齡雄性MKR小鼠，ip STZ溶液（40 mg/kg，用pH 4.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液制備，現(xiàn)用現(xiàn)配），連續(xù)5 d；通過(guò)尾靜脈采血測(cè)量空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG），F(xiàn)BG≥11.1 mmol/L的小鼠納入實(shí)驗(yàn)。小鼠ip 0.3%戊巴比妥鈉溶液（0.1 mL/g）麻醉后，用脫毛膏脫去背部毛發(fā)，于無(wú)菌條件下，在背部中心制備直徑約為13 mm的圓形全層創(chuàng)面，隨后在小鼠傷口上滴加100 μL MRSA懸液，連續(xù)感染2 d后，創(chuàng)面紅腫，分泌黃白色膿液，用無(wú)菌棉簽蘸取創(chuàng)面滲出液進(jìn)行平板實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)大量MRSA，提示創(chuàng)面感染模型建立成功[12-13]。

按照隨機(jī)數(shù)字表法將20只創(chuàng)面感染模型小鼠隨機(jī)分為模型組、二甲雙胍（0.11 g/kg）組和白虎加人參湯低、高劑量（14、28 g/kg，分別相當(dāng)于臨床1、2倍劑量）組，每組5只。取5只6周齡雄性FVB/N小鼠，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，制備背部創(chuàng)面并感染后，作為對(duì)照組。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對(duì)照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)12 d。各組小鼠背部創(chuàng)面以無(wú)菌紗布覆蓋加創(chuàng)可貼固定，每日更換干凈紗布與創(chuàng)可貼。

2.4 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠體質(zhì)量的影響

給藥第0、4、8、12天，使用小動(dòng)物體質(zhì)量秤記錄各組小鼠空腹體質(zhì)量。

2.5 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠傷口變化的影響

在給藥第0、4、8、12天，對(duì)小鼠背部感染創(chuàng)面拍照記錄，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量創(chuàng)面的大小變化，并計(jì)算創(chuàng)面面積（）。

＝π××

為創(chuàng)面面積（mm2），為創(chuàng)面長(zhǎng)軸/2，為創(chuàng)面短軸/2

2.6 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠糖代謝的影響

給藥第0、4、8、12天，使用血糖儀經(jīng)尾靜脈采血，測(cè)量各組小鼠FBG；末次給藥后，通過(guò)眼眶采血，得到血清后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清胰島素、血清C肽、糖化血清蛋白水平。

2.7 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠全身性炎癥水平的影響

末次給藥結(jié)束后，通過(guò)眼眶采血獲得血清后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平。

2.8 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠全身性氧化應(yīng)激水平的影響

末次給藥結(jié)束后，通過(guò)眼眶采血獲得血清后，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠血清SOD、CAT和GPx活性。

2.9 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠胰腺氧化應(yīng)激水平的影響

末次給藥結(jié)束后，獲得新鮮的胰腺組織，剪取適量組織放入液氮速凍，后轉(zhuǎn)入?85 ℃保存，臨用前加入10倍體積提取液進(jìn)行冰浴勻漿；4 ℃、10 000 r/min離心10 min，取上清，按檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定小鼠胰組織SOD、CAT和GPx活性。

2.10 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠胰腺組織病理變化的影響

將新鮮胰腺組織置于4%多聚甲醛中固定，脫水、透明后，用石蠟包埋，切片和烘干后，用二甲苯與梯度乙醇脫蠟，行HE染色，于顯微鏡下觀察并拍照，并且使用Image J 8.0軟件進(jìn)行分析，測(cè)量各組胰島面積，計(jì)算各組小鼠單個(gè)胰島的平均面積。

2.11 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠皮膚組織病理變化的影響

剪取小鼠背部皮膚組織，置于4%多聚甲醛中固定24 h以上，脫水、透明后，用石蠟包埋。切片、烘干、脫蠟至水后，一部分皮膚組織切片進(jìn)行HE染色，一部分皮膚組織切片經(jīng)過(guò)抗原修復(fù)、3% H2O2溶液孵育10 min淬滅內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性、5%血清封閉10 min、一抗4 ℃孵育過(guò)夜、二抗室溫孵育30 min、顯色、染核等步驟，進(jìn)行Nrf2免疫組化染色，最后在顯微鏡下觀察并拍照。

2.12 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠皮膚組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

