范煜航，徐 暢#，費(fèi)雅蓉，程碧欣，丘鷹昆，鄭杭生*

三七總皂苷傳遞體中5種皂苷類(lèi)成分含量與包封率的測(cè)定研究

范煜航1，徐 暢1#，費(fèi)雅蓉，程碧欣1，丘鷹昆2，鄭杭生1*

1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053 2.廈門(mén)大學(xué)藥學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102

建立三七總皂苷（saponins，PNS）傳遞體（transfersomes，TFSs）（PNS-TFSs）中5種皂苷類(lèi)成分含量與包封率的測(cè)定方法，并探討藥物包封特性。采用超高效液相色譜（UPLC）法測(cè)定PNS-TFSs制劑中三七皂苷R1（NGR1）、人參皂苷Rg1（GRg1）、人參皂苷Re（GRe）、人參皂苷Rb1（GRb1）與人參皂苷Rd（GRd）的含量，色譜柱為Hypersil Gold柱（100 mm×2.0 mm，1.9 μm），流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm，柱溫為28 ℃。以離心超濾法結(jié)合UPLC測(cè)定傳遞體包封率。NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd對(duì)應(yīng)的各色譜峰專(zhuān)屬性與分離度良好（≥1.5），且分別在4.04～505.00、3.98～498.00、4.03～504.00、3.99～499.00、4.00～500.00 μg/mL呈良好的線性關(guān)系（≥0.999 7），精密度（RSD≤2.40%）、準(zhǔn)確度（97.23%≤回收率≤104.50%）與供試品溶液穩(wěn)定性（RSD≤0.90%）均符合要求；測(cè)得PNS傳遞體中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd質(zhì)量濃度依次為98.14、380.80、41.68、317.50、75.61 μg/mL，包封率依次為75.48%、69.68%、69.51%、92.35%、95.97%。UPLC法與離心超濾法可用于PNS傳遞體中多成分含量與包封率的測(cè)定，方法快速、準(zhǔn)確、可靠。

三七總皂苷；傳遞體；超高效液相色譜；離心超濾法；包封率；包封特性；三七皂苷R1；人參皂苷Rg1；人參皂苷Re；人參皂苷Rb1；人參皂苷Rd

三七是五加科人參屬植物三七(Burk.) F.H.Chen的干燥根及根莖，是中醫(yī)傳統(tǒng)用于體內(nèi)外各種出血之證及跌打損傷、瘀滯腫痛的要藥。其主要活性成分為三七總皂苷（saponins，PNS），PNS中主要成分包括三七皂苷R1（notoginsenoside R1，NGR1）、人參皂苷Rg1（ginsenoside Rg1，GRg1）、人參皂苷Re（ginsenoside Re，GRe）、人參皂苷Rb1（ginsenoside Rb1，GRb1）與人參皂苷Rd（ginsenoside Rd，GRd）等。PNS具有多種藥理作用，包括保護(hù)心腦血管系統(tǒng)、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、抗菌、抗炎等[1]，并對(duì)骨折的愈合、骨關(guān)節(jié)損傷及肢體功能的恢復(fù)等也具有顯著療效[2]，同時(shí)，也被廣泛用于治療軟組織損傷[3]。目前，PNS臨床給藥方式主要為和iv，然而，容易引起胃腸道藥物分解，且存在肝首關(guān)效應(yīng)，導(dǎo)致生物利用度低，而注射給藥存在患者順應(yīng)性差、安全性等問(wèn)題。此外，這2種給藥途徑均難以實(shí)現(xiàn)PNS在損傷局部組織分布，從而影響其治療局部損傷的作用。故在PNS的局部閉合性損傷治療中經(jīng)皮給藥成為一種更具優(yōu)勢(shì)的給藥途徑，因其可避免口服途徑存在的肝首過(guò)效應(yīng)和胃腸道分解，用藥安全性高，給藥次數(shù)少，且可明顯提高PNS在用藥部位皮下局部組織的濃度，從而提高對(duì)局部疾病的療效[4]。然而，因PNS中各成分相對(duì)分子質(zhì)量較大，難以透過(guò)角質(zhì)層屏障，故需要設(shè)計(jì)合理的透皮給藥劑型以達(dá)到理想的經(jīng)皮吸收效果。

