李云磊， 王昊天， 陸宇燕， 李丕鵬

(沈陽師范大學(xué)兩棲爬行動(dòng)物研究所，沈陽110034)

種群的年齡結(jié)構(gòu)主要是指種群中不同年齡組個(gè)體的組成情況，年齡結(jié)構(gòu)的類型主要分為增長(zhǎng)型、穩(wěn)定型和衰退型(Guarino & Erismis，2008)。年齡結(jié)構(gòu)不僅是種群生態(tài)學(xué)研究中的核心問題，對(duì)于兩棲動(dòng)物生理、生態(tài)甚至形態(tài)分類方面的研究均具有重要意義(Hasumi，2010)。

兩棲類動(dòng)物年齡推斷的常見方法有體長(zhǎng)計(jì)數(shù)法(Voris & Jayne，1979)、骨齡學(xué)方法(易祖盛等，2000)、標(biāo)志重捕法(Wagner.，2011)、精巢分葉法(Sinsch，2015)等。目前，公認(rèn)可靠、有效且得以廣泛使用的是骨齡學(xué)方法。

兩棲類動(dòng)物作為變溫動(dòng)物，具有冬眠的習(xí)性，其代謝功能隨季節(jié)變化。這使其骨骼生長(zhǎng)發(fā)育以及礦物質(zhì)沉積在不同季節(jié)表現(xiàn)出明顯的差異，即在生活期和冬眠期形成的骨質(zhì)環(huán)密度不同。由于物質(zhì)沉積量的差異，第一年冬眠期及其前后生長(zhǎng)緩慢階段形成的骨環(huán)(染色較深)和第二年生活期形成的骨環(huán)(染色較淺)間呈現(xiàn)出1個(gè)明暗交界的同心環(huán)帶(畢遠(yuǎn)閣等，2009)，被稱為生長(zhǎng)抑制線(line of arrested growth，LAG)，LAG的數(shù)目可間接判斷出個(gè)體年齡(易祖盛等，2000)。李文蓉等(2010)發(fā)現(xiàn)，動(dòng)物的指/趾骨與其他骨塊一樣具有良好且清晰的LAG結(jié)構(gòu)，同時(shí)剪指/趾可避免對(duì)動(dòng)物的殺戮，對(duì)動(dòng)物保護(hù)具有積極意義。該法在近10種兩棲類中被用于種群年齡結(jié)構(gòu)的鑒定和研究(Hemelaar，1985，1988；Bastien & Leclair，1992；Beebee & Denton，1993；Khonsue.，2000；Kumbar & Pancharatna，2002；李斌，2004；Liang & Lu，2006；毛敏等，2011；Bionda.，2018)。

西藏蟾蜍屬兩棲綱Amphibia無尾目Anura蟾蜍科Bufonidae蟾蜍屬，主要分布在海拔2 400～4 300 m較潮濕的高原草地或山區(qū)。目前對(duì)西藏蟾蜍的研究集中在消化系統(tǒng)(曾麟等，2011)、皮膚顯微結(jié)構(gòu)和基礎(chǔ)組織學(xué)(高鳳娟等，2016)，而其種群的年齡結(jié)構(gòu)未見報(bào)道。本研究以骨齡學(xué)方法，輔以生殖腺及組織學(xué)結(jié)構(gòu)的觀察，對(duì)分布于西藏自治區(qū)林芝市的一個(gè)西藏蟾蜍種群的年齡結(jié)構(gòu)、體長(zhǎng)、生殖腺形態(tài)和性成熟年齡等進(jìn)行了探討，旨在積累更多生物學(xué)資料，為今后該物種的保護(hù)工作奠定基礎(chǔ)。

1 研究材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

西藏蟾蜍為沈陽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院兩棲爬行動(dòng)物標(biāo)本室福爾馬林固定標(biāo)本，共計(jì)63只(♀29只，34只)，采自西藏自治區(qū)林芝市(94°56′～94°58′E，29°14′～29°17′N，海拔2 900 m)，采集時(shí)間主要為2014年、2015年7月28日—8月 2日(當(dāng)?shù)匚鞑伢蛤艿姆敝臣竟?jié))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