剪取適量小鼠背部皮膚組織，用SDS裂解液在生物樣品均質(zhì)儀中研磨裂解皮膚組織，提取總蛋白。蛋白上清與loading buffer混勻并煮沸，制備變性蛋白待用。電泳2.5 h，轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉封閉，4 ℃過(guò)夜；分別加入Nrf2（1∶1000）、HO-1（1∶2000）、GAPDH（1∶3000）抗體孵育90 min，用PBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶6000）孵育90 min，最后用ECL化學(xué)發(fā)光液顯色，在化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)儀內(nèi)拍照。

2.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠體質(zhì)量的影響

如表1所示，從感染MRSA到創(chuàng)面逐漸愈合，各組小鼠的體質(zhì)量保持平穩(wěn)無(wú)明顯波動(dòng)，不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.2 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠傷口變化的影響

如圖1和表2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠創(chuàng)面愈合緩慢，在給藥第8天創(chuàng)面面積顯著大于對(duì)照組（＜0.01），并可見(jiàn)創(chuàng)面上覆大量黃色渾濁膿液；在給藥第12天創(chuàng)面仍有膿液分泌，創(chuàng)面面積顯著大于對(duì)照組（＜0.01）。與模型組比較，給藥第8天，二甲雙胍組小鼠背部創(chuàng)面一定程度愈合，創(chuàng)面相對(duì)干燥上覆蜜黃色厚痂，創(chuàng)面面積減?。ǎ?.05）；白虎加人參湯低劑量組小鼠創(chuàng)面面積變化較模型組不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，從圖中可見(jiàn)創(chuàng)面呈糜爛狀態(tài)，有淡黃色清稀滲出液；白虎加人參湯高劑量組小鼠背部創(chuàng)面顯著自愈（＜0.01），創(chuàng)面僅見(jiàn)少量清澈的血性分泌物，創(chuàng)面周邊毛發(fā)恢復(fù)生長(zhǎng)。給藥第12天，與模型組比較，二甲雙胍組創(chuàng)面顯著愈合（＜0.01），創(chuàng)面干燥結(jié)痂，周邊毛發(fā)恢復(fù)生長(zhǎng)；白虎加人參湯低劑量組小鼠創(chuàng)面干燥、糜爛減輕，但愈合程度較模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；白虎加人參湯高劑量組小鼠創(chuàng)面顯著自愈（＜0.01），痂吸收脫落，背部毛發(fā)生長(zhǎng)基本全面恢復(fù)。

表1 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠體質(zhì)量的影響(, n = 5)

Table 1 Effect of Ginseng-plus-Baihu-Tang on body weight of STZ/MRSA MKR mice (, n = 5)

表1 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠體質(zhì)量的影響(, n = 5)

組別劑量/(g·kg?1)體質(zhì)量/g 第0天第4天第8天第12天 對(duì)照—18.18±0.3219.48±0.8220.45±0.8521.10±1.20 模型—18.60±3.2018.80±3.0019.03±3.4719.48±3.52 二甲雙胍0.1119.13±3.1720.08±2.9220.73±2.8721.25±2.25 白虎加人參湯1418.55±1.1519.08±1.4219.80±1.5020.50±1.20 2818.63±0.5719.43±0.7720.23±0.4720.95±0.45

圖1 各組小鼠MRSA感染創(chuàng)面照片

表2 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSAMKR小鼠傷口變化的影響(, n = 5)

Table 2 Effect of Ginseng-plus-Baihu-Tang on wound changes in STZ/MRSA MKR mice (, n = 5)

表2 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSAMKR小鼠傷口變化的影響(, n = 5)

組別劑量/(g·kg?1)傷口面積/mm2 第0天第4天第8天第12天 對(duì)照—82.19±4.9571.02±6.0920.34±1.860.65±0.38 模型—82.68±5.4074.80±7.6938.71±2.89##11.92±3.47## 二甲雙胍0.1183.07±9.9469.89±11.9926.93±11.05*1.36±0.34** 白虎加人參湯1482.89±29.7174.16±19.5637.64±3.468.72±3.26 2882.56±8.4269.07±13.3320.79±7.75**0.84±1.32**

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下表同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below tables