傳遞體（transfersomes，TFSs）作為透皮給藥的優(yōu)良載體，已受到廣泛的關(guān)注，它是由磷脂、膽固醇形成的雙分子層與邊緣活化劑（edge activator，EA）共同構(gòu)成的可變形囊泡，后者的加入使TFSs具有良好的彈性和變形性，同時(shí)，由于天然存在的皮膚水化梯度的驅(qū)動(dòng)作用，故TFSs能通過(guò)僅為其自身粒徑十分之一大?。ū籘FSs誘導(dǎo)擴(kuò)張后）的皮膚角質(zhì)層中的水性通道，到達(dá)皮膚深層部位[5]，其中部分包載的藥物釋放后被吸收入血而發(fā)揮全身作用，而另一部分藥物則可實(shí)現(xiàn)皮下較深部位的靶向遞送[6]。故在臨床上局部疾病的治療中，相較于其他給藥途徑，TFSs能夠增加皮下局部組織中的藥物濃度，并顯著降低進(jìn)入體循環(huán)的藥量，從而發(fā)揮增效減毒的作用[7]。TFSs中常用的EA有膽酸鈉、聚山梨酯等表面活性劑。有研究發(fā)現(xiàn)，以檸檬烯與檸檬醛等單萜揮發(fā)油成分作為EA的TFSs具有相似的藥物經(jīng)皮滲透特性[8]，本課題組前期研究結(jié)果也證實(shí)了以揮發(fā)油作為EA的TFSs可明顯促進(jìn)藥物的透皮吸收與關(guān)節(jié)腔的局部藥物遞送[9-10]。

藥物包封率對(duì)于囊泡型藥物制劑的生物效應(yīng)有重要影響，《中國(guó)藥典》2020年版四部微囊、微球與脂質(zhì)體制劑指導(dǎo)原則中也明確規(guī)定脂質(zhì)體制劑中藥物的包封率不得低于80%[11]，而TFSs是脂質(zhì)體處方中加入EA后形成的脂質(zhì)囊泡載體，其包封率的高低會(huì)影響經(jīng)皮給藥后產(chǎn)生療效的優(yōu)劣，故包封率亦為T(mén)FSs處方工藝篩選和質(zhì)量評(píng)價(jià)的重要依據(jù)。為了提高PNS透皮與局部組織遞送效率，改善對(duì)局部閉合性損傷的療效，本課題組前期以單萜揮發(fā)油成分檸檬烯與檸檬醛作為EA將中藥有效部位PNS制備成傳遞體（PNS-TFSs）[12]。為了對(duì)該制劑進(jìn)行更加全面、合理的質(zhì)量評(píng)價(jià)，本實(shí)驗(yàn)建立了一種同時(shí)測(cè)定PNS-TFSs中多種主要皂苷類(lèi)成分含量的UPLC方法，并將離心超濾法與之結(jié)合，測(cè)定制劑中多種皂苷類(lèi)成分的包封率，進(jìn)而探討TFSs對(duì)PNS中皂苷類(lèi)成分的包封特性。本研究可為PNS-TFSs制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立與處方工藝的進(jìn)一步優(yōu)化奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

H-class超高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司；Hypersil Gold C18液相色譜柱（100 mm×2.0 mm，1.9 μm），美國(guó)Thermo公司；R-502系列旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海申生科技有限公司；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；SHB-111S型循環(huán)水式多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；XL2000型超聲破碎儀，美國(guó)Misonix公司；Nano-ZS90動(dòng)態(tài)激光散射粒度儀，英國(guó)Malvern公司；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡（TEM），日本Jeol公司；聚碳酸酯徑跡蝕刻膜，0.10、0.05 μm，英國(guó)Whatman公司；Olympus BX51型光學(xué)顯微鏡，日本奧林巴斯公司；Homoe X-25型高壓膜擠出儀，上海赫默仕機(jī)電科技有限公司；BS124S型電子天平，德國(guó)薩多利斯公司；FE20型臺(tái)式pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器有限公司；5804R型冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；Pall Nanosep離心濃縮管，截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000，美國(guó)Pall公司。

