汪潔 楊彩鳳 吳亞凡 趙濤

(1.保定市第二中心醫(yī)院產(chǎn)科，河北 保定 072750；2.石家莊市第一醫(yī)院婦科，河北 石家莊 050011)

子宮內(nèi)膜癌(Endometrial carcinoma，EC)是女性常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，多發(fā)生于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性[1]。長期大劑量應(yīng)用孕激素，是EC的一種保守治療法，但并非所有患者對孕激素長期治療都有良好反應(yīng)，部分患者出現(xiàn)孕激素不敏感或耐藥，限制其臨床應(yīng)用[2]。姜黃素是一種從姜黃類植物根莖中提取的植物多酚，具有誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和侵襲的作用[3-4]。此外，研究表明，姜黃素可提高胰腺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌細胞對藥物的敏感性[5-7]。Notch1信號通路參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展，如抑制結(jié)腸癌、前列腺癌細胞的增殖和浸潤[8-9]，此外，Notch信號通路激活降低惡性膠質(zhì)細胞瘤對替莫唑胺的耐藥性[10]，原蘇木素A激活Notch1信號通路增強前列腺癌細胞放療敏感性[11]。目前，關(guān)于姜黃素是否具有調(diào)節(jié)Notch1信號通路，逆轉(zhuǎn)EC耐藥性需要做進一步探討。因此，本研究建立EC孕激素耐藥細胞株(ISH/MPA)，探討姜黃素能否逆轉(zhuǎn)其耐藥性，為臨床治療EC提供實驗參考。

1 材料與方法

1.1 細胞系 人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa(ISH)，購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2 試劑與儀器 醋酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate，MPA)、MTT試劑盒、Notch1激動劑NSC 22423購自美國sigma公司；MTS試劑盒購自美國Promega公司；annexin V FITC 雙染色細胞凋亡試劑盒購自美國BD公司；GAPDH、Notch1、Jagged1、Hes-1抗體購自英國Abcam公司；HRP標記的二抗購自美國Abbkine公司；培養(yǎng)箱購自美國NAPCO公司；流式細胞儀購自美國BD公司。

1.3 子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥細胞株ISH/MPA的建立 將ISH細胞接種于DMEM培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁生長，融合度達到80%時，消化傳代，每5 d傳代一次。采用MPA濃度遞增和長期持續(xù)作用建立子宮內(nèi)膜癌孕激素耐藥細胞株ISH/MPA[12]。MPA濃度依次為1、2.5、5、7.5、10 μmol/L。待ISH細胞生長至對數(shù)期，消化傳代后培養(yǎng)，細胞貼壁生長后，更換含1 μmol/L MPA的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，48 h后更換不含MPA的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，按上述步驟依次更換含不同濃度MPA的培養(yǎng)基培養(yǎng)。以ISH細胞在含10 μmol/L MPA培養(yǎng)基中的倍增速率與在不含MPA的培養(yǎng)基中的倍增速率基本一致時，判定為耐藥細胞株ISH/MPA建立成功。

1.4 MTS法測定ISH/MPA耐藥細胞株的耐藥指數(shù) 取對數(shù)生長期的ISH細胞和ISH/MPA細胞，待細胞生長至80%融合時，重懸細胞，使細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，貼壁生長后，ISH/MPA組細胞更換含不同濃度MPA(1、2.5、5、7.5、10 μmol/L)的培養(yǎng)基培養(yǎng)，ISH組細胞更換不含MPA的培養(yǎng)基，將不同濃度MPA處理的ISH/MPA細胞分別命名為ISH/MPA-1-5組，ISH細胞作為對照組。22 h后加入20 μL MTS單溶液檢測系統(tǒng)，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h，將96孔板置于酶標儀上，波長490 nm處測得吸光度A值，計算細胞增殖抑制率，細胞增殖抑制率=(1-實驗孔A值/對照孔A值)×100%，GraphPad Prism軟件計算得出50抑制濃度(IC50)。耐藥指數(shù)=ISH/MPA耐藥細胞的IC50值/ISH細胞的IC50值。

1.5 細胞生長曲線及倍增時間 取對數(shù)生長期的ISH細胞和ISH/MPA細胞，待細胞濃度達到80%融合時，ISH組細胞用培養(yǎng)基重懸，ISH/MPA組細胞用含10 μmol/L MPA的培養(yǎng)基重懸，使細胞密度為1×105個/mL，接種于96孔板，每孔加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，從細胞貼壁起開始計時，在第1、2、3、4、5、6、7天的同一時間，將96孔板置于酶標儀上，波長490 nm處測定吸光度A值，以培養(yǎng)時間為橫坐標，吸光度A值為縱坐標，繪制生長曲線。由于MTS法測定的細胞吸光度A值與活細胞數(shù)量成正比，以改良Patterson公式計算細胞倍增時間(TD)：TD=T×lg2/(lgAt-lgA0)，A0為初始細胞吸光度，At為終末細胞吸光度，T為At-A0的時間。