標(biāo)本流水沖洗過夜，利用賽多利斯電子天平(Mettler Toledo Q/OAFA02-2009，上海精密科學(xué)儀器有限公司天平儀器廠)稱量體質(zhì)量(精度0.001 g)，稱量前利用吸水紙吸干標(biāo)本體表液體。利用電子數(shù)顯游標(biāo)卡尺(哈爾濱量具廠，GB/T 14899-94)測(cè)量體長(zhǎng)(吻端到泄殖腔距離，SVL；精度0.01 mm)。成年個(gè)體依據(jù)是否有婚墊區(qū)分性別，對(duì)婚墊不明顯個(gè)體則解剖辨別生殖腺確定性別，生殖腺稱重(精度0.001 g)。

取第三指骨和生殖腺流水沖洗過夜(指骨先在5%硝酸溶液中脫鈣，直至軟化)，常規(guī)石蠟切片，指骨切片厚度10 μm，生殖腺切片厚度7 μm，HE染色。利用Olympus BX-51顯微鏡觀察，Olympus DP70拍照。

1.3 骨齡計(jì)數(shù)標(biāo)準(zhǔn)

為了保證年齡估計(jì)的準(zhǔn)確性，取同一指骨不同位置的8～10個(gè)切片進(jìn)行LAG計(jì)數(shù)，由于所用標(biāo)本均在繁殖期前后捕獲，故當(dāng)年的LAG還沒有完全形成，因此在計(jì)數(shù)過程中將骨組織切片的最外緣(當(dāng)年生活期形成的骨質(zhì)環(huán))也算作1條LAG(馬小艷，2009)。為了降低誤差，由2位獨(dú)立觀察者分別進(jìn)行LAG數(shù)目的統(tǒng)計(jì)。

1.4 LAG間距離測(cè)量

利用Image-Pro Plus 6.0測(cè)量相鄰2條LAG之間的距離(Hemelaar，1985；易祖盛等，2000)，同一指骨隨機(jī)選取8～10個(gè)不同部位進(jìn)行測(cè)量：A～G分別代表1～2、2～3、3～4、4～5、5～6、6～7、7～8條 LAG之間的距離。

1.5 數(shù)據(jù)處理

1.6 計(jì)算公式

使用von Bertalanffy模型SVL=SVL(1-e-+b)建立種群生長(zhǎng)曲線，估算西藏蟾蜍的生長(zhǎng)模式(Hemelaar，1986)，生長(zhǎng)速率=dd=(S-S)(Lou.，2012)比較雌、雄性生長(zhǎng)的快慢，其中，SVL為年齡時(shí)的體長(zhǎng)，SVL為漸進(jìn)最大體長(zhǎng)，為生長(zhǎng)系數(shù)，b是常數(shù)，S是一個(gè)種群成體的最大體長(zhǎng)，S是一個(gè)種群成體的平均體長(zhǎng)。采用生殖腺系數(shù)=生殖腺質(zhì)量/體質(zhì)量×100%(劉海映等，2013)分析各個(gè)年齡段雌、雄性的生殖腺發(fā)育狀況。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 年齡鑒定及種群年齡結(jié)構(gòu)

第三指骨切片上可觀察到：中心空腔為骨髓腔，向外依次是骨質(zhì)疏松的內(nèi)骨板，大多呈裂開縫隙狀，為Kastschenko線(指內(nèi)骨板與外骨板之間有 1層缺乏骨組織細(xì)胞的、均質(zhì)的軟骨樣組織，由于制片易裂開形成縫隙)，骨質(zhì)致密為外骨板(圖1)。在外骨板上可見清晰的LAG，每一條代表經(jīng)過了 1個(gè)冬眠期，即為1齡。由于西藏蟾蜍當(dāng)年完成變態(tài)，外骨板上可見LAG數(shù)目即為個(gè)體年齡。

圖1 西藏林芝西藏蟾蜍指骨組織切片F(xiàn)ig. 1 Phalangeal section of Bufo tibetanus in Nyingchi City, Tibet

骨齡學(xué)方法可將西藏蟾蜍劃分為9個(gè)年齡組，其中，雌性的最長(zhǎng)壽命為9齡，雄性為8齡；兩性的2齡組均為個(gè)體數(shù)目最多的年齡組，其次為 3齡組、4齡組。雌性的平均年齡為(3.59±2.23)年，雄性為(3.56±1.83)年，兩性在各年齡組的數(shù)量分布上的差異不顯著(=63，=0.054，>0.05)(圖2)。隨著年齡增加，個(gè)體數(shù)逐漸減少，種群屬于增長(zhǎng)型。