PNS，注射級(jí)，批號(hào)HB20081103，云南植物藥業(yè)有限公司；對(duì)照品GRg1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.6%，批號(hào)110703-201426）、GRb1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.1%，批號(hào)110704-201424）、GRd（質(zhì)量分?jǐn)?shù)96.3%，批號(hào)111818-201302）、GRe（質(zhì)量分?jǐn)?shù)95.7%，批號(hào)110754-201322）、NGR1（質(zhì)量分?jǐn)?shù)93.8%，批號(hào)110745-201015）均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；大豆卵磷脂（sbPC），注射級(jí)，批號(hào)131002，上海太偉藥業(yè)有限公司；檸檬烯（批號(hào)140825，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.3%）與檸檬醛（批號(hào)141006，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97.5%）均購(gòu)自吉安市聚鵬天然香料油有限公司；膽固醇（CH），注射級(jí)，批號(hào)B40333，上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；維生素E（VE），批號(hào)MKCD4493，Sigma公司；磷酸二氫鉀，分析純，批號(hào)20110801，溫州市化學(xué)用料廠；磷酸氫二鈉，分析純，批號(hào)130801，湖州湖試化學(xué)試劑有限公司；甲醇、二氯甲烷，分析純，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈，色譜純，美國(guó)Honeywell公司；UPLC用水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 PNS-TFSs的制備及物理性質(zhì)表征

2.1.1 PNS-TFSs的制備 本課題組前期研究確定了采用薄膜分散法制備PNS-TFSs，并以TFSs的彈性為指標(biāo)，通過(guò)均勻設(shè)計(jì)試驗(yàn)得到優(yōu)化處方與可行工藝[12]。本實(shí)驗(yàn)參照相關(guān)處方工藝進(jìn)行TFSs的制備。

分別配制0.067 mol/L磷酸二氫鉀溶液和0.067 mol/L磷酸氫二鈉溶液，兩者按124∶1的體積比混合，混合液稀釋10倍，即得需要濃度的pH值為5.0的磷酸鹽緩沖液（PBS 5.0），作為薄膜分散法中脂質(zhì)薄膜的水化液。

處方：PNS 100 mg、CH 30 mg、sbPC 120 mg、VE 2 mg、檸檬烯-檸檬醛（質(zhì)量比4∶1）混合揮發(fā)油80 mg、PBS 5.0 10 mL。

工藝：按處方量稱(chēng)取處方中除水化液之外的各組分，溶解于甲醇-二氯甲烷（3∶4）混合有機(jī)溶劑中，轉(zhuǎn)移至茄形瓶中，減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，得到干膜，繼續(xù)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2 h以除盡有機(jī)溶劑，加入水化液進(jìn)行水化，靜置12 h后進(jìn)行超聲破碎處理，最后依次擠壓通過(guò)0.10 μm與0.05 μm孔徑的聚碳酸酯徑跡蝕刻膜，即得PNS-TFSs。按相同處方工藝重復(fù)制備3批。

以同樣方法制備不含藥物PNS的TFSs，即得空白TFSs。

2.1.2 粒徑與ζ電位的測(cè)定 取適量PNS-TFSs樣品，以蒸餾水稀釋10倍后，在室溫下用激光散射粒度儀分別進(jìn)行粒徑與ζ電位測(cè)定。所有樣品的各項(xiàng)測(cè)定均重復(fù)3次，結(jié)果PNS-TFSs的平均粒徑為（66.92±4.34）nm，多分散指數(shù)（PDI）為0.074± 0.016，平均ζ電位為（?25.1±1.5）mV（＝3），代表性粒徑與ζ電位分布圖見(jiàn)圖1。

圖1 PNS-TFSs的粒徑(A)和ζ電位(B)分布

2.1.3 顯微形態(tài)的觀察 對(duì)PNS-TFSs樣品進(jìn)行適當(dāng)倍數(shù)稀釋?zhuān)∩倭恐糜阢~網(wǎng)正面，用濾紙吸去多余樣品液，用2%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染2 min，取出銅網(wǎng)，用濾紙吸取過(guò)多染液，將銅網(wǎng)正面朝上置于玻璃皿中，自然晾干，置于TEM下觀察并拍照。結(jié)果見(jiàn)圖2，樣品中的囊泡呈圓形或類(lèi)圓形，大小及分布較均勻，粒子之間未見(jiàn)黏連與聚集現(xiàn)象。

圖2 PNS-TFSs的TEM圖

2.2 PNS-TFSs制劑中5種皂苷類(lèi)成分含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil Gold C18柱（100 mm×2.0 mm，1.9 μm）；流動(dòng)相為乙腈-水，梯度洗脫：0～2 min，19%乙腈；2～12 min，19%～22%乙腈；12～12.1 min，22%～40%乙腈；12.1～17.4 min，40%～45%乙腈；17.4～17.5 min，45%～19%乙腈；體積流量為0.22 mL/min；進(jìn)樣量為2.5 μL；柱溫為28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為203 nm。

