劉昌森 周歡 周辰炎 范良苗 唐凡 胡欣朦 王佩玉 楊文杰

摘 要 雙氰胺（DCD）、二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）是在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上廣泛使用的硝化抑制劑，有助于提高氮肥的利用率。通過噴施兩種不同濃度梯度的硝化抑制劑溶液，比較分析黃瓜種子對抑制劑的敏感濃度，在此基礎(chǔ)上，進一步探討不同濃度的抑制劑對黃瓜種子發(fā)芽率，淀粉酶、過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶活性及丙二醛含量的影響。試驗結(jié)果：與對照組相比，低濃度硝化抑制劑溶液對黃瓜種子發(fā)芽無明顯抑制作用，高濃度情況下則會降低種子發(fā)芽率;對于淀粉酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性的檢測結(jié)果表明，雙氰胺呈現(xiàn)明顯的低促高抑現(xiàn)象，當雙氰胺溶液濃度增加至10.0 μmol·mL-1，上述酶活性均受到顯著抑制;低濃度的3，4-二甲基吡唑磷酸鹽溶液對淀粉酶、過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶等活性無顯著影響，在1.0 μmol·mL-1的3，4-二甲基吡唑磷酸鹽溶液處理下，上述酶活性均顯著低于對照;當雙氰胺和3，4-二甲基吡唑磷酸鹽濃度達到試驗設(shè)置的最高濃度時，丙二醛含量均顯著升高，在其他濃度時，則無顯著差異。綜上，當雙氰胺的施用量控制在1～5 μmol·mL-1，3，4-二甲基吡唑磷酸鹽施用量控制在0.1～0.5 μmol·mL-1時，對黃瓜幼苗較為安全。

關(guān)鍵詞 雙氰胺;3，4-二甲基吡唑磷酸鹽;黃瓜種子;發(fā)芽率;酶活性

中圖分類號：S642.2 文獻標志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2022.07.022

黃瓜作為一種廣受歡迎的蔬菜，其口感佳、維生素含量高，一直以來市場需求量都很大[1]。黃瓜在我國各地廣泛種植，在許多地區(qū)采用的是溫室或塑料大棚栽培方式。據(jù)了解，目前市售黃瓜大多在栽種時，施加氮肥的同時也添加了硝化抑制劑，一方面可以增加作物產(chǎn)量，降低硝酸鹽含量，提高作物品質(zhì);另一方面也可以抑制土壤細菌硝化作用，減少氮肥損失，提高環(huán)境效益。采用這種生產(chǎn)方法，不僅對消費者健康有益，提高種植戶收入，還可以減輕環(huán)境壓力，有利于生態(tài)建設(shè)。

雙氰胺（DCD）和3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上常用的兩種硝化抑制劑[2-3]，其在增加農(nóng)作物產(chǎn)量、提高農(nóng)作物品質(zhì)和改善土壤生態(tài)等方面的作用，國內(nèi)外學者已開展了大量研究，取得了很多成果。伍少福等[4]在大田種植中，施用添加了DMPP的復合肥，對黃瓜、西瓜產(chǎn)量及營養(yǎng)品質(zhì)有很大提高，且對不同西瓜品種的作用效果不同。溫室栽培黃瓜時，趙歐亞等[5]在農(nóng)民習慣施肥量基礎(chǔ)上，添加了氮肥用量20%的DCD，其黃瓜品質(zhì)和產(chǎn)量均得到顯著提高;另外，張琳等[6]種植時配施含DCD的氮肥，發(fā)現(xiàn)可明顯減少溫室氣體N2O排放量，氮素流失減少，氮肥在土壤中留存時間延長;趙婉伊等[7]將硝化抑制劑與脲酶抑制劑配合使用，發(fā)現(xiàn)黃瓜生長過程中，除產(chǎn)量提升外，氮素可以緩慢釋放，礦物質(zhì)利用率也得到提高。同時也有學者研究發(fā)現(xiàn)，當硝化抑制劑的施用濃度過高時，會對作物幼苗產(chǎn)生種種危害[8-10]。

上述研究中，硝化抑制劑作為添加劑直接使用，是否會產(chǎn)生負面影響仍不明確，因此明確硝化抑制劑的安全添加量是當前需要解決的問題。在適宜環(huán)境下，黃瓜種子吸漲水分后便開始萌發(fā)，萌發(fā)過程中內(nèi)部各種酶活力的動態(tài)變化，可間接反映種子發(fā)芽的長勢。種子萌發(fā)過程，這一系列相關(guān)酶活力變化，是植物整個生命活動周期里最為強烈的一個階段[11]，可以反映出硝化抑制劑對植物生長發(fā)育的影響。本試驗采用培養(yǎng)皿發(fā)芽法，研究DCD、DMPP對黃瓜種子發(fā)芽率、淀粉酶、過氧化氫酶（CAT）、過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量的影響，以了解其對黃瓜種子發(fā)芽的影響，為明確設(shè)施黃瓜栽培中DCD、DMPP的合理使用量提供理論依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

