羅 璽，許小琪，劉冬榕，王 糾，韓 兵，時(shí) 軍

·藥劑與工藝·

丹參酮IIA-丹酚酸B共載脂質(zhì)體水凝膠制備及性能考察

羅 璽1，許小琪2，劉冬榕1，王 糾1，韓 兵3，時(shí) 軍1, 4*

1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006 2.汕頭市科學(xué)技術(shù)協(xié)會，廣東 汕頭 515031 3.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院整形外科醫(yī)院，北京 100144 4.廣東省局部精準(zhǔn)遞藥制劑工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510006

制備丹參酮IIA-丹酚酸B共載脂質(zhì)體水凝膠（Lip-Gel@TSA/SAB），并進(jìn)行離體皮膚滲透動(dòng)力學(xué)研究。采用薄膜分散-pH梯度法制備丹參酮IIA-丹酚酸B共載脂質(zhì)體，再進(jìn)一步負(fù)載于氧化透明質(zhì)酸/琥珀酰殼聚糖，制得水凝膠Lip-Gel@TSA/SAB，進(jìn)行掃描電子顯微鏡（SEM）表征；HE染色法研究Lip-Gel@TSA/SAB皮膚刺激性；動(dòng)態(tài)透析法研究Lip-Gel@TSA/SAB的體外釋藥規(guī)律；改良Franz擴(kuò)散池法研究Lip-Gel@TSA/SAB體外透皮滲透和真皮層滯留性能，計(jì)算并擬合藥物釋放模型。脂質(zhì)體在透射電子顯微鏡（TEM）下呈球狀或類球狀層狀囊泡結(jié)構(gòu)，平均粒徑為（189.50±1.57）nm，粒度多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）為0.246±0.030，平均ζ電位為（?18.73±1.41）mV。Lip-Gel@TSA/SAB呈橘紅色，質(zhì)地均勻，內(nèi)部為三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。體外透皮試驗(yàn)表明，TSA-SAB Lips/Gel中TSA、SAB在48 h內(nèi)單位面積累積透過量分別為（17.55±1.01）、（918.99±50.83）μg/cm2，真皮滯留量分別為（10.07±0.75）、（36.12±2.06）μg/cm2，符合Hixon-crowell方程和一級動(dòng)力學(xué)模型。Lip-Gel@TSA/SAB處方工藝合理，具有良好的透皮吸收性能和藥物真皮滯留性能。

脂質(zhì)體；水凝膠；皮膚滲透動(dòng)力學(xué)；丹參酮IIA；丹酚酸B；薄膜分散-pH梯度法；透明質(zhì)酸；琥珀酰殼聚糖；動(dòng)態(tài)透析法；透皮吸收

增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）是皮膚深度創(chuàng)傷愈合的病理性結(jié)局，成纖維細(xì)胞過度增殖或細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積形成隆起狀皮膚病變。現(xiàn)多采用手術(shù)、激光、藥物注射等治療方式，但存在高復(fù)發(fā)率、皮膚萎縮、毛細(xì)血管擴(kuò)張、局部壞死等不良反應(yīng)[1-2]。明代《證治準(zhǔn)繩瘍醫(yī)》記載，瘢痕又稱蟹足腫、黃瓜癰，病機(jī)為瘀血阻滯。丹參能“破積聚癥堅(jiān)，散癭贅惡瘡”，具有活血化瘀、涼血消癰的功效，以丹參酮IIA（tanshinone IIA，TSA）和丹酚酸B（salvianolic acid B，SAB）為代表性成分[3]?，F(xiàn)代藥理研究證明，丹參具有改善微循環(huán)、抗血栓、抗凝血、調(diào)節(jié)免疫等作用，以及顯著的抗炎、抗纖維化的效果，能夠有效防治增生性瘢痕[4]，臨床有丹參注射液、丹參川芎嗪注射液、丹參涂膜劑等運(yùn)用于HS的防治[5]。中醫(yī)藥防治HS具有安全有效的優(yōu)勢，為降低毒副作用、提高患者依從性、避免口服給藥的肝臟首過效應(yīng)，研制防治HS的經(jīng)皮給藥制劑具有重大意義。

