王紋紋 雷 靜 尤浩軍

（延安大學(xué)感覺與運動疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，延安 716000）

SD大鼠（Sprague-Dawley rats，Rattus norvegicus）生長發(fā)育快，繁殖能力和抗疾病能力強，主要用于多系統(tǒng)，包括神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)及內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病的動物模型構(gòu)建及機制研究。同時，該類動物也被廣泛用于藥物研發(fā)及篩選中的藥理和毒理實驗。

疼痛是一種令人不愉快的感覺經(jīng)歷。疼痛按照產(chǎn)生的部位可分為軀體痛和內(nèi)臟痛，二者具有不同的傷害感受特點，且在神經(jīng)機制方面存在顯著差異。內(nèi)臟痛是由內(nèi)臟器官接受機械性牽拉、痙攣、缺血和炎癥等刺激所致，是一種臨床上常見的病癥。目前，全球超過20%的人口患有慢性內(nèi)臟痛癥狀［1］。內(nèi)臟痛不僅嚴(yán)重影響患者的日常生活，也給社會造成了極大的負擔(dān)。內(nèi)臟痛由于其特殊的疼痛性質(zhì)和獨特的特點，使其基礎(chǔ)研究較軀體痛相對滯后。內(nèi)臟痛的動物模型多樣，機制復(fù)雜。其復(fù)雜機制涉及中樞和外周多種離子通道/受體數(shù)目及功能改變、外周傳入神經(jīng)元可塑性改變及中樞敏化等。對于深入研究內(nèi)臟痛復(fù)雜機制這一重大難題，正確選擇和建立符合臨床內(nèi)臟疾病病理生理學(xué)特征的實驗動物模型是解決問題的前提條件。本文對近年來各種內(nèi)臟痛動物模型的制備進行了總結(jié)，并分析了其特點和不足之處，以期為研究者選擇合適的內(nèi)臟痛動物模型提供參考。

1 內(nèi)臟痛的特點

內(nèi)臟器官中感覺神經(jīng)元分布較少，痛覺傳入纖維在外周互有交叉，傳入路徑多樣、復(fù)雜，但在高級中樞出現(xiàn)廣泛匯聚。其有以下幾個特征［2］：a.疼痛部位定位不明確，且傳入途徑彌散，如患者發(fā)生腹痛時，往往無法明確地表述疼痛產(chǎn)生的具體位置，是最主要的特點；b.產(chǎn)生牽涉痛，即在遠離內(nèi)臟病變區(qū)域的軀體或其他部位出現(xiàn)疼痛，如患者患有膽囊炎時，右肩區(qū)出現(xiàn)疼痛；c.不是所有的內(nèi)臟器官都有疼痛產(chǎn)生，且每種器官產(chǎn)生的疼痛程度不同，可能是由于內(nèi)臟器官痛覺感受器的分布不同；d.常伴有運動和（或）自主神經(jīng)反射，如惡心、嘔吐等；e.并非都與內(nèi)臟損傷有關(guān)。

2 內(nèi)臟痛實驗動物模型

適宜的內(nèi)臟痛實驗動物模型是研究內(nèi)臟痛的前提條件。基于解剖學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)研究的不斷深入，眾多學(xué)者已成功建立了多種內(nèi)臟痛實驗動物模型，為后續(xù)開展內(nèi)臟痛的基礎(chǔ)和臨床研究奠定了基礎(chǔ)。內(nèi)臟痛動物模型應(yīng)具備與臨床內(nèi)臟疾病盡可能相似的病理生理學(xué)特征，并且還應(yīng)考慮其重復(fù)性、易操作性和經(jīng)濟性等問題。目前內(nèi)臟痛實驗動物模型尚無權(quán)威分類方法，主要按照造模刺激方式進行分類，分為炎性內(nèi)臟痛模型、機械擴張性內(nèi)臟痛模型、缺血性內(nèi)臟痛模型及電刺激性內(nèi)臟痛模型等。本文對這幾類動物模型總結(jié)如下。