3.3 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠糖代謝的影響

如表3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中全程處于高血糖狀態(tài)（＜0.01）；與模型組比較，給藥第8天，白虎加人參湯高劑量組小鼠FBG下降（＜0.05），給藥第12天，二甲雙胍組和白虎加人參湯高劑量組小鼠FBG均顯著下降（＜0.01）；白虎加人參湯低劑量組小鼠FBG與模型組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

表3 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠FBG的影響(, n = 5)

Table 3 Effect of Ginseng-plus-Baihu-Tang on FBG in STZ/MRSA MKR mice (, n = 5)

表3 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠FBG的影響(, n = 5)

組別劑量/(g·kg?1)FBG/(mmol·L?1) 第0天第4天第8天第12天 對(duì)照—5.78±0.425.93±0.275.58±0.225.80±0.50 模型—11.90±1.10##11.08±1.42##10.20±0.50##9.48±0.62## 二甲雙胍0.1111.88±0.6210.65±0.559.05±0.756.63±0.17** 白虎加人參湯1411.90±0.3010.95±0.559.80±0.808.60±0.80 2811.98±0.2210.70±0.608.68±0.92*6.58±0.52**

如表4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清胰島素、血清C肽水平顯著下降（＜0.01），糖化血清蛋白含量顯著上升（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組小鼠血清胰島素水平均顯著上升（＜0.01），GSP水平均顯著下降（＜0.05、0.01），C肽水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.4 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠全身性炎癥水平的影響

如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和白虎加人參湯高劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β水平均顯著下降（＜0.05、0.01），白虎加人參湯低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.5 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠全身性氧化應(yīng)激水平的影響

如圖3所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中SOD、CAT和GPx活性均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和白虎加人參湯高劑量組小鼠血清SOD、CAT和GPx活性顯著上升（＜0.05、0.01），白虎加人參湯低劑量組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3.6 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠胰腺氧化應(yīng)激水平的影響

如圖4所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠胰腺組織SOD、CAT和GPx活性均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組小鼠胰腺組織SOD和CAT活性顯著上升（＜0.01），白虎加人參湯低劑量組小鼠胰腺組織CAT活性顯著上升（＜0.05），白虎加人參湯高劑量組小鼠胰腺組織SOD、CAT和GPx活性均顯著上升（＜0.05、0.01）。

表4 GBHT對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠糖代謝的影響(, n = 5)

Table 4 Effect of Ginseng-plus-Baihu-Tang on glucose metabolism in STZ/MRSA MKR mice (, n = 5)

表4 GBHT對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠糖代謝的影響(, n = 5)

組別劑量/(g·kg?1)胰島素/(μIU·mL?1)C肽/(ng·mL?1)GSP/(mmol·L?1) 對(duì)照—49.19±8.569.88±1.751.47±0.31 模型—6.15±1.68##5.64±1.27##5.38±0.74## 二甲雙胍0.1125.10±5.34**7.58±1.012.99±0.43** 白虎加人參湯1419.24±4.43**5.99±1.384.03±0.44* 2825.72±5.53**8.33±0.662.93±0.65**

與對(duì)照組比較：##＜0.01；與模型組比較：*＜0.05**＜0.01，下圖同

##< 0.01control group;*< 0.05**< 0.01model group, same as below figures

圖2 GBHT對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠全身性炎癥水平的影響(,= 5)

Fig.2 Effect of Ginseng-plus-Baihu-Tang on systemic inflammation of STZ/MRSA MKR mice (,= 5)

圖3 GBHT對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠全身性氧化應(yīng)激水平的影響(, n = 5)

圖4 GBHT對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠胰腺氧化應(yīng)激水平的影響(, n = 5)