黃瓜種子（津研4號，購自淮安市農(nóng)科院）;3，4-二甲基吡唑磷酸鹽（DMPP）、雙氰胺（DCD），均為國藥分析純。

1.2 ?試驗設(shè)計

選取飽滿無蟲害的黃瓜種子，經(jīng)1%次氯酸鈉溶液浸泡消毒30 min，充分洗凈后浸種4 h，然后轉(zhuǎn)入鋪有濾紙的培養(yǎng)皿中，上覆雙層紗布，保持濕度，置于人工氣候箱中28 ℃條件下培養(yǎng)發(fā)芽。

設(shè)置DCD、DMPP兩個試驗組，分別設(shè)置5個處理，其中DCD試驗組設(shè)置T1（1 μmol·mL-1）、T2（3 μmol·mL-1）、T3（5 μmol·mL-1）、T4（7 μmol·mL-1）、T5（10 μmol·mL-1）5個濃度處理;DMPP試驗組設(shè)置T1（0.1 μmol·mL-1）、T2（0.3 μmol·mL-1）、T3（0.5 μmol·mL-1）、T4（0.7 μmol·mL-1）、T5（1 μmol·mL-1）5個濃度處理;試驗組黃瓜種子第一天噴施不同濃度梯度的硝化抑制劑溶液，之后每天在固定時間噴施等量的去離子水;兩試驗組均以噴施去離子水的黃瓜種子為對照（CK）;試驗各處理均設(shè)3次重復。分別統(tǒng)計第3天和第6天各處理組黃瓜種子的發(fā)芽數(shù)量，并計算發(fā)芽勢及發(fā)芽率。

黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率計算公式為：

種子發(fā)芽勢=（第3天發(fā)芽數(shù)/總數(shù)）×100%;

種子發(fā)芽率=（第6天發(fā)芽數(shù)/總數(shù)）×100%。

1.3 ?測定項目

在種子發(fā)芽率試驗基礎(chǔ)上，分別篩選確定兩個試驗組中的3個處理，進一步檢測不同濃度的DCD和DMPP處理條件下黃瓜種子的淀粉酶活性、抗氧化酶活性及MDA含量等生理指標，每處理設(shè)3個重復。分別采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定淀粉酶活性[12]，紫外吸收法測定CAT活性[13]，氮藍四唑染色法測定SOD活性[14]，愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[12]，硫代巴比妥酸法測定MDA含量[15]。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?對黃瓜種子發(fā)芽率的影響

由表1可知，DCD試驗組中，與CK相比，T1、T2處理的黃瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率與其差異不明顯，而T3、T4、T5處理的黃瓜種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率均顯著下降（P<0.05），T5處理組黃瓜種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率分別降低至84.67%和93.67%，顯著低于CK和其他處理。DMPP試驗組呈現(xiàn)出與DCD試驗組相似的結(jié)果，即在T1、T2處理條件下，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率與CK差異不顯著，而隨著DMPP處理濃度的增高，黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率顯著降低（P<0.05），T5處理條件下黃瓜種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率達到最低值，分別為81.67%、83.00%。由此可見，在一定范圍內(nèi)，低濃度DCD溶液、DMPP溶液對黃瓜種子發(fā)芽無明顯抑制作用，而高濃度的DCD溶液、DMPP溶液則會抑制黃瓜種子發(fā)芽，顯著降低種子發(fā)芽率。

2.2 ?對黃瓜種子淀粉酶活性的影響

由表2可知，在DCD試驗組中，CK、T1、T3、T5處理之間的差異顯著（P<0.05），其中T1處理的黃瓜種子淀粉酶顯著高于CK，達到798.85 U·g-1，并隨著DCD處理濃度的增加，黃瓜種子的淀粉酶活性均有所降低，當DCD溶液濃度為10 μmol·mL-1時，種子淀粉酶活性降至最低，為530.26 U·g-1。而在DMPP試驗組中，T1、T3處理的黃瓜種子淀粉酶活性與對照組差異不顯著，T5處理的黃瓜種子淀粉酶活性為738.73 U·g-1，顯著低于CK（P<0.05）。綜合分析，低濃度的DCD提高了黃瓜種子萌發(fā)時的淀粉酶活性，高濃度的DCD則會抑制其活性;DMPP處理下，表現(xiàn)出低濃度的DMPP對淀粉酶活性無顯著影響，而高濃度DMPP則會抑制其活性。