2.1 炎性內(nèi)臟痛模型

2.1.1 扭體實驗（writhing test）

實驗者將乙酸、緩激肽及硫酸鎂等化學(xué)刺激性物質(zhì)注入動物腹腔，實驗動物所表現(xiàn)出的間歇發(fā)作運動反應(yīng)，即臀部位置不正、腹部明顯收縮及一側(cè)后肢外伸等特殊姿勢，此行為反應(yīng)定義為扭體反應(yīng)（圖1）。該實驗適用于多種動物，其中大鼠和小鼠應(yīng)用較廣泛、效果較好。實驗中最常用的化學(xué)刺激性物質(zhì)是乙酸，大鼠腹腔內(nèi)注射1%乙酸后大約5～10 min出現(xiàn)扭體反應(yīng)，且在30 min左右扭體反應(yīng)頻率最高。Schmauss 等［3］提出經(jīng)典的行為學(xué)評分標(biāo)準(zhǔn)可對扭體行為進行量化。動物的扭體行為分為4 個等級（A：正常姿勢無異常變化記為0 分；B：身體傾斜向一邊記為1 分；C：后肢過度向后伸展，且頻繁后擺記為2 分；D：腹部肌肉明顯收縮，后肢外伸記為3 分），計算內(nèi)臟痛指數(shù)（visceral pain index，VPI）［3］。VPI為各個等級扭體行為出現(xiàn)次數(shù)與相應(yīng)分值乘積后的總和，即VPI=B+2C+3D。該模型可避免麻醉藥物對動物的影響，且其行為反應(yīng)出現(xiàn)快、變化明顯，具備易操作和重復(fù)性好等優(yōu)點，因此常被用于篩選和評估鎮(zhèn)痛藥物（如甲芬那酸、布洛芬衍生物）［4-5］。缺點是化學(xué)刺激性物質(zhì)注入動物腹腔后的擴散程度及擴散速度不可控制，動物的行為反應(yīng)和神經(jīng)生理反應(yīng)存在差異；且化學(xué)刺激性物質(zhì)可能在一定程度上影響腹膜壁層，造成腹膜炎，產(chǎn)生軀體痛。

Fig.1 Writhing test圖1 扭體實驗

2.1.2 心包炎模型

心包炎模型是將一個環(huán)形硅導(dǎo)管插入大鼠心包5 d 后，在大鼠清醒狀態(tài)下，將緩激肽、組胺和前列腺素E2 混合液或辣椒素通過環(huán)形硅導(dǎo)管灌入心包內(nèi)，動物出現(xiàn)厭惡反應(yīng)、炎癥及血壓變化［6］。心包內(nèi)注入刺激性物質(zhì)后產(chǎn)生炎癥，且伴有由于炎癥使心包內(nèi)壓力升高而引起的壓力性刺激［7］。該模型建模成功后，動物行為反應(yīng)變化明顯，可模擬臨床上常見的心包炎，但不足之處是涉及的手術(shù)操作環(huán)節(jié)較為復(fù)雜，且在心包內(nèi)注射刺激性物質(zhì)后可致動物嚴(yán)重心律失常及死亡，因此建模成功率較低。

2.1.3 急性胰腺炎（acute pancreatitis，AP）

Aho 等［8］在1983 年首次提出的胰膽管逆行牛磺膽酸鈉（sodium taurocholate，ST）注射法是誘導(dǎo)急性胰腺炎最常用的造模方法之一，即通過手術(shù)在十二指腸乳頭開口處放置套管后，胰膽管壺腹部逆行注射?；悄懰徕c。該方法手術(shù)創(chuàng)傷較大，操作復(fù)雜，易造成動物死亡。此造模方法經(jīng)改良后，由十二指腸穿刺置管代替十二指腸切開，改良后的方法雖然降低了手術(shù)創(chuàng)傷，但很難準(zhǔn)確的找到并穿刺胰膽管［9］。隨后研究者對該方法進行了進一步優(yōu)化，提出胰腺被膜下注射法，即通過手術(shù)暴露并明確找到胰腺部位，由胰尾部開始在被膜下均勻點狀注射ST［10］。該模型主要用于模擬膽總管下段梗阻，但操作復(fù)雜、死亡率高、創(chuàng)傷大，可能會引起一系列并發(fā)癥。