TSA具有明顯的抗肝、腎、心肌纖維化作用，SAB能夠有效抑制成纖維細(xì)胞增殖及膠原合成，在防治HS方面具有廣闊的應(yīng)用前景。Chen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，TSA能阻斷細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞早期凋亡，降低凋亡抑制基因（survivin）蛋白的表達(dá)，從而治療皮膚纖維化疾病。Liu等[4]發(fā)現(xiàn)，SAB能夠減輕博萊霉素誘導(dǎo)的小鼠皮膚纖維化程度，其機(jī)制可能與抑制轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming factor-β1，TGF-β1）/SMAD、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular regulated protein kinases，ERK）信號通路有關(guān)。Peng等[7]通過建立結(jié)腸炎小鼠模型觀察到丹參莖葉總酚酸與丹參酮聯(lián)用時(shí)對結(jié)腸炎具有協(xié)同治療作用，聯(lián)合給藥藥效優(yōu)于單獨(dú)給藥。因此，本研究擬構(gòu)建丹參酮IIA-丹酚酸B共載脂質(zhì)體水凝膠（Lip-Gel@TSA/SAB），為活血化瘀中藥的納米透皮制劑提供新的研究思路。

1 儀器與材料

1.1 儀器

UltiMate 3000高效液相色譜儀系統(tǒng)，賽默飛世爾科技公司；LF-50型脂質(zhì)體擠出儀，加拿大Avestin公司；NK200-1B型可視孔氮吹儀，杭州米歐儀器有限公司；JY 96-IIN型超聲波細(xì)胞破碎機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SHA-B水浴恒溫振蕩器，上海力辰邦西儀器科技有限公司；Olympus CKX41型倒置式生物顯微鏡，北京中儀光科科技發(fā)展有限公司；TP-6型透皮擴(kuò)散儀，天津市精拓儀器科技有限公司；FD-1-50型真空干燥機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；MS-H-Pro+型磁力攪拌器，美國賽洛捷克公司；3-30K型低溫離心機(jī)，美國Sigma-Aldrich公司；TGL-16型臺式高速冷凍離心機(jī)，湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司；JEM-2100F型透射電子顯微鏡（TEM）、JEM-1200EX型掃描電子顯微鏡（SEM），日本電子株式會社；Zetasizer Nano ZS90型馬爾文激光粒度儀，英國Malvern Panalytical儀器有限公司；IR Prestige-21型島津傅立葉變換紅外光譜儀，日本Shimadzu島津公司。

1.2 材料

TSA對照品，中國食品藥品檢定研究院，批號111562-2020012，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%；TSA原料藥（批號Y14M10C82864，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥95%）、SAB對照品（批號H16O10Y100218，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%），上海源葉生物科技有限公司；大豆卵磷脂，德國Lipoid公司，批號579010-1150055-13；膽固醇，上海艾偉特醫(yī)藥科技有限公司，批號B01221；寡聚透明質(zhì)酸，華熙生物科技股份有限公司，相對分子質(zhì)量7294，批號20070121；-琥珀酰殼聚糖（-succinyl chitosan，NSC），江蘇金殼生物醫(yī)藥科技有限公司，取代度81.3%，黏度62 mPa·s，批號201201；其余試劑均為分析純。

1.3 動(dòng)物

SPF級健康SD大鼠，雌雄各半，體質(zhì)量200～250 g，合格證號為SCXK（粵）2019-0041；普通級健康新西蘭兔，雌雄各半，體質(zhì)量1.5～2.2 kg，合格證號為SCXK（粵）2019-0015。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循廣東藥科大學(xué)試驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會有關(guān)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用的規(guī)定，均符合3R原則。

2 方法與結(jié)果

2.1 Lip-Gel@TSA/SAB的制備

2.1.1 TSA-SAB脂質(zhì)體的制備 精密稱取處方量的磷脂、膽固醇、TSA（物質(zhì)的量比100∶46∶3）共溶于10 mL二氯甲烷，37 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min，氮?dú)獯蹈桑? mL去離子水后常壓孵育30 min，冰浴條件下用探頭超聲（100 W、超聲1 s，間隔1 s）5 min；將12 mg SAB溶于3 mL 1%甘氨酸-鹽酸緩沖溶液，加入上述溶液中，繼續(xù)孵育30 min，過0.8 μm微孔濾膜，400 nm脂質(zhì)體擠出儀來回?cái)D出20次整粒，得TSA-SAB脂質(zhì)體（TSA-SAB Lips）。再加入9.0%蔗糖混合均勻，冷凍干燥24 h，得TSA-SAB脂質(zhì)體凍干粉。