3.7 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠胰腺組織病理變化的影響

如圖5、6所示，對(duì)照組小鼠的胰島邊界清晰，形態(tài)呈較規(guī)則的圓形，質(zhì)地致密，胰島內(nèi)胰島細(xì)胞數(shù)量豐富、排列規(guī)整、胞質(zhì)豐富，胰島內(nèi)毛細(xì)血管盤(pán)繞曲折，未見(jiàn)血管擴(kuò)張。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的胰島數(shù)目及胰島面積顯著縮?。ǎ?.01），胰島內(nèi)胰島細(xì)胞數(shù)量減少、排列紊亂、形態(tài)不一，可見(jiàn)到細(xì)胞核固縮、大小不一，并可見(jiàn)到明顯的血管充血擴(kuò)張。與模型組比較，各給藥組小鼠胰腺組織的病理改變有不同程度的改善，二甲雙胍組小鼠胰島面積顯著增加（＜0.01），胰島邊界清晰，胰島細(xì)胞數(shù)量增多、大小基本一致、細(xì)胞排列較為規(guī)則，細(xì)胞核大小基本一致，胰島內(nèi)血管充血擴(kuò)張明顯減輕；白虎加人參湯低劑量組小鼠胰島數(shù)量較模型組增加，但平均的單個(gè)胰島面積變化與模型組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，胰島質(zhì)地疏松，邊界不甚清晰，雖然胰島細(xì)胞數(shù)量一定程度增加，但可見(jiàn)細(xì)胞核排列紊亂、染色不均勻，部分細(xì)胞呈空泡變性，并且胰島中血管充血擴(kuò)張明顯；白虎加人參湯高劑量組小鼠胰島面積顯著增加（＜0.01），胰島呈橢圓形或圓形，邊界清晰，質(zhì)地致密，胰島中胰島細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞分布均勻，胰島內(nèi)血管充血明顯減輕。

圖5 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠胰腺組織病理變化的影響

圖6 各組小鼠胰腺組織HE染色圖中胰島的平均面積(, n = 5)

3.8 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠皮膚組織病理變化的影響

如圖7所示，對(duì)照組小鼠皮膚組織的HE染色圖中表皮層及真皮層結(jié)構(gòu)清晰，表皮層較薄，棘層約為2～3層細(xì)胞，基底層細(xì)胞排列整齊呈矮柱狀，真皮層可見(jiàn)清晰的皮脂腺、新生的毛細(xì)血管，排列整齊的膠原纖維；Nrf2免疫組化染色圖中陽(yáng)性信號(hào)明顯、相關(guān)抗原表達(dá)豐富。與對(duì)照組小鼠相比，模型組小鼠HE染色圖中無(wú)完整的表皮層，真皮層結(jié)構(gòu)被嚴(yán)重?fù)p壞，膠原纖維生成減少、排列紊亂，并見(jiàn)其中有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；Nrf2免疫組化染色圖中抗原表達(dá)低。與模型組小鼠比較，各給藥組小鼠皮膚創(chuàng)面有不同程度的恢復(fù)，HE染色圖中可見(jiàn)小鼠表皮層不同程度地恢復(fù)，真皮層中見(jiàn)不同程度的膠原纖維增生，白虎加人參湯低劑量組小鼠皮膚組織中膠原纖維明顯凝聚呈條索狀，其中可見(jiàn)少量浸潤(rùn)的炎癥細(xì)胞，二甲雙胍組和白虎加人參湯高劑量組小鼠皮膚組織真皮層較白虎加人參湯低劑量組真皮層質(zhì)地更為致密，膠原纖維增生明顯，排列更為有序；在Nrf2免疫組化圖中可見(jiàn)白虎加人參湯高劑量組小鼠皮膚中的抗原表達(dá)最為豐富，陽(yáng)性信號(hào)最為強(qiáng)烈，二甲雙胍組小鼠皮膚中抗原表達(dá)略低，白虎加人參湯低劑量組小鼠皮膚中抗原表達(dá)為用藥組中最低。

圖7 MKR小鼠皮膚創(chuàng)面的HE染色和Nrf2免疫組化染色病理圖

3.9 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠皮膚組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

如圖8所示，與對(duì)照組比較，模型組小鼠皮膚組織中HO-1和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著下降（＜0.01）；與模型組比較，二甲雙胍組和白虎加人參湯高劑量組小鼠皮膚組織中HO-1和Nrf2蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.05、0.01）。

圖8 白虎加人參湯對(duì)STZ/MRSA MKR小鼠皮膚組織Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響(, n = 5)