2.1.4 乙狀結(jié)腸痛模型

大鼠呼吸麻醉后，用生理鹽水沖洗出直腸內(nèi)糞便，然后在距肛門35 mm 的乙狀結(jié)腸壁黏膜下處注射0.1 ml 5%甲醛，大鼠快速表現(xiàn)出舔腹或外陰區(qū)、肢體過度伸展、腹部肌肉收縮及弓背等行為，且45 min內(nèi)行為學(xué)變化明顯，30 min左右疼痛程度最高［11-12］。該模型建模成功后，行為反應(yīng)變化明顯，且僅在乙狀結(jié)腸壁產(chǎn)生炎性反應(yīng)。與扭體實驗相比，此模型避免了腹腔廣泛的炎性反應(yīng)，且炎癥可在1周后自愈，主要用于疼痛藥物篩選和治療措施的自身對照實驗。

2.1.5 潰瘍性結(jié)腸炎模型

潰瘍性結(jié)腸炎動物模型適用于多種動物，基礎(chǔ)研究中以使用大鼠和小鼠居多，其造模方法多樣，如免疫法、復(fù)合法、化學(xué)法、基因模型法及中醫(yī)病證結(jié)合模型法等，其中化學(xué)法和復(fù)合法是較成熟且常用的方法?；瘜W(xué)法常用的刺激性物質(zhì)主要有乙酸（acetic acid，AA）、惡唑酮（oxazolone，OXZ）、角叉菜膠及葡聚糖硫酸鈉（dextran sulfate sodium，DSS）等，基礎(chǔ)和臨床研究中大多采用乙酸和DSS自由飲。復(fù)合法有2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇誘導(dǎo)、二硝基氯苯/乙酸誘導(dǎo)及乙酸復(fù)合刺激法等，其中2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇誘導(dǎo)較為常見。

a.DSS 自由飲：動物自由飲用3%～5%DSS 溶液7 d后，表現(xiàn)為狀態(tài)不佳、體重下降、稀便、糞便帶血、結(jié)腸長度縮短及黏膜損傷等［13］。該造模方法易操作、重復(fù)率高、造模成功率高、與臨床癥狀高度相似，可用于潰瘍性結(jié)腸炎治療藥物的篩選。不足之處是每只實驗動物飲入的DSS 量無法控制，導(dǎo)致其發(fā)病程度有很大差異。

b. 2，4，6-三硝基苯磺酸/乙醇誘導(dǎo)：大鼠造模前禁食24 h，腹腔麻醉后外徑約2 mm 的聚乙烯導(dǎo)管插入至距肛門約8 cm 直腸內(nèi)，50%乙醇和5%2，4，6-三硝基苯磺酸混合物經(jīng)此管進行直腸給藥，大鼠保持倒立3 min便于藥液停留在直腸內(nèi)被充分吸收［14］。造模后約3 d大鼠出現(xiàn)活動減少、精神不振、皮毛粗糙、體重下降、稀便、血便及腸道潰爛等癥狀。該造模方法成功率高、造模時間短、操作簡單、易重復(fù)及耐受性好等，可模擬臨床上潰瘍性結(jié)腸炎，且在基礎(chǔ)研究中主要用于潰瘍性結(jié)腸炎機制的研究以及相關(guān)藥物篩選。兩種方法建立的潰瘍性結(jié)腸炎動物模型皆與臨床上潰瘍性結(jié)腸炎患者的癥狀相似，但在病程發(fā)展、組織病理損傷及腸道菌群等方面存在明顯差異［15］。

2.1.6 新生期傷害性刺激模型（化學(xué)性刺激）

大鼠在新生期接受傷害性刺激可致成年后內(nèi)臟痛敏，常見的傷害性刺激有機械擴張性刺激（結(jié)直腸擴張刺激）和化學(xué)性刺激（如乙酸、芥子油）。大鼠在出生后第8～21 天連續(xù)14 d 在結(jié)腸內(nèi)注射0.2 ml 5%芥子油，可致結(jié)腸炎癥，5周齡后炎癥消失，但大鼠對結(jié)直腸擴張（colorectal distension，CRD）敏感性增強［16］。動物出現(xiàn)痛閾降低、痛反應(yīng)增強。