圖2 西藏林芝一個(gè)西藏蟾蜍種群的年齡結(jié)構(gòu)分布Fig. 2 Age structure of one Bufo tibetanus population in Nyingchi City, Tibet

2.2 體長(zhǎng)與年齡

西藏蟾蜍雌性的平均體長(zhǎng)為46.44 mm±15.91 mm(23.96～70.61 mm)，雄性為45.06 mm±13.00 mm(23.98～64.66 mm)。各年齡組雌、雄性的平均體長(zhǎng)基本接近(表1)，無顯著差異(﹥0.05)。其中，5～9齡組由于個(gè)體數(shù)量明顯減少，甚至一個(gè)年齡組中僅有1只個(gè)體。這雖然證實(shí)了西藏蟾蜍在骨齡學(xué)上年齡組的連續(xù)性，但由于數(shù)量不符合統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，后續(xù)分析中這部分?jǐn)?shù)據(jù)僅作為參考。

表1 西藏林芝一個(gè)西藏蟾蜍種群雌雄間體長(zhǎng)的差異統(tǒng)計(jì)Table 1 Statistics of body length between male and female individuals of one Bufo tibetanus population in Nyingchi City, Tibet

雌、雄性個(gè)體的年齡與體長(zhǎng)均呈極顯著正相關(guān)(Spearman相關(guān)性檢驗(yàn)：雌性：=0.900，=29，<0.01；雄性：=0.878，=34，<0.01)。模擬兩性的生長(zhǎng)模式并建立生長(zhǎng)曲線(圖3)：雌性為SVL=74.542 0(1-e-0.300 4-0.176 1)，雄性的為SVL=63.210 3(1-e-0.377 5-0.135 4)；兩性體長(zhǎng)均隨年齡增長(zhǎng)而呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)，但雌性的生長(zhǎng)速率(3.29)大于雄性(2.65)。5齡前雌、雄性的生長(zhǎng)曲線均呈快速上升趨勢(shì)，5齡后趨于平緩，且雄性的上升趨勢(shì)明顯低于雌性。

圖3 西藏林芝市西藏蟾蜍生長(zhǎng)曲線Fig. 3 Growth curve of Bufo tibetanus by von Bertalanffy model in Nyingchi City， Tibet

2.3 性成熟年齡

雌性個(gè)體依據(jù)卵子外部形態(tài)可劃分為3類：體長(zhǎng)62.70 mm以上為性成熟個(gè)體，體腔中可見發(fā)育良好的卵巢，左右成對(duì)，體積較大，表面可見大量黑色卵粒，為尚未進(jìn)行繁殖的成熟雌性個(gè)體，還有部分個(gè)體的卵巢體積較小，卵巢呈淡黃色和黑色2個(gè)部分，在黑色部分可見飽滿的黑色卵粒，淡黃色部分未見大量成熟黑色卵粒，推測(cè)這些是已經(jīng)完成了繁殖過程，排出了大部分成熟卵粒的個(gè)體；體長(zhǎng)48.82～61.40 mm為亞成體，卵巢呈淡黃色，表面可見淡黃色顆粒結(jié)構(gòu)；體長(zhǎng)48.82 mm以下為幼體，卵巢呈淡黃色，未見明顯卵粒(圖4：A，B，C)。雄性個(gè)體均可見成對(duì)精巢，體長(zhǎng)42.40 mm以上為性成熟個(gè)體，精巢體積較大，組織切片中均可見形態(tài)較為規(guī)則的生精小管；體長(zhǎng) 35.17 mm以下為亞成體，精巢尚未完全發(fā)育(圖4：D，E，F(xiàn))。

圖4 西藏林芝一個(gè)西藏蟾蜍種群的雌、雄性生殖腺Fig. 4 Male and female gonads of one Bufo tibetanus population in Nyingchi City, Tibet

雄性生殖腺組織切片結(jié)果顯示，1齡(圖5：A)精巢中可見形態(tài)相異、胞核大小及染色不同的大量細(xì)胞，排列松散，且未見成型的生精小管；2齡(圖5：B)精巢中可見各類細(xì)胞明顯變大，有不太明顯的區(qū)域劃分，排列呈區(qū)域性的密集；3齡(圖5：C)精巢中可見明顯的管狀結(jié)構(gòu)，即已形成的生精小管，同時(shí)可見成型的精子束，但排列不是很整齊密集(圖5：D)；4齡(圖5：E，F(xiàn))精巢中可見較多含有精子的生精小管，其中可見處于不同發(fā)育階段的生精細(xì)胞和已經(jīng)成型的精子；5齡(圖5：G)精巢中可見明顯的生精小管、界膜和間質(zhì)細(xì)胞等；6齡(圖5：H)精巢中生精小管管腔明顯增大，未見正常的精子。