2.3 ?對黃瓜種子CAT活性的影響

如表3所示，DCD試驗組中，T1、T3處理黃瓜種子的CAT活性明顯增加，極顯著高于CK（P<0.01），當DCD溶液濃度為1 μmol·mL-1時，黃瓜種子的CAT活性最高，為357.49 U·g-1;而在10 μmol·mL-1 DCD溶液的處理條件下，黃瓜種子的CAT活性則降低至192.83 U·g-1，顯著低于CK（P<0.01）。DMPP試驗組中，CK和T1處理之間的CAT活性差異不顯著，但T3、T5處理的CAT活性則極顯著低于CK（P<0.01），隨著DMPP濃度升高，CAT活性呈現(xiàn)明顯下降趨勢，當DMPP濃度為1 μmol·mL-1時，其CAT活性最低，為136.14 U·g-1。以上結(jié)果表明，低濃度的DCD可以增加種子萌發(fā)時的CAT活性，而低濃度的DMPP對黃瓜種子的CAT活性無明顯影響;但隨著DCD、DMPP處理濃度的升高，黃瓜種子的CAT活性則會受到一定程度的抑制。

2.4 ?對黃瓜種子POD活性的影響

由表4可見，DCD溶液處理條件下，黃瓜種子的POD活性呈現(xiàn)先升后降的趨勢，各處理之間差異達到1%極顯著水平;T1處理的黃瓜種子POD活性最高，為78.24 U·g-1，T3、T5處理黃瓜種子的POD活性均有所下降，極顯著低于CK（P<0.01）;當DCD濃度為10 μmol·mL-1時，種子的POD活性降至最低，為43.26 U·g-1。在DMPP處理條件下，T1處理的種子POD活性與CK差異不顯著，但T3、T5處理的POD活性呈現(xiàn)明顯下降趨勢，其中T5處理（1 μmol·mL-1）的POD活性降至52.00 U·g-1，極顯著低于CK（P<0.01）。

2.5 ?對黃瓜種子SOD活性的影響

由表5可知，在DCD、DMPP處理條件下，黃瓜種子的SOD活性均呈現(xiàn)出先升后降的趨勢。DCD試驗組中，T1處理的黃瓜種子SOD活性極顯著高于CK（P<0.01），T3、T5處理的SOD活性極顯著低于CK（P<0.01），隨濃度升高呈明顯下降趨勢，當DCD濃度為10 μmol·mL-1時，種子的SOD活性最低，為19.41 U·g-1。DMPP試驗組中，T1處理黃瓜種子的SOD活性與CK差異不顯著，而T3、T5處理與CK之間的SOD活性差異達到1%極顯著水平，其中T3處理的黃瓜種子SOD活性最高，為95.89 U·g-1，T5處理的黃瓜種子SOD活性顯著降低至70.58 U·g-1。

2.6 ?對黃瓜種子MDA含量的影響

試驗結(jié)果顯示，DCD試驗組和DMPP試驗組中，黃瓜種子的MDA含量呈現(xiàn)相同的變化趨勢（見表6）。即CK、T1、T2這3個處理組之間的黃瓜種子MDA含量差異不顯著，但T3處理的黃瓜種子MDA含量極顯著高于其他處理（P<0.01）。綜合分析，試驗設(shè)置的濃度范圍內(nèi)，高濃度的DCD或DMPP可能會導致黃瓜種子的細胞結(jié)構(gòu)損傷，而低濃度的DCD或DMPP處理，則無明顯影響。

3 ?結(jié)論與討論

試驗結(jié)果表明，DCD、DMPP處理濃度較高時，會對黃瓜種子的萌發(fā)產(chǎn)生負面作用，在田間實際使用時需要謹慎控制添加量;在黃瓜種子的發(fā)芽期，建議DCD的施用量控制在1～5 μmol·mL-1，DMPP施用量控制在0.1～0.5 μmol·mL-1，較為安全。同時，再配施一定量的氮肥可以有效提高黃瓜種子的發(fā)芽與幼苗生長效率。