2.1.7 新生期結(jié)直腸炎癥模型

10 日齡大鼠距肛門2 cm 處結(jié)腸內(nèi)注入0.2 ml 0.5%稀乙酸后可致幼鼠腸道炎癥及內(nèi)臟痛敏，并在成年后表現(xiàn)出明顯的內(nèi)臟超敏反應(yīng)［17］。此造模方法可對幼鼠的結(jié)直腸產(chǎn)生輕微的炎癥或損傷，同時會產(chǎn)生明顯的內(nèi)臟痛敏反應(yīng)并持續(xù)至成年。該模型的特征與臨床上腸易激綜合征患者的慢性內(nèi)臟痛癥狀相似，與多次注射化學(xué)刺激性物質(zhì)的造模方法相比，該造模方法一次性注入炎性物質(zhì)對結(jié)直腸的損傷較小，是一種操作簡單、造模成功率高的內(nèi)臟痛實驗動物模型。

2.1.8 急性膀胱炎模型

炎性刺激性物質(zhì)（如乙酸、芥子油、丙烯醛等）經(jīng)導(dǎo)管注入至實驗動物的膀胱內(nèi)，動物的膀胱產(chǎn)生炎癥和充盈，此時排尿感和疼痛共存，動物表現(xiàn)出嘶叫、搖頭、撕咬、腹部收縮及后肢伸展等行為學(xué)變化［18］。

該模型易操作、行為變化明顯，但缺乏較為合理、肯定的評分標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.9 間質(zhì)性膀胱炎模型

間質(zhì)性膀胱炎模型的造模方法主要有：膀胱內(nèi)途徑、膀胱外途徑及聯(lián)合途徑。膀胱內(nèi)途徑是通過在尿道膀胱置管后注射化學(xué)刺激性物質(zhì)，如硫酸魚精蛋白/脂多糖、透明質(zhì)酸酶（hyaluronidase，HA）、鹽酸及乙酸等，誘導(dǎo)間質(zhì)性膀胱炎，動物出現(xiàn)膀胱上皮組織損傷、肥大細胞活化、排尿頻率增加、排尿間隔時間縮短等行為及病理性特征［19-22］。該造模方法通過藥物直接作用于膀胱，減小了其他器官組織損傷，是目前間質(zhì)性膀胱炎相關(guān)基礎(chǔ)研究中應(yīng)用較廣泛的模型之一。但對于小鼠，該操作復(fù)雜，易引起尿道損傷。膀胱外途徑主要通過物質(zhì)代謝或免疫方式間接作用于泌尿系統(tǒng)，誘導(dǎo)間質(zhì)性膀胱炎，如皮下注射尿溶蛋白II或腹腔注射環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CYP）等［22-23］。大鼠出現(xiàn)膀胱水腫、黏膜潰瘍及炎性細胞浸潤等特征。該模型操作簡單、更接近間質(zhì)性膀胱炎自然發(fā)病機制，主要用于其病因及發(fā)病機制的基礎(chǔ)研究。聯(lián)合途徑是膀胱內(nèi)途徑和膀胱外途徑聯(lián)合作用誘導(dǎo)間質(zhì)性膀胱炎。膀胱內(nèi)注入硫酸魚精蛋白/脂多糖聯(lián)合腹腔注射CYP 是目前聯(lián)合途徑較為經(jīng)典的造模方法，其更接近間質(zhì)性膀胱炎的病理生理性特征［24］。

2.2 機械擴張性內(nèi)臟痛模型

2.2.1 胃十二指腸擴張模型

手術(shù)將一帶有可擴張氣囊的導(dǎo)管插入至胃內(nèi)或十二指腸，給予充氣或充水，擴張氣囊，產(chǎn)生機械擴張性刺激，動物出現(xiàn)明顯的行為學(xué)變化，如磨牙、肢體伸展、抖動、背部拱起及身體旋轉(zhuǎn)等［25］。該刺激方法作用于胃時，可模擬胃壁擴張；作用于十二直腸時，可致十二指腸梗阻。該模型行為反應(yīng)變化明顯，但手術(shù)操作復(fù)雜、有創(chuàng)傷，目前應(yīng)用較少。