2.2.2 混合對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備 分別精密稱(chēng)取NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd對(duì)照品適量，置于10 mL量瓶中，加入甲醇溶解并定容，搖勻，即得含5種成分的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，各成分質(zhì)量濃度依次為0.505、0.498、0.504、0.499、0.500 mg/mL。

2.2.3 供試品溶液的制備 精密量取PNS-TFSs 1 mL，置于10 mL量瓶中，加入適量甲醇，用超聲波清洗器浴式超聲（功率200 W、頻率40 kHz）處理2 min，以甲醇定容，搖勻，用0.22 μm的有機(jī)相過(guò)濾膜濾過(guò)，即得供試品溶液。

2.2.4 色譜峰的專(zhuān)屬性 分別取空白TFSs與PNS- TFSs樣品，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行處理，得空白TFSs與PNS-TFSs的供試品溶液；精密稱(chēng)取PNS 9.50 mg，按“2.2.2”項(xiàng)下從“置于10 mL量瓶中”開(kāi)始進(jìn)行配液，得PNS供試品溶液；另取“2.2.2”項(xiàng)下制備的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，得混合對(duì)照品供試品溶液。按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別分析以上4份供試品溶液。色譜圖見(jiàn)圖3，由圖3可以看出，NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd各成分的色譜峰峰形良好，分離度（≥1.5）良好，空白傳遞體中的組分對(duì)各成分的色譜峰均無(wú)干擾。

2.2.5 線性關(guān)系考察 吸取“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇逐級(jí)稀釋成不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液系列，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別分析，記錄峰面積，以峰面積（）為縱坐標(biāo)、各對(duì)照品質(zhì)量濃度（）為橫坐標(biāo)作圖，并進(jìn)行線性回歸，得回歸方程依次為NGR1＝2.78－1.49（＝0.999 9，＝8）、GRg1＝3.21－1.92（＝0.999 8，＝8）、GRe＝3.30－2.56（＝0.999 8，＝8）、GRb1＝2.73－1.33（＝0.999 7，＝8）與GRd＝3.47－3.04（＝0.999 7，＝8），結(jié)果表明，NGR1、GRg1、GRe、GRb1、GRd分別在4.04～505.00、3.98～498.00、4.03～504.00、3.99～499.00、4.00～500.00 μg/mL呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn) 在1 d內(nèi)，分別取高、中、低3種質(zhì)量濃度（200、20、10 μg/mL，按GRd計(jì)）的混合對(duì)照品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，分別連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，分別計(jì)算各成分在不同質(zhì)量濃度下的RSD，以示日內(nèi)精密度；在連續(xù)5 d內(nèi)，高、中、低3種質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液分別各進(jìn)1次，記錄峰面積，分別計(jì)算各成分在各質(zhì)量濃度下的RSD，以示日間精密度。結(jié)果見(jiàn)表1，NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd的RSD均小于3.0%，精密度符合要求。

1-NGR1 2-GRg1 3-GRe 4-GRb1 5-GRd

2.2.7 回收率試驗(yàn) 精密量取空白TFSs樣品9份，每份1 mL，分別精密加入高、中、低（分別為1 mL樣品中各成分含量的80%、100%、120%[11]）3種不同質(zhì)量的各測(cè)定成分對(duì)照品，各個(gè)質(zhì)量分別平行3份，均按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，按“2.2.5”項(xiàng)下標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，測(cè)得量相對(duì)于加入量的百分比為回收率，結(jié)果見(jiàn)表2，可見(jiàn)，該方法準(zhǔn)確度良好。

表1 NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd精密度試驗(yàn)結(jié)果

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取PNS-TFSs樣品1份，按照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，置于室溫下，分別在0、1、2、3、4、8、12 h，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，記錄各成分峰面積，分別計(jì)算NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd在不同時(shí)間點(diǎn)的RSD，結(jié)果依次為0.6%、0.9%、0.4%、0.7%、0.6%，結(jié)果表明供試品溶液中各待測(cè)成分在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

表2 NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd回收率試驗(yàn)結(jié)果 (, n = 3)

Table 2 Results of recovery test with NGR1, GRg1, GRe, GRb1 and GRd (, n = 3)

表2 NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd回收率試驗(yàn)結(jié)果 (, n = 3)

加樣水平回收率/% NGR1GRg1GReGRb1GRd 低102.1±1.4102.2±1.9102.5±1.6103.5±1.099.5±1.2 中101.4±1.7101.8±2.199.8±1.0102.0±0.9101.0±1.1 高99.1±1.499.1±1.498.4±1.398.0±1.698.1±1.4