2.1.2 Lip-Gel@TSA/SAB的制備 制備氧化透明質(zhì)酸（oxidized hyaluronic acid，OHA）[8]并用鹽酸羥胺滴定法測定OHA樣品中的氧化程度（OD）。精密稱取0.1 g OHA于25 mL 0.25 mol/mL的鹽酸羥胺-0.05%甲基橙溶液中，用0.1 mol/mL的NaOH溶液作為滴定液，當(dāng)體系溶液由紅色變?yōu)辄S色時(shí)即到達(dá)滴定終點(diǎn)，記錄NaOH的消耗量。按公式（1）計(jì)算OD分別為（42.39±2.22）%、（49.18±1.62）%、（61.42±1.36）%，記為OHA40、OHA50、OHA60；將20 mg/mL的OHA溶液緩慢加入于150 mg/mL的NSC溶液中，兩者質(zhì)量比為1∶1，攪拌均勻，即得空白水凝膠（OHA/NSC）。將TSA-SAB脂質(zhì)體凍干粉（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%）復(fù)溶于20 mg/mL OHA溶液中，加至150 mg/mL NSC，攪拌均勻，即得Lip-Gel@TSA/ SAB，如圖1所示。

圖1 Lip-Gel@TSA/SAB的制備

OD＝NaOHHA/2HA（1）

NaOH為NaOH濃度，為NaOH的消耗量，HA為透明質(zhì)酸相對分子質(zhì)量，HA為透明質(zhì)酸質(zhì)量

2.2 Lip-Gel@TSA/SAB的基礎(chǔ)性能表征

2.2.1 脂質(zhì)體表征 采用低速離心法測定脂質(zhì)體中TSA的包封率[9]，將TSA-SAB Lips 2000 r/min（離心半徑6.3 cm）離心5 min，取上清，甲醇稀釋10倍并超聲破乳，HPLC法測定TSA質(zhì)量濃度為1；另取TSA-SAB Lips甲醇稀釋10倍并超聲破乳，HPLC法測定TSA質(zhì)量濃度為2。根據(jù)公式（2），計(jì)算得TSA的包封率為（87.93±0.97）%。

TSA包封率＝1/2（2）

采用高速離心-超濾法測定脂質(zhì)體中SAB的包封率[10]，將TSA-SAB Lips 15 000 r/min（離心半徑9.98 cm）離心30 min，取上清，截留相對分子質(zhì)量100 000超濾管10 000 r/min（離心半徑9.98 cm）離心15 min，收集濾過液，HPLC法測定游離SAB質(zhì)量濃度為3；取TSA-SAB Lips甲醇稀釋10倍并超聲破乳，HPLC法測定稀釋前SAB質(zhì)量濃度為4。根據(jù)公式（3），計(jì)算得SAB的包封率為（91.20±0.47）%。

SAB包封率＝(4－3)/4（3）

用去離子水復(fù)溶TSA-SAB Lips凍干粉，觀察脂質(zhì)體復(fù)溶液；將脂質(zhì)體復(fù)溶液滴至銅網(wǎng)上，滴加2%磷鎢酸溶液進(jìn)行負(fù)染，自然干燥后，利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察其形貌特征；利用馬爾文激光粒度儀測定其平均粒徑、粒度多分散系數(shù)（polydispersity index，PDI）和ζ電位。如圖2所示，TSA-SAB Lips呈淺肉橘色，稀釋后可觀察到明顯的淡藍(lán)色乳光，TEM下呈球狀或類球狀層狀囊泡結(jié)構(gòu)；平均粒徑為（189.50±1.57）nm（＝3），PDI為0.246±0.030（＝3），平均ζ電位為（?18.73±1.41）mV（＝3）。

2.2.2 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）分析 采用溴化鉀壓片法制備不同氧化程度的OHA、NSC和OHA/NSC樣品。掃描范圍為500～4000 cm?1，掃描速度為0.2 cm/s，分辨率為4 cm?1。如圖3所示，與HA相比，OHA在1739 cm?1處出現(xiàn)醛基伸縮振動(dòng)吸收峰（-C＝O），且強(qiáng)度隨著氧化程度增加而增大，表明OHA制備成功。與OHA和NSC相比，OHA/ NSC在1645 cm?1處出現(xiàn)亞胺鍵伸縮振動(dòng)吸收峰 （-C＝N-），且未見明顯的醛基吸收峰，表明OHA的醛基與NSC的氨基之間發(fā)生席夫堿反應(yīng)，OHA/ NSC制備成功。