1.6 MTT法檢測細胞存活率 收集對數(shù)生長期ISH/MPA細胞，重懸，使細胞濃度為1×105個/mL，接種于96孔板，待細胞貼壁生長后，加入不同濃度姜黃素(0、7.5、15、30、60 μmol/L)，姜黃素濃度為0 μmol/L作為對照組，其余不同濃度分別命名為姜黃素1～4組，24 h后，加入20 μL 5 mg/mL的MTT液，避光振蕩10 min，置于酶標儀上，測定490 nm波長處的吸光度A值。計算細胞存活率，細胞存活率(%)=實驗組A值/對照組A值×100%。選擇接近IC50的姜黃素濃度作為姜黃素干預(yù)濃度用于以下實驗。

1.7 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 ISH/MPA細胞隨機分為ISH/MPA組、姜黃素組、激動劑組、激動劑+姜黃素組。收集對數(shù)生長期ISH/MPA細胞，重懸，使細胞濃度為1×105個/mL，接種于96孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞融合度達到80%時，姜黃素組加入姜黃素30 μmol/L，激動劑組加入NSC 22423 2 μmol/L，激動劑+姜黃素組加入姜黃素30 μmol/L和NSC 22423 2 μmol/L，培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰蛋白酶消化后收集細胞，加入200 μL annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，室溫避光孵育10 min，3000 r/m離心10 min，加入190 μL annexin V-FITC結(jié)合液使細胞重懸，加入10 μL碘化丙啶，避光冰浴15 min，流式細胞儀檢測分析細胞凋亡率。

1.8 蛋白印跡法檢測Notch1，Jagged1，HES1蛋白表達 收集各組細胞，加入裂解液，室溫靜置30 min后，4℃ 12000 r/m離心10 min，BCA法測定蛋白濃度，加入蛋白上樣緩沖液，100℃煮沸10 min，使蛋白變性。上樣20 μL，120 v恒壓電泳1.5 h，電泳結(jié)束后，0.3 A恒流濕轉(zhuǎn)2 h，室溫封閉1 h，GAPDH、Notch1、Jagged1、Hes1蛋白一抗(1：1000)4℃孵育過夜，TBST洗膜3次，每次5 min，二抗(1：5000)室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。ECL法顯色。Image J軟件分析各蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值作為目的蛋白表達量。

2 結(jié)果

2.1 耐藥指數(shù)測定結(jié)果 隨MPA濃度的增加和持續(xù)作用，篩選ISH/MPA耐藥細胞株，且隨MPA濃度的增加耐藥指數(shù)逐漸增加，見表1。

表1 耐藥指數(shù)測定結(jié)果Table 1 The result of resistance index

2.2 細胞生長曲線及倍增時間 ISH組與ISH/MPA組細胞群體倍增時間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，細胞生長曲線基本一致，見表2、圖1。

表2 細胞群體倍增時間Table 2 Cell population doubling time

圖1 細胞生長曲線Figure 1 The curve of cell growth

2.3 細胞存活率檢測結(jié)果 細胞存活率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與對照組比較，姜黃素-1、2、3、4組細胞存活率降低，隨姜黃素濃度升高，細胞存活率逐漸降低(均P<0.05)。見表3。姜黃素濃度為30 μmol/L時，細胞存活率接近50%，以此作為后續(xù)實驗濃度。

表3 各組細胞存活率比較Table 3 Comparison of the cell survival rate of each group

2.4 細胞凋亡率檢測結(jié)果 細胞凋亡率組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與ISH/MPA組比較，姜黃素組細胞凋亡率升高，激動劑組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與姜黃素組比較，激動劑+姜黃素組細胞凋亡率降低(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+姜黃素組細胞凋亡率升高(P<0.05)。見表4、圖2。

表4 各組細胞凋亡率比較Table 4 Comparison of the cell apoptosis rate of each group

圖2 細胞凋亡率檢測結(jié)果Figure 2 The result of apoptosis rate of cells

2.5 Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達檢測結(jié)果 Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達組間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與ISH/MPA組比較，姜黃素組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達降低，激動劑組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達升高(P<0.05)；與姜黃素組比較，激動劑組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達升高(P<0.05)；與激動劑組比較，激動劑+姜黃素組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達降低(P<0.05)。見表5、圖3。

