吳和剛 朱坤婷 王姣姣 莊翔

(宜賓市第一人民醫(yī)院病理科，四川 宜賓 644000)

在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是公認(rèn)的導(dǎo)致女性死亡的主要因素之一；每年大約有53000新增病例及27500死亡病例[1-3]。與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的主要危險(xiǎn)因素有：人類(lèi)高危乳頭瘤病毒(high-risk human papilloma virus，hrHPV)感染、年齡、吸煙、分娩以及飲食[1，3-7]。宮頸癌的進(jìn)展過(guò)程主要包括以下幾個(gè)階段：正常的宮頸上皮，宮頸低級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，宮頸高級(jí)別上皮內(nèi)瘤變，在此過(guò)程中，hrHPV的感染為主要的致病因素。宮頸上皮感染hrHPV后，宿主細(xì)胞的基因發(fā)生改變，最終導(dǎo)致多種抑癌因子被沉默以及多種癌基因被激活，從而引起一系列的功能異常改變。Trx1在腫瘤的病理生理改變中起到重要作用，并且在多種腫瘤中檢測(cè)到Trx1的異常表達(dá)[8]。已有研究發(fā)現(xiàn)Trx1參與了各種重要的細(xì)胞功能，并且在多種人類(lèi)腫瘤中表達(dá)上調(diào)，參與了腫瘤進(jìn)展過(guò)程和耐藥現(xiàn)象[9]。已知Trx1主要是通過(guò)與其下游的過(guò)氧化物酶相互作用而發(fā)揮其抗氧化的功能[10]。本研究將在目前研究的基礎(chǔ)上進(jìn)一步驗(yàn)證Trx1在宮頸癌中的表達(dá)情況，探討Trx1發(fā)揮作用的分子學(xué)機(jī)制，為抑制宮頸癌的發(fā)生發(fā)展尋找新的方法和藥物奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑 鼠抗人GAPDH抗體(Santa Cruz公司)；DAPI(Sigma公司)；兔抗人Trx1，HLA-DR(Bioworld公司)；熒光二抗(Santa Cruz公司)；0.01M檸檬酸鈉緩沖液顆粒、蘇木素染液(重慶鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司)；S-P免疫組化試劑盒、DAB染色試劑盒(北京中杉金橋公司)； PrimeSTAR HS DNA Polymerase(Takara公司)。

1.2 方法

1.2.1 組織標(biāo)本收集：宜賓市第一人民醫(yī)院病理科標(biāo)本庫(kù)中提取3對(duì)宮頸癌及癌旁組織標(biāo)本。

1.2.2 組織蛋白檢測(cè)：稱(chēng)取相同重量的宮頸癌組織，放入EP管中備用。加入預(yù)冷的含PMSF的RIPA裂解液，用勻漿器使組織完全裂解后，14000×g，4℃離心取上清，-80℃保存。取上清液加入loading buffer，進(jìn)行SDS-PAGE以及Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)。

1.2.3 基因表達(dá)檢測(cè)：根據(jù)GenBank 提供的SND1 cDNA 序列(NM_014390.4)用Primer 5.0設(shè)計(jì)合成引物。上游5′-AACAAGAAACTGCGTCCCCT-3′；下游5′-GATGTGCAGCCAGCCGATAA-3′。GAPDH引物序列：上游5，-ACAGTCAGCCGCATCTTCTT-3′；下游5′-GTCAAAGGTGGAGGAGTGGG-3′。從宮頸癌中提取人的mRNA，以其為模板反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，進(jìn)行PCR擴(kuò)增各組SND1基因。并用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)表達(dá)情況。

1.2.4 免疫組織化學(xué)檢測(cè)蛋白定位和表達(dá)：人宮頸癌組織和癌旁組織固定并制成蠟塊后，對(duì)組織進(jìn)行切片、脫蠟、梯度乙醇水化、通透、抗原修復(fù)、一抗Trx1于4℃孵育過(guò)夜、顯色，最后復(fù)染和封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

1.2.5 免疫熒光檢測(cè)蛋白定位和表達(dá)：人宮頸癌組織和癌旁組織在冰凍切片機(jī)上切片后，對(duì)組織進(jìn)行通透、封閉、一抗Trx1和HLA-DR于4℃孵育過(guò)夜、第二天加入稀釋的熒光二抗，甘油封片后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果并拍照。

2 結(jié)果

2.1 Trx1蛋白在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)情況 Trx1在宮頸癌組織中高表達(dá)，在癌旁組織中表達(dá)相對(duì)較低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 Trx1蛋白在宮頸癌組織和癌旁組織中的表達(dá)Figure 1 The expression of Trx1 in cervical cancer and adjacent tissues

2.2 RT-PCR結(jié)果SND1在宮頸癌組織中表達(dá)顯著高于癌旁組織，見(jiàn)圖2。

圖2 SND1基因的RT-PCR檢測(cè)結(jié)果Figure 2 Identification of gene expression of SND1 by RT-PCR