4 討論

隨著糖尿病患者的護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)日漸全面，許多糖尿病相關(guān)并發(fā)癥，特別是大血管疾病所引發(fā)的死亡率急劇下降。然而據(jù)統(tǒng)計(jì)，糖尿病并發(fā)傷口感染、膿毒癥、蜂窩組織炎等感染性疾病的患者數(shù)量是非糖尿病患者的4倍，并且患者數(shù)量仍在驚人地增加[14]。臨床研究顯示，糖尿病患者較差的傷口愈合能力成為誘發(fā)感染性疾病的重要原因[15]。一方面，由于糖尿病患者血糖升高，皮膚組織的含糖量增高，給細(xì)菌感染創(chuàng)造了良好環(huán)境；另一方面，與正常組織中典型的凝血、炎癥、增殖、重塑等生理過(guò)程依次順序出現(xiàn)不同，糖尿病患者傷口愈合的正常進(jìn)程被氧化應(yīng)激擾亂和延遲，創(chuàng)面局部顯著升高的ROS導(dǎo)致傷口難以愈合[6-7]。高水平ROS阻礙正常的ECM的生成，并損害已經(jīng)存在的ECM，如H2O2會(huì)破壞組織生長(zhǎng)，特別是膠原蛋白的生成，從而阻止傷口愈合[16-17]。同時(shí)，ROS介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，導(dǎo)致TNF-α、IL-1β、IL-6等相關(guān)炎癥因子表達(dá)升高。糖尿病患者全身性的、低度的與創(chuàng)面局部的、加重的炎癥反應(yīng)，同樣導(dǎo)致創(chuàng)面難以愈合。因此，降低血糖與抗氧化應(yīng)激成為治療糖尿病并發(fā)創(chuàng)面感染的關(guān)鍵。

高血糖與氧化應(yīng)激有復(fù)雜的相互關(guān)系，二者互為因果又相互加劇[18-20]。慢性高血糖通過(guò)多種分子途徑誘導(dǎo)自由基的產(chǎn)生[21-22]。高水平的ROS導(dǎo)致功能性胰島β細(xì)胞數(shù)量下降、胰島體積減小，并且通過(guò)促進(jìn)脂質(zhì)過(guò)氧化、DNA斷裂、蛋白質(zhì)聚集、蛋白質(zhì)變性和蛋白質(zhì)碎裂等[23-26]，導(dǎo)致大分子不可逆轉(zhuǎn)的損害，這些都可能導(dǎo)致胰島β細(xì)胞功能障礙甚至凋亡[27-28]，從而導(dǎo)致葡萄糖刺激的胰島素分泌減少[29-30]，血糖升高，進(jìn)一步加劇氧化應(yīng)激。

Nrf2作為細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的中央調(diào)節(jié)因子，調(diào)控HO-1、GPx、SOD和CAT等250多種不同的抗氧化酶[31]。目前，Nrf2通路被認(rèn)為在肥胖、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、帕金森、阿茨海默癥等多種疾病中起到防御作用，Nrf2主要通過(guò)清除ROS減少氧化損傷來(lái)發(fā)揮保護(hù)作用[32]。越來(lái)越多的證據(jù)表明，糖尿病中Nrf2通路的激活對(duì)保護(hù)和保存功能性β細(xì)胞群至關(guān)重要[33]。除了增加存活率外，Nrf2表達(dá)上調(diào)還可促進(jìn)β細(xì)胞增殖，從而增加功能性β細(xì)胞數(shù)量[34]。Nrf2還可通過(guò)多種途徑促進(jìn)葡萄糖刺激的胰島素分泌[35]，并且，胰島素也促進(jìn)Nrf2轉(zhuǎn)位入核以及激活其下游抗氧化蛋白的表達(dá)[36]。Nrf2靶基因的表達(dá)，在糖尿病患者的皮膚組織和糖尿病模型大鼠的成纖維細(xì)胞中，急劇下降[37-38]。綜上所述，保護(hù)胰島β細(xì)胞的功能與數(shù)量、激活Nrf2的信號(hào)表達(dá)，可改善血糖、抑制氧化應(yīng)激與炎癥反應(yīng)，從而加速傷口閉合[39]，這個(gè)結(jié)論也在針對(duì)Nrf2?/?糖尿病小鼠創(chuàng)口的實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證[40]。