2.2.3 SEM分析 將OHA/NSC經(jīng)液氮驟冷后真空冷凍干燥，切開，對斷面進(jìn)行噴金處理，利用SEM觀察內(nèi)部微觀形貌。如圖4所示，OHA/NSC內(nèi)部為疏松海綿狀多孔材料，隨著OHA氧化程度增大，交聯(lián)度變高，孔徑變小，形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)致密。

2.2.4 基礎(chǔ)性能特征 系列OHA/NSC pH值分別為6.28±0.04、6.59±0.12、6.89±0.23。將OHA/NSC 0.4 g倒置傾斜30 s不流動(dòng)，記錄成膠時(shí)間，為（77±5）s；將0.2 g凍干OHA/NSC浸沒于蒸餾水中，定時(shí)取出稱定質(zhì)量，直至樣品質(zhì)量不再增加，按公式（4）計(jì)算平衡溶脹率；將2 g OHA/NSC放入溫度（30.0±0.5）℃、相對濕度（50±5）%的藥品穩(wěn)定性試驗(yàn)箱中，定時(shí)取出稱定質(zhì)量，至質(zhì)量不再減少，按公式（5）計(jì)算保濕率；將不同顏色的OHA/NSC切開，并重新拼接[11]，自愈合能力良好；將OHA/ NSC置于不同材料（玻璃板、丁腈手套、人體皮膚）表面均能良好黏附；將OHA/NSC通過26 G針頭注射，通針性良好，結(jié)果如表1和圖5所示。

A-復(fù)溶前后整體外觀 B-TEM C-丁達(dá)爾效應(yīng) D-粒徑 E-ζ電位

a-HA b-OHA40 c-OHA50 d-OHA60 e-NSC f-OHA40/NSC g-OHA50/NSC h-OHA60/NSC

平衡溶脹率＝(2－1)/1（4）

保濕率＝1－(4－3)/3（5）

1為凍干水凝膠質(zhì)量，2為溶脹過程中水凝膠質(zhì)量，3為初始水凝膠質(zhì)量，4為試驗(yàn)過程中水凝膠質(zhì)量

圖4 OHA/NSC的SEM表征(×200)

表1 OHA/NSC的性能特征 (, n = 3)

Table 1 Properties of OHA/NSC (, n = 3)

表1 OHA/NSC的性能特征 (, n = 3)

OHA/NSC成膠時(shí)間/s平衡溶脹率/%保濕率/% OHA40/NSC91.00±7.35836.70±15.6885.99±3.62 OHA50/NSC74.33±4.08781.57±12.3783.44±6.01 OHA60/NSC49.83±2.99710.85±16.6486.31±3.91

2.2.5 Lip-Gel@TSA/SAB的表征 稱取適量Lip-Gel@TSA/SAB，甲醇溶解，超聲20 min，過0.22 μm微孔濾膜，HPLC法測得TSA質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（0.98±0.27）mg/g（＝3），SAB質(zhì)量分?jǐn)?shù)為（8.37±0.70）mg/g（＝3），平均總載藥量為（8.80±0.52）%（＝3）；將處方量擴(kuò)大5倍后，測得TSA的包封率為（86.60±2.39）%（＝3），SAB的包封率為（90.61±1.01）%（＝3），平均總載藥量為（8.74±0.91）%（＝3）。

圖5 OHA/NSC水凝膠的性能表征

觀察Lip-Gel@TSA/SAB整體形狀并進(jìn)行SEM分析，結(jié)果如圖6所示，Lip-Gel@TSA/SAB呈橘紅色，質(zhì)地均勻，內(nèi)部為三維多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，斷面可見散在脂質(zhì)體球狀顆粒；將Lip-Gel@TSA/SAB置于不同材料（玻璃板、丁腈手套、人體皮膚）表面，具有良好黏附性。

2.3 體外透皮吸收實(shí)驗(yàn)