2.2.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取“2.1.1”項(xiàng)下PNS-TFSs混懸液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，平行6份，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，按照“2.2.5”項(xiàng)下回歸方程進(jìn)行定量測(cè)定。測(cè)得NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd各成分質(zhì)量濃度的RSD分別為0.6%、0.5%、1.0%、0.5%、1.6%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.10 PNS-TFSs中三七皂苷成分的含量測(cè)定 取“2.1.1”項(xiàng)下PNS-TFSs混懸液，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，按照“2.2.5”項(xiàng)下回歸方程進(jìn)行定量，平行3份。計(jì)算得各成分的質(zhì)量濃度，結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3 包封率的測(cè)定

2.3.1 離心超濾法測(cè)定PNS-TFSs的包封率 取“2.1.1”項(xiàng)下PNS-TFSs混懸液樣品，搖勻，取少量于光學(xué)顯微鏡下觀察，確認(rèn)其中不含藥物結(jié)晶后精密量取100 μL，置于離心超濾管內(nèi)，進(jìn)行冷凍離心（離心力10 000×，溫度4 ℃），收集全部外水相，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)得PNS中各種成分的峰面積分別代入“2.2.5”項(xiàng)下的各種成分回歸方程以計(jì)算外水相中藥物含量；另外，取等量樣品，按“2.2.9”項(xiàng)下測(cè)定樣品中各成分的含量，并按下式計(jì)算包封率。

表3 PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd含量的測(cè)定結(jié)果(, n = 3)

Table 3 Content determination of NGR1, GRg1, GRe, GRb1 and GRd in PNS-TFSs (, n = 3)

表3 PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd含量的測(cè)定結(jié)果(, n = 3)

樣品質(zhì)量濃度/(mg?mL?1) NGR1GRg1GReGRb1GRd 10.098±0.0010.381±0.0020.042±0.0010.318±0.0020.076±0.001 20.097±0.0020.378±0.0010.043±0.0060.320±0.0070.078±0.003 30.099±0.0130.379±0.0050.041±0.0040.319±0.0190.075±0.006

包封率＝(s－EA)/s

s為取樣量樣品中各成分的質(zhì)量EA為取樣量樣品外水相中各成分的質(zhì)量

2.3.2 超濾濾出液中的脂質(zhì)體監(jiān)測(cè) 采用2種方法監(jiān)測(cè)濾出液中脂質(zhì)體是否存在。①紫外分光光度法測(cè)定450 nm處樣品濁度；②光學(xué)顯微鏡觀察。其中，測(cè)定450 nm處樣品濁度時(shí)，合并多份濾出液以滿足測(cè)定體積要求。結(jié)果表明，濾出液中無(wú)脂質(zhì)體存在。

2.3.3 超濾膜對(duì)溶液中游離藥物的吸附 取混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，用PBS 5.0逐級(jí)稀釋成高、中、低3個(gè)不同質(zhì)量濃度（500、100、20 μg/mL，按GRd計(jì)）各3份，每份500 μL，按“2.3.1”項(xiàng)中條件進(jìn)行超濾，收集全部超濾液，轉(zhuǎn)移至1 mL量瓶中，以甲醇定容，搖勻，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件分別測(cè)定超濾前溶液中PNS各成分對(duì)應(yīng)的峰面積（before）與濾出液中PNS各成分對(duì)應(yīng)的峰面積（after），計(jì)算超濾膜吸附率，結(jié)果見(jiàn)表4?？梢钥闯?，超濾膜對(duì)藥物吸附較小，超濾對(duì)藥物溶液質(zhì)量濃度的影響可以忽略。

超濾膜吸附率＝(before－after)/before

2.3.4 稀釋對(duì)PNS-TFSs包封率測(cè)定結(jié)果的影響 取“2.1.1”項(xiàng)下PNS-TFSs混懸液樣品適量，分別用PBS 5.0稀釋1倍和2倍，得PNS-TFSs1/2、PNS-TFSs1/3。按“2.3.1”分別測(cè)定傳遞體PNS-TFSs、PNS- TFSs1/2、PNS-TFSs1/3的包封率，每份平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯?，稀釋1倍后傳遞體中各成分的包封率均不同程度降低，稀釋2倍使傳遞體中NGR1、GRg1、GRe的包封率均降低20%以上，而GRb1和GRd即使稀釋2倍，包封率也在80%以上，下降較少。