2.2.2 結(jié)直腸擴張模型

結(jié)直腸擴張是將一帶有長約6～8 cm 氣囊的導(dǎo)管從實驗動物的肛門插入至降結(jié)腸內(nèi)，隨后給予充氣，擴張球囊，以達到機械性刺激目的，動物出現(xiàn)腹部收縮、背部隆起、骨盆或睪丸抬起等行為，多用于結(jié)直腸內(nèi)臟痛基礎(chǔ)研究［26］。目前多種動物可用于CRD 建模，其中較常用的是大鼠。CRD 行為學(xué)變化次數(shù)較少，學(xué)者進一步提出了炎癥性CRD模型，即在炎性內(nèi)臟痛的基礎(chǔ)上進行機械性擴張，可致厭惡行為、血流動力學(xué)及自主神經(jīng)等改變的頻率升高［27］。該模型具有易操作、重復(fù)性好和行為變化明顯的優(yōu)點。缺點是球囊壓力一旦超出一定范圍，會導(dǎo)致腸道損傷或破裂。

2.2.3 新生期傷害性刺激模型（機械刺激）

持續(xù)、反復(fù)的CRD 作用于新生期大鼠的結(jié)直腸，可作為一種傷害性刺激，造成幼年期或成年期大鼠內(nèi)臟痛敏。大鼠在出生后第8～21 天每天用氣囊對結(jié)直腸進行機械性擴張刺激，每次氣囊壓力控制在60 mmHg，持續(xù)1 min，2 次/d，5 周齡后大鼠對CRD的敏感性增強，內(nèi)臟敏感性升高［28］。該模型操作復(fù)雜，易對腸道造成損傷。

2.3 缺血性內(nèi)臟痛模型

缺血性內(nèi)臟痛主要是通過阻塞血管（如動脈），產(chǎn)生病理性痛。冠狀動脈阻塞是較成熟的缺血性內(nèi)臟痛模型之一。實驗者通過手術(shù)阻塞冠狀動脈，造成心肌缺血，誘發(fā)動物行為反應(yīng)發(fā)生變化［29］。但冠狀動脈對心肌供血往往有變異性，由此導(dǎo)致動物行為學(xué)的變化可能存在很大差異。目前，該模型主要用于定性，而非定量研究。

2.4 電刺激性內(nèi)臟痛模型

在內(nèi)臟痛研究中，動物的內(nèi)臟神經(jīng)傳入纖維接受傷害性電刺激可產(chǎn)生疼痛反應(yīng)。對于胸腔器官常用電刺激心下神經(jīng)模擬心絞痛，而腹腔器官則采用電刺激內(nèi)臟大神經(jīng)，盆腔器官可采用電刺激腹下神經(jīng)和盆神經(jīng)［30］。該模型優(yōu)點是重復(fù)率高、刺激強度可控制，但由于電刺激是非生理性刺激，故應(yīng)用并不廣泛。

2.5 其他內(nèi)臟痛模型

2.5.1 新生期母嬰分離模型

新生期母嬰分離模型通常選用嚙齒類動物，其中大鼠較廣泛應(yīng)用。實驗者將幼鼠從出生后的第2～15天，與母鼠每天固定時間分離3 h，幼鼠成年后表現(xiàn)為內(nèi)臟痛覺過敏、學(xué)習(xí)和記憶能力下降、焦慮及抑郁行為和應(yīng)激反應(yīng)增強等，且雌性較易患?。?1-35］。新生期是中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元發(fā)育的關(guān)鍵時期，新生期母嬰分離代表一種早期不良生活事件，可致大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸功能紊亂、內(nèi)分泌改變、腸道黏膜損傷及內(nèi)臟高敏感（visceral hypersensitivity，VH），通常用于模擬臨床上慢性內(nèi)臟痛腸易激綜合征。該模型簡單、易操作，但造模周期較長。