圖5 西藏林芝一個(gè)西藏蟾蜍種群雄性不同年齡生殖腺切片F(xiàn)ig. 5 Male gonad sections of different ages of one Bufo tibetanus population in Nyingchi City, Tibet

C明顯小于A和B，且差異顯著，但與D～G之間無顯著差異。全部個(gè)體的 B、C之間的差異顯著，少量個(gè)體(♀4只，4只)的A、B之間的差異顯著(表2)。這種現(xiàn)象提示：骨骼的生長(zhǎng)存在著不均衡性，骨質(zhì)環(huán)厚度在發(fā)育初期(3齡，完成變態(tài)后的第2～4個(gè)冬眠期)的增長(zhǎng)較快，而在 4齡(性成熟年齡)以及之后的增長(zhǎng)明顯減緩，但也存在個(gè)體差異。

表2 西藏林芝一個(gè)西藏蟾蜍種群性成熟個(gè)體生長(zhǎng)抑制線間距離顯著性分析Table 2 Significance analysis of the distance between arrested growth lines in sexually mature individuals of one Bufo tibetanus population in Nyingchi City, Tibet

雌雄兩性個(gè)體生殖腺系數(shù)均表現(xiàn)為3齡組和4齡組之間具有顯著性差異，而其他年齡組均無顯著性差異(表3)。

表3 各個(gè)年齡段雌雄西藏蟾蜍生殖腺系數(shù)差異性比較Table 3 Comparison of male and female gonad coefficient of Bufo tibetanus at different age groups

3 討論

3.1 骨齡學(xué)方法

骨齡學(xué)方法是目前鑒定兩棲爬行類動(dòng)物年齡廣泛使用的一種方法(Vences & Jovanovic，2010；Hjernquist.，2012)，但是也存在著一些干擾因素。最明顯的是雙重線，有些兩棲動(dòng)物以夏眠的方式度過酷熱缺水的夏季，此時(shí)在長(zhǎng)骨切面上將出現(xiàn)2條清晰而非?？拷念愃芁AG的結(jié)構(gòu)，即雙重線(Liang & Lu，2006)。其次是假線，又稱附加線，是由于個(gè)體受傷、或者遇到短暫的氣候劇烈變化或者食物缺乏在長(zhǎng)骨切面上的反映，一般假線僅在局部出現(xiàn)，未見其形成閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，且線條結(jié)構(gòu)不清晰(Castanet & Smirina，1990)。雙重線和假線在一定程度上均會(huì)干擾對(duì)個(gè)體年齡的準(zhǔn)確計(jì)數(shù)，出現(xiàn)高估或者低估年齡的可能(Leclair & Castanet，1987)。第三是由于骨內(nèi)膜的重吸收導(dǎo)致1齡線被局部損壞的現(xiàn)象，但很少涉及到2齡線(Hemelaar，1980)。在長(zhǎng)骨切片結(jié)構(gòu)完整時(shí)，并不會(huì)影響LAG計(jì)數(shù)。

本研究中有5%的個(gè)體指骨切片存在雙重線現(xiàn)象，僅1只個(gè)體指骨切片上觀察到骨內(nèi)膜的重吸收現(xiàn)象，但最內(nèi)圈1齡線并未被完全吸收，可以清晰識(shí)別。假線或LAG模糊不清等現(xiàn)象均未觀察到。因此，鑒定生活于高海拔地區(qū)的西藏蟾蜍種群年齡時(shí)，骨齡學(xué)方法是有效、可靠的。