表4 超濾膜對(duì)高、中、低質(zhì)量濃度溶液中PNS各種成分的吸附結(jié)果(n = 3)

2.3.5 空白TFSs與PNS PBS溶液混合法制得TFSs的包封率 按如下處方（記作TFSsblank）：CH 30 mg、sbPC 120 mg、VE 2 mg、檸檬烯-檸檬醛（4∶1）混合揮發(fā)油80 mg、PBS 5.0 10 mL，以“2.1.1”項(xiàng)工藝條件薄膜分散法制備空白TFSs混懸液，將5 mL TFSsblank與20 mg/mL的PNS PBS溶液5 mL混勻，得TFSsblank+PNS。按“2.3.1”測(cè)定TFSsblank+PNS的包封率，平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表5?？梢钥闯?，TFSsblank+PNS的PNS各成分包封率均較高，只比PNS-TFSs低了不足15%。

2.3.6 PNS-TFSs包封率測(cè)定的方法重復(fù)性考察 按“2.3.1”項(xiàng)方法操作，將1份PNS-TFSs樣品平行測(cè)定6次，結(jié)果表明，NGR1、GRg1、GRe、GRb1、GRd各成分包封率的RSD分別為2.0%、0.6%、2.6%、0.1%、1.1%，說(shuō)明該方法重復(fù)性良好。

表5 稀釋對(duì)包封率測(cè)定結(jié)果的影響及空白傳遞體與PNS PBS溶液混合制得脂質(zhì)體的包封率

2.3.7 PNS-TFSs包封率的測(cè)定 按“2.3.1”項(xiàng)方法操作，將1份PNS-TFSs樣品平行測(cè)定3次，結(jié)果見(jiàn)表6。

表6 PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1與GRd包封率的測(cè)定結(jié)果

3 討論

中藥具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，意味著通過(guò)單一成分控制很難全面評(píng)價(jià)其質(zhì)量，需要對(duì)其進(jìn)行多成分同時(shí)測(cè)定，然而，定量指標(biāo)成分的增多，也相應(yīng)地增加了檢測(cè)的周期和成本[13]?！吨袊?guó)藥典》2020年版一部中以NGR1、GRg1、GRe、GRb1和GRd為PNS含量測(cè)定的指標(biāo)成分，采用HPLC法測(cè)定，需要60 min完成[14]，本課題組前期嘗試了藥典的條件，發(fā)現(xiàn)GRg1與GRe這2種成分無(wú)法達(dá)到完全分離[15]。因此，本實(shí)驗(yàn)建立了一種可一次進(jìn)樣同時(shí)測(cè)定PNS-TFSs中5種主要皂苷類(lèi)成分的UPLC方法，該方法不僅可以實(shí)現(xiàn)這5種皂苷成分的良好色譜分離，且相較于HPLC法，UPLC法測(cè)定具有分析速度快、分離效率高、準(zhǔn)確度與靈敏度高、溶劑使用少、廢液產(chǎn)生少等優(yōu)點(diǎn)[16]，可以節(jié)約經(jīng)濟(jì)成本與時(shí)間成本，同時(shí)更加環(huán)保。此外，測(cè)定結(jié)果與原料藥PNS的中各成分的含量比例基本一致，從一個(gè)方面佐證了結(jié)果合理、可信。

離心超濾法測(cè)定傳遞體包封率是將一定量傳遞體放入配有超濾膜的超濾管中，在適宜的轉(zhuǎn)速下離心一段時(shí)間，游離藥物在離心力的作用下可通過(guò)超濾膜，而傳遞體則被超濾膜截留，從而實(shí)現(xiàn)二者的分離。而后收集濾液用于測(cè)定游離藥物的量，取等量未濾過(guò)的傳遞體測(cè)定藥物總量，計(jì)算包封率[17-18]。該方法快速，易于操作，且不需要復(fù)雜的設(shè)備，與其他技術(shù)（如超速離心）相比，它只需要少量的樣品。然而，離心超濾法有一個(gè)明顯的缺點(diǎn)就是藥物可能會(huì)被吸附在超濾膜上而引起損失，從而影響測(cè)定結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)考察了超濾膜對(duì)高、中、低3個(gè)質(zhì)量濃度溶液中游離PNS各成分的吸附，發(fā)現(xiàn)超濾膜對(duì)PNS各成分吸附均較小。