淀粉酶主要作用于淀粉分子的α-1，4糖苷鍵，種子發(fā)芽時期，需要水解大量的淀粉，為后續(xù)幼苗發(fā)育提供堅實的物質(zhì)基礎(chǔ)和大量的能量[16]。淀粉酶活性降低時，會導致能量供應(yīng)不足，影響植物生長。植物種子發(fā)芽時，代謝旺盛，會生成很多的中間代謝產(chǎn)物，如大量的活性氧[17]，細胞內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)可以抵御上述活躍化合物的攻擊，CAT可以分解H2O2，從而阻止了H2O2與其他物質(zhì)的結(jié)合形成對細胞的有害產(chǎn)物[17-19]，當CAT活性降低時，H2O2分解速率將降低，其在體內(nèi)積累，對植物體產(chǎn)生一些毒害作用。因此，CAT活性的高低可間接反映出種子活力的高低，它們之間呈正相關(guān)的關(guān)系。POD也能夠?qū)2O2還原成H2O，從而保護細胞，然而在逆境下，POD會參與活性氧的生成，對細胞膜有破壞作用，因此可作為評價組織衰老程度的一種生理指標[18]。SOD能夠催化超氧陰離子自由基形成毒性較小的過氧化氫，進而被CAT分解，是保護細胞膜系統(tǒng)最重要的一種酶[20]。MDA是膜脂過氧化后的產(chǎn)物，它可與蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)結(jié)合，形成褐色沉積物，從而干擾細胞正常的生命活動[21]，其含量高低可間接反映種子受到傷害的程度。

在明確了黃瓜種子對DCD、DMPP的施用敏感濃度范圍基礎(chǔ)上，本試驗進一步探究兩種硝化抑制劑施用條件下，黃瓜幼芽中淀粉酶、抗氧化酶活性等相關(guān)生理指標的變化，這些變化是黃瓜種子受到脅迫時做出的生理反應(yīng)。從試驗結(jié)果來看，1μmol·mL-1的DCD溶液便會觸發(fā)種子細胞的保護機制，細胞可能動用各類途徑，提高了相關(guān)酶的活性，使自身活性氧維持正常水平，隨著濃度升高（5 μmol·mL-1），淀粉酶、SOD等活性下降，這可能是受到了DCD的脅迫，但通過MDA含量與發(fā)芽率表現(xiàn)看，種子未表現(xiàn)出受到損傷，這可能是因為淀粉酶活性的下降，導致細胞代謝速率降低，細胞內(nèi)產(chǎn)生活性氧的水平不高，仍能被清除，當DCD濃度達到10 μmol·mL-1時，淀粉酶與三種保護性酶活性降至最低，MDA含量上升，顯示細胞可能受到了一定程度的損害。而低濃度的DMPP（0.1 μmol·mL-1）對黃瓜種子各生理指標無明顯作用，隨著DMPP濃度的增加（0.5 μmol·mL-1），毒害作用可能加強，組織內(nèi)的活性氧含量迅速上升，激活了應(yīng)激反應(yīng)，刺激了SOD活性增強，CAT、POD活性雖有降低，但仍可使細胞內(nèi)活性氧水平維持穩(wěn)定，發(fā)芽率、淀粉酶活和MDA含量也輔證了這一點。當DMPP濃度達到最高時（1.0 μmol·mL-1），細胞內(nèi)的抗氧化酶活性大幅下降，活性氧積累增加，MDA含量升高，種子發(fā)芽率下降，細胞受到損傷。

有學者研究發(fā)現(xiàn)，對花生苗期施用硫脲，隨著濃度升高，幼苗的生長與相關(guān)生理指標表現(xiàn)出低促高抑的現(xiàn)象，即低濃度硫脲對苗期花生生長有益，高濃度會抑制其生長[8];也有報道顯示，在大豆苗期中使用硫脲，低濃度的情況下就對其生長與相關(guān)酶活產(chǎn)生了抑制，高濃度情況下，抑制效果更為明顯[10]。對小麥的研究結(jié)果顯示，硫脲對小麥種子和幼苗的毒性相對較大，而DCD的毒性相對較小[9]。本試驗結(jié)果：高濃度的DCD、DMPP均會對黃瓜種子的相關(guān)生理指標產(chǎn)生一定的負面影響，降低種子的發(fā)芽率，也證明過量使用硝化抑制劑，會對作物產(chǎn)生損害。

相對于環(huán)境穩(wěn)定的試驗室環(huán)境，田間具有更多的不確定因素，此外，不同的黃瓜品種及遺傳背景對硝化抑制劑耐受性的表現(xiàn)可能也會有所不同，因此，DCD、DMPP的安全用量與最佳施用濃度尚有待開展田間試驗進一步完善。目前，國內(nèi)學者對硝化抑制劑的研究大部分集中在對環(huán)境與經(jīng)濟效益方面，關(guān)于硝化抑制劑的毒理研究較少，并且DCD、DMPP影響黃瓜種子相關(guān)生理指標變化的具體機制也有待進一步研究。

參考文獻：

[1] 朱淑新，梁魁景.不同pH值處理對蔬菜種子發(fā)芽和幼苗生長的影響[J].現(xiàn)代農(nóng)村科技，2020（3）：68-70.