目前已知的絕大多數(shù)Nrf2激活劑是天然產(chǎn)物，有中藥單體成分如蘆丁、芒果苷、黃芩苷、人參皂苷Rg1等，也有中藥復(fù)方如復(fù)方黃柏液[38,41]。這些藥物的起效機(jī)制主要圍繞著激活Nrf2信號(hào)通路、減輕氧化損傷，以達(dá)到促進(jìn)傷口愈合的目的。由于糖尿病合并創(chuàng)面感染既有局部的顯著病變又有同時(shí)伴發(fā)的全身性基礎(chǔ)疾病，因此區(qū)別于傳統(tǒng)的外治法，推測(cè)是否可以通過(guò)內(nèi)治法作用于全身性基礎(chǔ)性疾病——糖尿病，進(jìn)而改善局部病變——?jiǎng)?chuàng)面感染，提高機(jī)體自愈能力，實(shí)現(xiàn)標(biāo)本兼顧。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，創(chuàng)面感染屬于“瘡瘍”范疇，糖尿病合并創(chuàng)面感染即是“消渴病合并瘡瘍”，主要病機(jī)是消渴氣陰兩虛、燥熱內(nèi)結(jié)、毒蘊(yùn)瘀阻而發(fā)病[42]。漢代張仲景創(chuàng)立的用治肺胃熱盛、氣陰兩虛消渴病的白虎加人參湯，其主要組成藥物石膏知母清熱滋陰，泄內(nèi)蘊(yùn)熱毒；人參扶助正氣，補(bǔ)氣以祛瘀；甘草粳米共奏健脾固表之功，助機(jī)體托毒外出。白虎加人參湯在臨床中被應(yīng)用于單純性的皮膚瘙癢、膿毒癥、蕁麻疹、特應(yīng)性皮炎等皮膚疾病而見(jiàn)奇效[43]。同時(shí)，立足于本課題組對(duì)白虎加人參湯具有調(diào)節(jié)血糖、抗氧化應(yīng)激、保護(hù)胰島β細(xì)胞等作用的前期研究基礎(chǔ)[8-10]，嘗試以內(nèi)治法應(yīng)用白虎加人參湯于2型糖尿病合并創(chuàng)面感染的動(dòng)物模型，探索其治療效果及作用機(jī)制。

本實(shí)驗(yàn)采用已成熟用于研究2型糖尿病的模型動(dòng)物MKR轉(zhuǎn)基因小鼠[44-45]，5周齡左右便已顯現(xiàn)出胰島素抵抗、糖耐量異常、炎性因子表達(dá)升高等特征，輔以STZ干預(yù)誘導(dǎo)形成穩(wěn)定的2型糖尿病模型后，在小鼠背部制備創(chuàng)面并滴加菌液進(jìn)行感染。臨床觀察與實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，雖然糖尿病患者易感細(xì)菌以金黃色葡萄球菌為主[46]，但由于糖尿病所致免疫缺陷及臨床中抗生素的過(guò)度使用[47-48]，MRSA的感染率逐年上升[49]，因此采用MRSA作為小鼠創(chuàng)面感染菌株。本實(shí)驗(yàn)以二甲雙胍作為陽(yáng)性對(duì)照藥物，觀察比較白虎加人參湯低、高劑量的治療效果。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組小鼠創(chuàng)面愈合遲緩、糖代謝異常、血清炎性因子表達(dá)升高、抗氧化能力顯著下降，組織病理學(xué)顯示胰腺中胰島β細(xì)胞受損明顯、胰島面積顯著下降，皮膚組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重、炎性浸潤(rùn)明顯、Nrf2信號(hào)低表達(dá)。與模型組比較，白虎加人參湯組有不同程度的改善，尤其是白虎加人參湯高劑量組，在促進(jìn)創(chuàng)面愈合、降低血糖、促進(jìn)胰島素分泌、抗炎抗氧化等方面表現(xiàn)更為突出，組織病理學(xué)觀察同樣支持這一結(jié)論，高劑量白虎加人參湯顯著保護(hù)胰島β細(xì)胞、促進(jìn)皮膚膠原纖維合成、增強(qiáng)皮膚組織中Nrf2信號(hào)表達(dá)；進(jìn)一步檢測(cè)Nrf2、HO-1的蛋白表達(dá)，高劑量白虎加人參湯顯著激活皮膚組織的Nrf2/HO-1信號(hào)通路。