其次，超濾膜的選擇對(duì)于離心超濾法測(cè)定包封率也尤為重要，因過(guò)大或過(guò)小的濾孔均無(wú)法實(shí)現(xiàn)傳遞體與游離藥物良好分離。本實(shí)驗(yàn)以離心超濾法結(jié)合UPLC法測(cè)定制劑的包封率，因PNS-TFSs平均粒徑約為67 nm，大多數(shù)皂苷成分的相對(duì)分子質(zhì)量約為1000，對(duì)應(yīng)分子尺寸為2～3 nm，故采用截留相對(duì)分子質(zhì)量10 000（對(duì)應(yīng)膜孔徑約為10 nm）的超濾膜進(jìn)行冷凍離心，使PNS-TFSs中囊泡與游離藥物實(shí)現(xiàn)分離。

為了驗(yàn)證超濾膜對(duì)于囊泡的分離效果，本實(shí)驗(yàn)考察了2種監(jiān)測(cè)濾出液中脂質(zhì)體的方法，發(fā)現(xiàn)紫外分光光度法靈敏度較高，可用于檢測(cè)；光學(xué)顯微鏡只能觀察到大的脂質(zhì)囊泡，難以觀察到一些小單室脂質(zhì)體，靈敏度欠佳，但該方法簡(jiǎn)便、快速，可用于囊泡初步監(jiān)測(cè)。此外，定磷法是通過(guò)檢測(cè)濾出液中的磷的含量來(lái)監(jiān)測(cè)濾出液中是否存在囊泡的方法，該法準(zhǔn)確、靈敏[19]，但是本研究中TFSs制備時(shí)使用了PBS作為水化液，會(huì)對(duì)本法測(cè)定產(chǎn)生影響，故未采用。

離心超濾法是一種在平衡狀態(tài)下測(cè)定傳遞體包封率的方法，為了探究藥物與囊泡相互作用和藥物泄漏行為以及非平衡狀態(tài)對(duì)于PNS-TFSs包封率測(cè)定結(jié)果是否存在影響，將PNS-TFSs進(jìn)行稀釋?zhuān)l(fā)現(xiàn)在稀釋1倍和2倍后PNS-TFSs中各成分的包封率均有所降低，但GRb1與GRd的降低程度遠(yuǎn)小于其他成分。除此以外，還發(fā)現(xiàn)空白傳遞體直接與PNS溶液混合載藥也具有較高的包封率，這可能與PNS中各成分良好的親脂性有關(guān)，這使得它們能較好地分配于雙分子層上。

為了探明傳遞體中5種皂苷的包封特性，運(yùn)用軟件（ACD/Labs 10.0）進(jìn)行了最優(yōu)構(gòu)象預(yù)測(cè)和基團(tuán)間距離的計(jì)算，這樣可以綜合分析分子間親水基團(tuán)之間的相互作用、疏水部分的相互作用與分子大小適應(yīng)性等影響因素。sbPC雙分子層的厚度約5.0 nm，5種皂苷分子均含有1個(gè)親脂部分和2個(gè)親水部分，其中NGR1、GRg1與GRe的分子優(yōu)勢(shì)構(gòu)象均呈U形，2個(gè)親水端距離2.0 nm，親脂鏈長(zhǎng)1.5 nm，故嵌入sbPC形成的雙分子層時(shí)因分子大小適應(yīng)性差使系統(tǒng)能量很高，而GRb1與GRd的分子優(yōu)勢(shì)構(gòu)象為線型，2個(gè)親水端距離3.0 nm，親脂鏈長(zhǎng)2.0 nm，嵌入磷脂雙分子層時(shí)，親脂部分大小合適，在雙分子層內(nèi)部的糖基可相互作用，體系能量降低[20]。由上述結(jié)果可知，對(duì)于相對(duì)分子質(zhì)量接近的不同皂苷分子，其優(yōu)勢(shì)構(gòu)象影響分子中親水基團(tuán)之間的距離，進(jìn)而影響分子與磷脂雙分子層的相互作用及藥物包封率，GRb1與GRd分子嵌入sbPC雙分子層產(chǎn)生的體系能量更低，表明兩者與sbPC雙分子層結(jié)合更穩(wěn)定，這就解釋了與NGR1、GRg1、GRe相比GRb1和GRd為何具有更高的包封率（＜0.01），以及稀釋后包封率變化較小的原因。