表5 各組細胞中Notch1、Jagged1和Hes-1蛋白表達比較Table 5 Comparison of the expression of Notch1，Jagged1 and Hes-1 protein of each group

圖3 細胞中各蛋白表達Figure 3 The expression of Notch1，Jagged1 and Hes-1 protein in cells

3 討論

EC以發(fā)生在子宮內(nèi)膜腺體上皮的腺癌最為常見，其主要臨床癥狀為子宮出血，流行病學(xué)研究認為，該病與肥胖、高血壓、糖尿病以及內(nèi)外源性雌激素和生活方式有關(guān)[13]。大劑量孕激素長期保守治療是其治療方法之一，其治療效果良好，但是治療過程中EC對孕激素的耐藥性問題顯著[14]，因此迫切需要新的有效的治療方案。

既往研究表明，孕激素能誘導(dǎo)EC癌細胞凋亡，抑制癌細胞增殖和浸潤[15-16]。但長期大劑量應(yīng)用孕激素治療EC，會出現(xiàn)一定程度的耐藥性，而導(dǎo)致治療效果不佳[17]。本研究采用MPA長期持續(xù)作用、濃度遞增的方式誘導(dǎo)EC ISH細胞，建立耐藥細胞株ISH/MPA，通過檢測各細胞系的耐藥指數(shù)和細胞群體倍增時間，判定ISH/MPA細胞是否建立成功。結(jié)果表明，不同濃度MPA處理的ISH細胞均出現(xiàn)耐藥性，而且隨MPA濃度的增加，耐藥性逐漸增強，當MPA濃度為10 μmol/L時細胞群體倍增時間接近于無MPA培養(yǎng)基培養(yǎng)的ISH細胞，所以本研究選用濃度為10 μmol/L MPA處理的細胞作為ISH/MPA耐藥細胞。姜黃素作為一種中草藥成分，具有抗氧化應(yīng)激、抗炎及抗纖維化的作用[18-20]。Mao等[21]研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過誘導(dǎo)自噬和抑制ECM通路，抑制結(jié)腸癌細胞干細胞活性，它還能逆轉(zhuǎn)食管癌對長春新堿的耐藥性[22]，增強骨髓瘤對硼替佐米的化療敏感性[23]。但是，姜黃素能否逆轉(zhuǎn)EC對孕激素的耐藥性需要進一步研究，因此，本研究用不同濃度姜黃素處理ISH/MPA耐藥細胞，檢測細胞存活率并篩選出姜黃素的最佳濃度。MTT法檢測細胞存活率結(jié)果表明，姜黃素降低細胞存活率，并隨姜黃素濃度的增加逐漸降低。流式細胞儀檢測細胞凋亡率結(jié)果表明，姜黃素組細胞凋亡率增加。提示姜黃素可抑制ISH/MPA增殖，促進其凋亡，逆轉(zhuǎn)細胞對MPA的耐藥性。

Notch信號通路是一種高度保守的細胞間相互作用的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，參與調(diào)控細胞的增殖、分化和凋亡，在腫瘤的形成過程中同樣發(fā)揮作用[24]。Notch信號通路由受體(Notch1-4)、配體(Jagged1-2、DII1、3、4)以及DNA結(jié)合蛋白組成，細胞間Notch配體和受體結(jié)合后，經(jīng)過剪切，釋放具有活性的Notch片段NICD，并轉(zhuǎn)移入細胞核，與核內(nèi)轉(zhuǎn)錄蛋白結(jié)合后，激活Hes靶基因，從而發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，Notch1信號通路與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，胃癌細胞、乳腺癌細胞、肺腺癌細胞中Notch1高表達[25-27]，另外，Notch1/Jagged1/Hes-1信號通路影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展[28]。而且Notch1信號通路與腫瘤對化療藥物的敏感性和耐藥性有關(guān)[29]。但是姜黃素逆轉(zhuǎn)EC MPA治療耐藥性是否通過調(diào)節(jié)Notch1信號通路需進一步驗證，本研究采用姜黃素和Notch1通路特異性激動劑NSC 22423干預(yù)ISH/MPA細胞，結(jié)果顯示，姜黃素組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達降低，激動劑組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達升高，姜黃素+激動劑組Notch1、Jagged1、Hes-1蛋白表達較激動劑組降低。

4 結(jié)論

姜黃素可逆轉(zhuǎn)子宮內(nèi)膜癌MPA耐藥性，促進ISH/MPA細胞凋亡，抑制ISH/MPA細胞增殖，可能是通過抑制Notch1/Jagged1/Hes-1信號通路發(fā)揮調(diào)控作用，為治療EC提供理論依據(jù)。