知母與人參是白虎加人參湯中主要組成藥物，并且Nrf2的激活劑芒果苷、人參皂苷Rg1，分別是知母與人參中重要的有效成分，這可能是白虎加人參湯能夠調(diào)節(jié)Nrf2/HO-1信號(hào)通路表達(dá)的原因?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究中，芒果苷已被證明具有較好的抗氧化、抗炎、改善糖脂代謝的作用[50]，人參皂苷Rg1被證明具有提高肝糖原合成、提高胰島素敏感性的作用[51]。同時(shí)，由于芒果苷的溶解度極低，在水中的溶解度僅為0.111 mg/mL[52]，在腸道中的生物利用度也僅為1.2%[53]，而高劑量的白虎加人參湯中芒果苷與人參皂苷含量更高，這可能是白虎加人參湯高劑量組治療效果更為顯著的重要原因。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)白虎加人參湯通過(guò)降低STZ/MRSA MKR小鼠FBG、提高機(jī)體抗氧化能力、保護(hù)胰島β細(xì)胞、激活皮膚組織中的Nrf2/HO-1信號(hào)通路，有效治療糖尿病、促進(jìn)創(chuàng)面愈合，這為白虎加人參湯的新應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，也為進(jìn)一步研究白虎加人參湯通過(guò)Nrf2/HO-1信號(hào)通路治療糖尿病、探索芒果苷等中藥單體成分在糖尿病合并創(chuàng)面感染中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Effect of Ginseng-plus-Baihu-Tang on wound infection in MKR transgenic type 2 diabetic mice

LIU Xu1, ZHONG Guo-wei3, LIU Tian-sheng4, YU Rong1, 2, TAN Dan-ni1, XIANG Qin1, LIU Xiu2

1.Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2.Hunan Key Laboratory of TCM Prescription and Syndromes Translational Medicine, Changsha 410208, China 3.Hunan University, Changsha 410082, China 4.Hunan Normal University, Changsha 410081, China

To investigate the effect and mechanism of Ginseng-plus-Baihu-Tang (白虎加人參湯, GBHT) on wound infection in type 2 diabetes mellitus (T2DM) with loss of skeletal muscle-specific insulin-like growth factor-1 receptor function (MKR).MKR mice were intervened with streptozotocin (STZ) and instilled with methicillin-resistant staphylococcus aureus (MRSA) suspension on wound to establish a wound infection model of T2DM, and then randomly divided into model group, metformin (0.11 g/kg) group, GBHT low- and high-dose (14, 28 g/kg) groups, FVB/N mice of same age were used as control group with five mice in each group; Mice were administered for 12 consecutive days, body weight, wound size and fasting blood glucose (FBG) of mice in each group were measured every four days; After experiment, ELISA was used to detect insulin, C-peptide, glycated serum protein (GSP), tumor necrosis factor-α (TNF-α), interleukin-6 (IL-6), IL-1β levels in serum of mice, and activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) in serum and pancreas of mice; Hematoxylin-eosin (HE) staining was used to observe the morphology of mice pancreas and skin wound; Immunohistochemical staining was used to observe the expression of nuclear factor E2-related factor 2 (Nrf2) antigen in mice skin tissue; Western blotting was used to detect Nrf2 and heme oxygenase-1 (HO-1) protein expressions skin tissue.Compared with model group, wounds of mice in GBHT high-dose group were significantly healed (< 0.01); Glucose metabolism level was significantly improved (< 0.01); Levels of inflammatory factors TNF-α, IL-6 and IL-1β in serum were significantly decreased (< 0.01, 0.05); Activities of antioxidant factors SOD, CAT and GPx in serum and pancreas were significantly increased (< 0.05, 0.01); Islet β-cell apoptosis was decreased (< 0.01); Expressions of Nrf2 and HO-1 protein in skin were significantly increased (< 0.01).GBHT may play a role in the treatment of type 2 diabetes wound infection by improving glucose metabolism, alleviating inflammatory response, increasing antioxidant capacity, protecting the number and function of pancreatic β cells and activating Nrf2/HO-1 pathway.

Ginseng-plus-Baihu-Tang; MKR mice; diabetes mellitus; wound infection; nuclear factor erythroid-2 related factor 2/heme oxygenase-1

R285.5

A

0253 - 2670(2022)10 - 3032 - 12

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.013

2022-01-31

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82074400）；國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82004185）；湖南省科技廳重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2020SK2101）；湖南省教育廳科學(xué)研究項(xiàng)目（20K094，20B450）；湖南省研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（CX20200786）

劉 旭，女，在讀博士生，研究方向?yàn)橹倬半s病證治思想及經(jīng)方應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail: liuxu_1721@163.com

通信作者：喻 嶸，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)橹倬半s病證治思想及經(jīng)方應(yīng)用基礎(chǔ)研究。E-mail: yuron@21cn.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]