此外，還發(fā)現(xiàn)一個(gè)大致的趨勢(shì)，即UPLC色譜分析保留時(shí)間越長(zhǎng)的PNS成分，其對(duì)應(yīng)在PNS-TFSs中包封率越高，也說(shuō)明PNS成分親脂性與包封率存在一定相關(guān)性，即其親脂性越高，所對(duì)應(yīng)的包封率越高，進(jìn)一步地，可以推測(cè)PNS成分主要包封于PNS-TFSs的脂質(zhì)雙分子層中。

本研究建立了一種同時(shí)測(cè)定PNS-TFSs中NGR1、GRg1、GRe、GRb1、GRd含量的UPLC法，此法精密、準(zhǔn)確、快速，進(jìn)而以離心超濾法結(jié)合UPLC測(cè)定PNS-TFSs多成分的包封率，方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性良好，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果探討了PNS各主要成分在TFSs中的包封特性。本研究可以為單萜揮發(fā)油邊緣活化的PNS-TFSs的質(zhì)量評(píng)價(jià)與處方優(yōu)化提供參考，為其透皮研究的開(kāi)展奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Determination of contents and encapsulation efficiencies of five saponins insaponins transfersomes

FAN Yu-hang1, XU Chang1, FEI Ya-rong1, CHENG Bi-xin1, QIU Ying-kun2, ZHENG Hang-sheng1

1.School of Pharmaceutical Sciences, Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China 2.School of Pharmaceutical Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, China

To develop methods for the determination of contents and encapsulation efficiencies of five saponins insaponins (PNS) transfersomes (PNS-TFSs) and probe the drug encapsulation features.UPLC was adopted to determine the contents ofnotoginsenoside R1(NGR1), ginsenoside Rg1(GRg1), ginsenoside Re (GRe), ginsenoside Rb1(GRb1) and ginsenoside Rd (GRd) in the preparation of PNS-TFSs.An Hypersil Gold column (100 mm × 2.0 mm, 1.9 μm) was used to separate the analytes with acetonitrile-water mixture as the mobile phase in gradient elution mode, and the detection wavelength was set at 203 nm, the column temperature was 28 ℃.Encapsulation efficiencies were determined by centrifugal ultrafiltration method combined with UPLC.The specificity and resolution (≥ 1.5) of the peaks corresponding to each analyte met requirements of methodology.The calibration curves were linear (≥ 0.9997) and in the ranges of 4.04—505.00, 3.98—498.00, 4.03—504.00, 3.99—499.00, 4.00—500.00 μg/mL for NGR1, GRg1, GRe, GRb1and GRd respectively.RSD (≤ 2.4%) of repeated measurements with working solution of chemical reference substances (CRS) and recoveries (97.23%—104.50%) of the analytes from the blank transfersomes spiked with their CRS demonstrated respectively the precision and accuracy of the method.The test solutions were stable (RSD ≤ 0.90%) in 12 h.The contents of NGR1, GRg1, GRe, GRb1and GRd in the transfersomes were 98.14, 380.80, 41.68, 317.50, 75.61 μg/mL, and their encapsulation efficiencies were 75.48%, 69.68%, 69.51%, 92.35%, 95.97%, respectively.UPLC is fast, accurate, precise and applicable to the determination of the contents of NGR1, GRg1, GRe, GRb1and GRd in the transfersomes and the centrifugal ultrafiltration method coupled with UPLC is applicable to the determination of their encapsulation efficiencies.

saponins; transfersomes; UPLC; centrifugal ultrafiltration; encapsulation efficiencies; encapsulation features; notoginsenoside R1; ginsenoside Rg1; ginsenoside Re; ginsenoside Rb1; ginsenoside Rd

R283.6

A

0253 - 2670(2022)10 - 3006 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.010

2022-02-24

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82174096）；校級(jí)科研基金（國(guó)家自然科學(xué)基金預(yù)研專(zhuān)項(xiàng)）資助項(xiàng)目（2019ZG37）

范煜航，碩士研究生，研究方向?yàn)榻?jīng)皮吸收脂質(zhì)囊泡新劑型及其體內(nèi)過(guò)程。Tel: 18768131106 E-mail: fanyuhang1016@163.com

通信作者：鄭杭生，碩士生導(dǎo)師，主要從事經(jīng)皮吸收新劑型及其體內(nèi)過(guò)程研究。Tel: (0571)61768157 E-mail: hs-zheng@163.com

#共同第一作者：徐 暢，碩士研究生，研究方向?yàn)榻?jīng)皮吸收脂質(zhì)囊泡新劑型及其體內(nèi)過(guò)程。Tel: 17826865411 E-mail: xu_xile@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]