2.3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果 與對(duì)照組相比，Trx1蛋白在宮頸癌組織中表達(dá)明顯高于癌旁組織，并且主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，見(jiàn)圖3。

圖3 免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)鑒定Trx1在宮頸癌和癌旁組織中的表達(dá)Figure 3 Verification of Trx1 in cervical cancer and adjacent tissues by IHC

2.4 免疫熒光實(shí)驗(yàn)結(jié)果 Trx1和HLA-DR均表達(dá)在胞漿中，且Trx1和HLA-DR 表達(dá)有共定位現(xiàn)象，見(jiàn)圖4。

圖4 免疫熒光觀察Trx1與HLA-DR的共定位Figure 4 Co-localization of Trx1 and HLA-DR in cervical cancer tissues by IF注：A.DAPI在宮頸癌組織中；B.Trx1在宮頸癌組織中；C.HLA-DR在宮頸癌組織中；D.宮頸癌組織中Trx1和HLA-DR共定位現(xiàn)象(200×)

3 討論

目前為止，宮頸癌中已發(fā)現(xiàn)了多種分子層面改變。最近的研究證明多種致癌因子能夠促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展過(guò)程，其中包括HMAG1、KLF5、miR-146b-3p以及多種長(zhǎng)鏈非編碼RNAs[11-14]。另一方面，miR-27a，miR-328等被證實(shí)具有抑制宮頸癌的作用[15，16]。同時(shí)，通過(guò)高通量的基因測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了在宮頸癌中多種基因突變，如FAT1，MLL3和FADD等[16]。以上這些研究都提示了在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中存在多種機(jī)制及信號(hào)通路，然而Trx1與宮頸癌的關(guān)系的研究并不充分。

Trx1是一種12 kDa的具有氧化還原活性的二硫酚蛋白質(zhì)；它位于半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸的活性區(qū)域，并且在人體內(nèi)廣泛存在[17]。多種應(yīng)激因素可以誘導(dǎo)產(chǎn)生這種防御蛋白；Trx1具有抗氧化、抗凋亡和抗炎等作用[18]。已有研究證明Trx1與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[8]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)人宮頸癌和癌旁組織中Trx1蛋白的表達(dá)，證明了Trx1在宮頸癌組織中顯著高表達(dá)(圖1)，這與它在其他腫瘤中的表達(dá)一致[8]，同時(shí)也提示Trx1很可能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。目前普遍認(rèn)為SND1也能促進(jìn)多種人類(lèi)腫瘤的進(jìn)展[19]。本研究檢測(cè)了宮頸癌和癌旁組織中SND1 mRNA的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)其在宮頸癌組織中表達(dá)高于癌旁組織，推測(cè)SND1也能促進(jìn)宮頸癌的進(jìn)展，并且與Trx1在宮頸癌中的表達(dá)趨勢(shì)很可能是一致。

基因多態(tài)性與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[20]。最近的研究發(fā)現(xiàn)人白細(xì)胞抗原的多態(tài)性突變與宮頸癌的進(jìn)展有關(guān)[20]。通過(guò)對(duì)多個(gè)非洲國(guó)家(南非、津巴布韋、摩洛哥、蘇丹、突尼斯、塞內(nèi)加爾)的研究，確定了TGFBT10C、TGFBc509T、HLADRB1、CCR2V6L、IL-10-1082G/A和FasR-1377G的基因多態(tài)性與宮頸癌的危險(xiǎn)因素相關(guān)[21]。本研究中檢測(cè)了宮頸癌組織中Trx1與HLA-DR表達(dá)以及定位，發(fā)現(xiàn)二者均在宮頸癌細(xì)胞中表達(dá)，且主要定位于細(xì)胞質(zhì)中；通過(guò)不同的熒光標(biāo)記兩種蛋白質(zhì)，還確定了這兩種蛋白質(zhì)在宮頸癌細(xì)胞中存在共定位現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)提示了Trx1和HLA-DR很可能存在相互作用。結(jié)合已有報(bào)道[21]，我們推測(cè)Trx1與HLA-DR之間可能存在相互作用，并且對(duì)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起到促進(jìn)作用。

4 結(jié)論

本研究證實(shí)了Trx1在宮頸癌中顯著高表達(dá)，且與HLA-DR可能存在相互作用，但是兩者之間發(fā)生相互作用的機(jī)制以及如何影響宮頸癌的發(fā)生發(fā)展仍不夠清楚。后期將繼續(xù)探討它們之間的相互作用是通過(guò)哪些信號(hào)通路或者中間分子實(shí)現(xiàn)的，以及對(duì)宮頸癌的增殖轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特征產(chǎn)生怎樣的促進(jìn)作用，以便為宮頸癌的預(yù)后判斷以及早期診斷提供新的思路和方法。