[2] 俞巧鋼，殷建禎，馬軍偉，等.硝化抑制劑3，4-二甲基吡唑磷酸鹽應(yīng)用研究進展及其影響因素[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2014，33（6）：1057-1066.

[3] 張苗苗，沈菊培，賀紀正，等.硝化抑制劑的微生物抑制機理及其應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2014，33（11）：2077-2083.

[4] 伍少福，吳良歡，尹一萌，等.含硝化抑制劑復合肥對西瓜黃瓜產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2006（6）：1432-1435.

[5] 趙歐亞，張春鋒，孫世友，等.含硝化抑制劑型水溶肥對溫室黃瓜產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].華北農(nóng)學報，2017，32（S1）：233-238.

[6] 張琳，孫卓玲，馬理，等.不同水氮條件下雙氰胺（雙氰胺）對溫室黃瓜土壤氮素損失的影響[J].植物營養(yǎng)與肥料學報，2015，21（1）：128-137.

[7] 趙婉伊，徐衛(wèi)紅，王崇力，等.脲酶-硝化抑制劑緩釋肥對不同土壤氮素釋放特性及黃瓜NPK吸收利用的影響[J]. 水土保持學報，2017，31（3）：250-257.

[8] 王文，周細紅，廖柏寒，等.硫脲對花生苗期的毒理效應(yīng)研究[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學學報，2009，28（7）：1363-1367.

[9] 奉小憂，曾清如，皮荷杰，等.3種硝化抑制劑對小麥幼苗生長毒性的比較[J].生態(tài)毒理學報，2010（2）：268-273.

[10] 王文，楊波.硫脲對大豆苗期的毒理效應(yīng)[J].應(yīng)用與環(huán)境生物學報，2015，21（1）：175-180.

[11] 張蕙心，司龍亭，唐慧珣.黃瓜種子萌發(fā)中淀粉酶、脂肪酶和過氧化物酶活性變化[J].沈陽農(nóng)業(yè)大學學報，2014，45（1）：83-86.

[12] 李合生.植物生理生化實驗原理和技術(shù)[M].北京：高等教育出版社，2000：164-172.

[13] 李宏文，史綺，曹陽，等.紫外光對幾種水生植物過氧化氫酶（過氧化氫酶）活性的影響[J].環(huán)境科學，1993（4）：74-77，95.

[14] 鄒琦.植物生理生化實驗指導[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1995：97-99.

[15] 湯章城.現(xiàn)代植物生理學實驗指南[M].北京：科學出版社，1999：305-306.

[16] 朱建華.作物發(fā)芽種子淀粉酶活性變化的研究[J].寧波職業(yè)技術(shù)學院學報，2014，18（3）：87-89，93.

[17] 劉文瑜，楊宏偉，魏小紅，等.外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及抗氧化酶的研究[J].草業(yè)學報，2015，24（2）：85-95.

[18] 尹永強，胡建斌，鄧明軍.植物葉片抗氧化系統(tǒng)及其對逆境脅迫的響應(yīng)研究進展[J].中國農(nóng)學通報，2007（1）：105-110.

[19] 高海寧，馬國泰，李彩霞，等.菌劑對鉻（Ⅵ）污染土壤中坪草幼苗生理生化的影響[J].草業(yè)學報，2014，23（4）：189-194.

[20] 孫立榮，郝福順，呂建洲，等.外源一氧化氮對鹽脅迫下黑麥草幼苗生長及生理特性的影響[J].生態(tài)學報，2008（11）：5714-5722.

[21] 孫涌棟，羅未蓉，李新崢，等.Ca2+對黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生理特性的影響[J].西南農(nóng)業(yè)學報，2008（3）：629-632.

（責任編輯：易 ?婧）

收稿日期：2021-12-07

基金項目：江蘇省大學生實踐創(chuàng)新訓練計劃項目（202010323015Z）。

作者簡介：劉昌森（1999—），男，江蘇淮安人，主要從事植物營養(yǎng)與生理方面研究。E-mail： 1902180053@stu.hytc.edu.cn。

*為通信作者，E-mail： wjyang@hytc.edu.cn。