3.2 西藏蟾蜍的性成熟年齡

兩棲動(dòng)物達(dá)到性成熟年齡的時(shí)間是影響兩棲類動(dòng)物種群生態(tài)學(xué)的重要因素之一，而決定性因素是動(dòng)物的生長(zhǎng)速率及性成熟時(shí)的個(gè)體大小(Ryser，1996)。研究顯示高海拔地區(qū)的物種性成熟年齡高于低海拔地區(qū)(Brockleman，1975)。Licht(1975)研究的西部多斑蛙種群中，低海拔區(qū)域的雌性1～2年即可達(dá)到性成熟，高海拔區(qū)域的雌性則需要5～6年。在對(duì)華西雨蛙川西亞種(Liao & Lu，2010a)雄性個(gè)體和岷山蟾蜍(王冬麗，2017)的研究中呈現(xiàn)了相同的規(guī)律。但也有物種性成熟年齡與海拔變化沒有明顯的相關(guān)性，Liao等(2011)發(fā)現(xiàn)中國西南部不同海拔(310 m和 880 m)的澤蛙性成熟年齡均為 1齡，不隨海拔變化而變化。而西藏蟾蜍性成熟年齡(4齡)符合高海拔物種需要更長(zhǎng)時(shí)間的生長(zhǎng)以達(dá)到滿足生殖的最小體長(zhǎng)的研究結(jié)果。

Morrison等(2004)研究發(fā)現(xiàn)，所有澳大利亞昆士蘭州的紅眼雨濱蛙種群繁殖年限(2年)與生活區(qū)域海拔(110 m/800 m)、性成熟年齡(2齡/4齡)無關(guān)，這表明盡管很多物種的性成熟年齡與海拔有關(guān)，但其潛在繁殖壽命并沒有顯著變化。在對(duì)西藏蟾蜍精巢生精小管的觀察中也發(fā)現(xiàn)，在初步性成熟的3齡，性成熟的4齡和5齡個(gè)體中，均存在著可見的成熟精子，但在6齡個(gè)體中未見成型的精子。由于個(gè)體數(shù)量的限制，還不足以判斷西藏蟾蜍的潛在繁殖壽命是否僅有2年，需要進(jìn)一步積累資料。

3.3 西藏蟾蜍壽命

分布于不同海拔的兩棲類在壽命上有明顯的差別，表現(xiàn)為高海拔個(gè)體壽命長(zhǎng)于低海拔個(gè)體(Elmberg，1991)。分布于低海拔地區(qū)的棕背蛙個(gè)體年齡為 7齡，而高海拔地區(qū)個(gè)體最大年齡可達(dá)11齡(Lai.，2005)。在對(duì)華西雨蛙(Liao & Lu，2010a)和岷山蟾蜍(陳建斌,2016)的研究中也顯示了同樣的規(guī)律。在對(duì)不同岷山蟾蜍種群研究時(shí)還發(fā)現(xiàn)，雌性壽命隨著海拔的升高而變長(zhǎng)，而雄性的壽命不受海拔的影響(王冬麗，2017)。在兩棲動(dòng)物中，雌性個(gè)體的壽命比雄性個(gè)體長(zhǎng)的現(xiàn)象普遍存在，例如雌性瓦拉鋤足蟾最長(zhǎng)壽命為10齡，而雄性為7齡(Aadreone.，2011)；雌性四川湍蛙最長(zhǎng)壽命為9齡，而雄性為7齡(Liao & Lu，2010b)。本研究中，雌性西藏蟾蜍最長(zhǎng)壽命為9齡，雄性為8齡，雌性的壽命長(zhǎng)于雄性?？梢娢鞑伢蛤軐儆诟邏廴后w，但由于樣本量的限制，有待后續(xù)的積累。

3.4 年齡結(jié)構(gòu)

年齡結(jié)構(gòu)作為種群生態(tài)學(xué)研究的重點(diǎn)問題，學(xué)者們進(jìn)行了較為廣泛的研究，積累了豐富的資料，研究結(jié)果顯示秦嶺雨蛙(任楨，2015)、隆肛蛙和倭蛙(鮮盼盼，2017)等的年齡結(jié)構(gòu)屬于增長(zhǎng)型，花背蟾蜍、黑斑側(cè)褶蛙、合征姬蛙屬于穩(wěn)定型，而分布在太白山地區(qū)的中國林蛙則為衰退型(鮮盼盼，2017)。本研究所涉及的林芝市西藏蟾蜍種群在被采集的2014—2015年的年齡結(jié)構(gòu)屬于增長(zhǎng)型，說明該種群具有健康發(fā)展?jié)撃堋１狙芯拷Y(jié)果豐富了西藏蟾蜍部分種群特征的生物學(xué)信息，為進(jìn)一步全面深入了解西藏蟾蜍提供了可靠的依據(jù)。