取SD大鼠進(jìn)行脫毛處理，處死后剝?nèi)「共科つw并去除皮下脂肪等其他組織，將皮膚固定于Franz擴(kuò)散池的供給室和接收室之間，角質(zhì)層朝向供給室，接收介質(zhì)溶液為無水乙醇-PEG400-生理鹽水（5∶2∶3），37 ℃、350 r/min進(jìn)行試驗(yàn)；將TSA和SAB溶于20 mg/mL OHA溶液中，加至150 mg/mL NSC，攪拌均勻，得TSA-SAB水凝膠（TSA-SAB Gel）；分別在供給室中加入0.5 g TSA-SAB Gel、Lip-Gel@ TSA/SAB，于0、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36、48 h分別取樣5 mL，并補(bǔ)加等量接收介質(zhì)，氮?dú)獯蹈桑状紡?fù)溶，HPLC法測定SAB、TSA的質(zhì)量濃度，按公式（6）計(jì)算單位面積累積透過量（Q）。

Q＝(CV＋CV)/（6）

Q為時(shí)間點(diǎn)單位面積累積透過量；C為第個(gè)取樣點(diǎn)所取樣品中藥物的質(zhì)量濃度；C為第（＝－1）個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取樣品中藥物的質(zhì)量濃度；為接收池體積體積（15 mL）；V為取樣體積；為擴(kuò)散池有效接觸面積（1.766 cm2）；0為供給室初始濃度；為模擬方程直線部分的斜率

以為橫坐標(biāo)，Q為縱坐標(biāo)，繪制-曲線并進(jìn)行模型擬合。如圖7所示，Lip-Gel@TSA/SAB中TSA在48 h內(nèi)的Q為（17.55±1.01）μg/cm2（＝3），為0.200 μg/(cm2·h)，＝?1.044＋0.941－0.0192＋0.000 23（2＝0.966 5）；SAB在48 h內(nèi)的Q為（918.99±50.83）μg/cm2（＝3），為0.214 μg/(cm2·h)，＝?49.444＋74.392－2.2532＋0.0233（2＝0.979 3），透皮釋放過程均符合Hixson-Crowell方程，為溶蝕與一級動(dòng)力學(xué)釋藥的作用過程。

2.3.1 皮膚刺激性 取新西蘭兔背部皮膚進(jìn)行脫毛處理，隨機(jī)分為對照組（生理鹽水）、陽性對照組（15 mg/mL甲醛水溶液）、free TSA-SAB組（TSA-SAB物理混合）、TSA-SAB Lips組和Lip-Gel@TSA/SAB組，每組3只，24 h后給藥，每天1次，連續(xù)7 d，記錄受試部位皮膚情況；7 d后處死并取受試部位皮膚進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察皮膚情況。甲醛水溶液組皮膚紅腫并伴有紅斑，其余給藥組均未出現(xiàn)異常癥狀。

A-整體性狀 B-SEM（×200），紅點(diǎn)為脂質(zhì)體顆粒 C-黏附性

圖7 Lip-Gel@TSA/SAB透皮吸收曲線(, n = 3)

如圖8所示，甲醛水溶液組皮膚結(jié)構(gòu)表皮受損，真皮組織處可見大量炎性細(xì)胞浸潤，膠原纖維排列紊亂，皮下組織輕中度水腫；對照組和free TSA/SAB組的兔子皮膚結(jié)構(gòu)完整，角質(zhì)層無破損，基底膜內(nèi)側(cè)細(xì)胞排列整齊緊密；TSA-SAB Lips組和Lip-Gel@ TSA/SAB組均可見皮膚組織結(jié)構(gòu)表皮細(xì)胞無序排列，真皮組織處無炎性細(xì)胞浸潤，皮下組織棘層細(xì)胞和表皮形成細(xì)胞小水腫，細(xì)胞間隙增大，提示脂質(zhì)體凝膠可增加角質(zhì)層細(xì)胞間隙，改變角質(zhì)層結(jié)構(gòu)或加強(qiáng)角質(zhì)層水合作用從而影響角質(zhì)層屏障，增強(qiáng)皮膚滲透性。其中，皮下組織棘層細(xì)胞和表皮形成細(xì)胞小水腫如圖TSA-SAB Lips組、Lip-Gel@TSA/ SAB組所示，皮膚結(jié)構(gòu)表皮受損、炎性細(xì)胞浸潤如圖陽性對照組所示。

2.3.2 體外釋藥試驗(yàn) 將Lip-Gel@TSA/SAB 0.5 mL置于透析袋（截留相對分子質(zhì)量14 000）內(nèi)，加入1 mL釋放介質(zhì)（含1%十二烷基硫酸鈉的0.9% NaCl溶液），再放入50 mL釋放介質(zhì)中，37 ℃、100 r/min水浴振搖，于0、0.5、1、2、4、6、8、10、12、24、30、36 h分別取樣1 mL，并補(bǔ)加等量釋放介質(zhì)，HPLC法測定TSA的質(zhì)量濃度。另取質(zhì)量濃度相等的TSA溶液、TSA-SAB Lips和TSA-SAB Gel，同上述實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行測定。