2.5.2 急性應(yīng)激模型

目前成年大鼠急性應(yīng)激形式有避水應(yīng)激（water avoidance stressor，WAS）、冷 束 縛 應(yīng) 激（cold and restrained stressor，CRS）以及強迫游泳應(yīng)激（forced swimming stressor，F(xiàn)SS）等。避水應(yīng)激模式：將大鼠置于一略高于水面的小平臺上2 h，動物表現(xiàn)出對周圍環(huán)境的厭惡和恐懼，對CRD 的敏感性增強，模擬心理應(yīng)激引起的大鼠腸易激綜合征［36］。冷束縛應(yīng)激是將大鼠部分身體（如前肢、胸部軀干）進行束縛和限制活動2 h，可致內(nèi)臟高敏感反應(yīng)［37］。此外強迫游泳應(yīng)激也可引起大鼠內(nèi)臟痛敏，即將大鼠置于盛有干凈自來水的圓柱形水槽中，進行強迫游泳6 min，大鼠對結(jié)直腸擴張反應(yīng)增強［38］。該模型主要用于模擬心理壓力引起的內(nèi)臟痛覺過敏，但在造模時要考慮動物對環(huán)境的適應(yīng)問題。

2.5.3 慢性輕度應(yīng)激模型

日常慢性輕度應(yīng)激重復(fù)累積作用于大鼠，嚴(yán)重影響大鼠內(nèi)臟痛的程度及持續(xù)時間。WAS 是最先適合動物內(nèi)臟痛敏研究的慢性應(yīng)激方式之一。大鼠每天接受1 h WAS，連續(xù)10 d，表現(xiàn)出對CRD反應(yīng)高敏，且自應(yīng)激結(jié)束后起30 d，仍保持內(nèi)臟高敏感［39］。該模型可模擬成年長期心理壓力引起的內(nèi)臟高敏反應(yīng)。

2.5.4 間隙性異源型應(yīng)激模型

間隙性異源型應(yīng)激模型是WAS（60 min）、4℃CRS（45 min）及FSS（20 min）3種應(yīng)激源隨機排列，大鼠每天固定時間段隨機接受一種應(yīng)激（1～2 次），持續(xù)9 d，可致大鼠對結(jié)直腸擴張反應(yīng)增強、內(nèi)臟高敏感且持續(xù)時間長［40］。該模型可模擬日常生活中的多種復(fù)雜應(yīng)激事件所引起的內(nèi)臟痛敏，且可避免單一應(yīng)激誘發(fā)的耐受現(xiàn)象。

2.5.5 環(huán)境恐懼誘導(dǎo)的應(yīng)激模型

大鼠接受同種動物或天敵攻擊，或一個短暫沖擊來建立模型，表現(xiàn)出持久的條件性恐懼反應(yīng)及對新的刺激敏感且隨時間推移而加?。?1］。此外，研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)歷或目睹創(chuàng)傷性事件（如戰(zhàn)爭、環(huán)境災(zāi)難）可能引起創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙，且胃腸道的患病率增加［41］。該模型臨床上可模擬創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙引起的腸易激綜合征。

3 總結(jié)與展望

內(nèi)臟痛是疼痛研究領(lǐng)域的焦點和難點之一，為研究其相關(guān)內(nèi)臟疾病的發(fā)病機制及篩選治療藥物，設(shè)計和建立實驗動物模型是重中之重。目前常用的內(nèi)臟痛實驗動物模型多樣，可模擬臨床上各種內(nèi)臟疾病的生理病理性特征，但每種模型都有其特點及優(yōu)缺點（表1），因此在基礎(chǔ)研究過程中需要根據(jù)研究方向選擇合適的模型。各種模型的不足限制了其應(yīng)用，因此需要進一步設(shè)計和制備更理想的動物模型，推動內(nèi)臟痛研究領(lǐng)域的發(fā)展。

Table 1 Summary of characteristics，applications，advantages and disadvantages of visceral pain model表1 內(nèi)臟痛模型特點、應(yīng)用及優(yōu)缺點總結(jié)

續(xù)表1