圖8 皮膚組織HE染色切片(×400)

SAB體外釋藥試驗(yàn)的釋放介質(zhì)為0.9% NaCl溶液，操作同上，測定相同質(zhì)量濃度的SAB溶液、TSA-SAB Lips、TSA-SAB/Gel和Lip-Gel@TSA/SAB中SAB的質(zhì)量濃度。按公式（7）計(jì)算體外釋藥累積釋放率，以取樣時(shí)間點(diǎn)（）為橫坐標(biāo)，累積釋放率（Q）為縱坐標(biāo)，繪制-曲線并進(jìn)行模型擬合。如圖9所示，Lip-Gel@TSA/SAB中TSA 36 h累積釋放率48.63%，＝3.992＋6.072－0.2362＋0.0033，2＝0.988 1；Lip-Gel@TSA/SAB中SAB 24 h累積釋放率61.65%，＝?0.402＋8.943－0.4002＋0.0063，2＝0.989 1，體外釋藥模型均符合Hixon-Crowell和一級動(dòng)力學(xué)模型，即其釋放行為遵循溶蝕、擴(kuò)散和動(dòng)力學(xué)過程。

圖9 Lip-Gel@TSA/SAB體外釋藥曲線(, n = 3)

Q＝(CV＋CV)/（7）

C為第個(gè)取樣點(diǎn)所取樣品中藥物的質(zhì)量濃度；為釋放介質(zhì)總體積；C為第個(gè)時(shí)間點(diǎn)所取樣品中藥物的濃度；V為取樣體積；為初始加入透析袋內(nèi)樣品所含藥物總量；Q為時(shí)間點(diǎn)的體外釋藥累積釋放率

2.3.3 真皮滯留量 透皮試驗(yàn)結(jié)束后，用生理鹽水洗凈離體皮膚，研磨成漿，甲醇溶解，超聲20 min，3500 r/min（離心半徑6.3 cm）離心10 min，取上清液，濾過，HPLC法測定TSA、SAB含量，計(jì)算真皮皮膚滯留量。TSA-SAB/Gel中TSA和SAB的真皮滯留量分別為（5.15±0.22）、（23.84±3.85）μg/cm2（＝3）；Lip-Gel@TSA/SAB中為（10.07±0.75）、（36.12±2.06）μg/cm2（＝3）。Lip-Gel@TSA/SAB中真皮滯留量均高于TSA-SAB/Gel，表明Lip-Gel@ TSA/SAB在皮膚真皮組織蓄積，形成藥物貯庫，緩慢持續(xù)釋放藥物。

3 討論

TSA具有顯著的抗纖維化、抗炎、促進(jìn)血液循環(huán)、改善機(jī)體免疫力等作用，SAB能夠抑制成纖維細(xì)胞增殖、抗內(nèi)皮細(xì)胞過度分化、減少炎癥反應(yīng)[4]，在防治HS方面具有廣闊的應(yīng)用前景。然而，TSA透皮性能較差，阻礙了其在皮膚制劑領(lǐng)域中的應(yīng)用。脂質(zhì)體為雙分子層結(jié)構(gòu)，具有高度組織相容性和細(xì)胞親和力，利用其結(jié)構(gòu)特性同時(shí)搭載TSA、SAB 2種不同極性的藥物。

脂質(zhì)體溶液皮膚附著性能較差，采用水凝膠支架，可以延長給藥時(shí)間，在真皮層形成藥物貯庫，提高生物利用度[12]。實(shí)驗(yàn)通過對不同氧化程度OHA的考察確定最佳OHA/NSC。OHA上醛基能與NSC上的氨基發(fā)生席夫堿反應(yīng)形成水凝膠，當(dāng)HA的氧化程度過低，醛基含量過少不利于形成均一的水凝膠；而當(dāng)氧化程度過高，則醛基含量過大易導(dǎo)致細(xì)胞毒性過大[13]。綜合考慮均一性和細(xì)胞毒性，確定OHA50為試驗(yàn)條件。

Dai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，TSA、SAB、丹酚酸A聯(lián)合使用可抑制檳榔提取物誘導(dǎo)的口腔黏膜纖維化，可顯著抑制小鼠口腔黏膜成纖維細(xì)胞的異常增殖和膠原沉積，抑制I型膠原（collagen type 1，COL1A1）和III型膠原（collagen type 3，COL3A1）的轉(zhuǎn)錄，通過增加基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloproteinase 2，MMP2）和MMP9的活性，降低組織金屬蛋白酶抑制因子-1（tissue specific inhibitor-1，TIMP-1）和TIMP-2的表達(dá)，改善膠原生成和代謝的平衡，抑制結(jié)締組織生長因子（connective tissue growth factor，CTGF）、TGF-β1、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因 子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等促炎、促纖維化因子的轉(zhuǎn)錄和釋放，其抗纖維化作用機(jī)制可能與抑制檳榔提取物誘導(dǎo)的蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）/ERK和TGF-β1/Smads通路有關(guān)[15]。TSA和SAB聯(lián)用可能通過調(diào)控相關(guān)MMPs和TIMPs的表達(dá)與活性，發(fā)揮抗HS作用[15-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Lip-Gel@TSA/SAB質(zhì)量穩(wěn)定，具有良好的緩釋性能，且藥物真皮滯留性能良好，有助于降低給藥頻率，提高患者順應(yīng)性[13]，后續(xù)試驗(yàn)將深入研究Lip-Gel@TSA/SAB抗瘢痕增生效果及作用機(jī)制，為制劑開發(fā)及應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and properties of tanshinone ⅡA-salvianolic acid B co-loaded liposomes hydrogel

LUO Xi1, XU Xiao-qi2, LIU Dong-rong1, WANG Jiu1, HAN Bing3, SHI Jun1, 4

1.School of Traditional Chinese Medicine, Guangdong Pharmaceutical University, Guangzhou 510006, China 2.Shantou Science and Technology Association, Shantou 515031, China 3.Plastic Surgery Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100000, China 4.Guangdong Engineering & Technology Research Center of Topical Precise Drug Delivery System, Guangzhou 510006, China

To prepare tanshinone IIA-salvianolic acid B co-loaded liposomes hydrogel (Lip-Gel@TSA/SAB) and investigate permeation kinetics of skin.Tanshinone IIA-salvianolic acid B co-loaded liposomes were prepared by thin film dispersion-pH gradient method, and then loaded on oxidized hyaluronic acid/-succinyl chitosan hydrogel to obtain Lip-Gel@TSA/SAB.SEM was used to characterize Lip-Gel@TSA/SAB.HE staining was used to study the skin irritation of Lip-Gel@TSA/SAB.Dynamic dialysis was used to study the drug release of Lip-Gel@TSA/SAB.Modified Franz diffusion cell method was used to study the transdermal penetration and dermal retention of Lip-Gel@TSA/SAB, and the drug release model was calculated and fitted.Liposomes showed a spherical or sphere-like laminar vesiclestructure under TEM with an average particle size of (189.50 ± 1.57) nm, a PDI of 0.246 ± 0.030, and an average ζ potential of (?18.73 ± 1.41) mV.Lip-Gel@TSA/SAB was orange-red with homogeneous texture and a three-dimensional porous network structure inside.The transdermal testshowed that the cumulative penetration amounts of TSA and SAB per unit area of TSA-SAB Lips/Gel within 48 h were (17.55 ± 1.01) and (918.99 ± 50.83) μg/cm2, respectively, and the dermal retention of TSA was (10.07 ± 0.75) μg/cm2while SAB was (36.12 ± 2.06) μg/cm2, which accorded with Hixon-crowell equation and first-order kinetic model.Lip-Gel@TSA/SAB preparation process is reasonable, it has good transdermal absorption, drug dermal retention and high bioavailability.

liposome; hydrogel; skin permeation kinetics;tanshinone IIA; salvianolic acid B; thin film dispersion-pH gradient method; hyaluronic acid;-succinyl chitosan; dynamic dialysis; transdermal absorption

R283.6

A

0253 - 2670(2022)10 - 2977 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.10.006

2021-11-23

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（82173982）；廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2022A1515011382）

羅 璽（1995—），女，在讀碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幹苿┭芯颗c開發(fā)。Tel: 13322910501 E-mail: 528990196@qq.com

通信作者：時(shí) 軍（1980—），男，博士，副教授，主要從事中藥經(jīng)皮給藥技術(shù)與增生性瘢痕防治研究。Tel: 13580334598 E-mail: shijun8008@163.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]