張 彤,周 妍,吳 巍

(首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系,北京 100069;*通訊作者,E-mail:weiwu207@ccmu.edu.cn)

蘿卜硫素(sulforaphane,SFN)是一種從十字花科植物中提取具有抗癌潛力的化合物[1]。研究表明,在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)中,SFN能觸發(fā)微管斷裂,抑制自噬溶酶體的形成導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,但SFN抑制自噬溶酶體形成的機(jī)制尚未明確[2]。

研究表明,自噬參與囊泡的形成、運(yùn)輸和融合,而膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白作為介導(dǎo)溶質(zhì)、離子或藥物跨生物膜選擇性轉(zhuǎn)運(yùn)的重要跨膜蛋白,與囊泡運(yùn)輸和融合密切相關(guān)[3]。其中,RAB7蛋白作為轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,在細(xì)胞內(nèi)的準(zhǔn)確定位決定其所介導(dǎo)的囊泡能否正確抵達(dá)目的細(xì)胞器。RAB7交互溶酶體蛋白(RILP)是RAB7蛋白下游的效應(yīng)蛋白,定位在溶酶體[4]。RAB7與GTP結(jié)合將RILP運(yùn)送到細(xì)胞膜中,共同控制晚期內(nèi)體和溶酶體的轉(zhuǎn)運(yùn)[5,6]。

溶酶體的功能與溶酶體膜蛋白有著密切的關(guān)系。其中,ATP6V0D1為溶酶體膜蛋白,具有質(zhì)子泵的作用,為溶酶體水解酶提供酸性環(huán)境,影響溶酶體功能進(jìn)而調(diào)控自噬途徑[7]。我們推測,SFN通過調(diào)控RILP及溶酶體膜蛋白ATP6V0D1抑制自噬溶酶體的形成。本研究通過生物信息學(xué)結(jié)合免疫熒光染色及蛋白免疫印跡技術(shù)研究SFN對RILP及ATP6V0D1的調(diào)控作用,探討在非小細(xì)胞肺癌中SFN抑制自噬溶酶體形成的分子機(jī)制,以便為腫瘤靶向治療提供有效策略。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株與試劑

人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549細(xì)胞購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)細(xì)胞中心;SFN購自美國Santa Cruz公司,β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology公司;RILP抗體、LAMP1抗體購自美國Proteintech公司。

1.2 激光掃描共聚焦顯微鏡分析

將處于對數(shù)生長期的A549細(xì)胞接種于免疫熒光專用的共聚焦小皿內(nèi)。待共聚焦小皿中A549細(xì)胞密度達(dá)到60%左右后,棄去舊培養(yǎng)基,置換成新鮮的含10%胎牛血清的培養(yǎng)基,對照組不做任何處理,實(shí)驗(yàn)組加入SFN,使其終濃度為20 μmol/L,誘導(dǎo)細(xì)胞24 h。棄去舊培養(yǎng)基,經(jīng)固定、透化、封閉操作后,根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求將抗RILP抗體(1 ∶200)、抗LAMP1抗體(1 ∶200)加入共聚焦小皿在4 ℃冰箱靜置孵育過夜。隨后加入二抗室溫避光孵育1 h,然后滴加三到四滴含DAPI的防熒光淬滅封片劑封片,于濕潤避光處保存。在激光掃描共聚焦顯微鏡下隨機(jī)尋找視野觀察目的蛋白的熒光強(qiáng)度及定位,并拍照。

1.3 高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用分析蛋白表達(dá)差異

用高效液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析SFN處理后肺腺癌細(xì)胞A549中蛋白差異表達(dá)。將肺腺癌A549分為SFN組與未處理組(對照組)。使用20 μmol/L SFN處理肺腺癌細(xì)胞A549 24 h,收集細(xì)胞裂解液并定量。對照組與SFN組使用等量的蛋白上樣,每組樣品有3個重復(fù)樣本。通過Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀和EASY-nLC 1000液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行色譜分離和分析,該系統(tǒng)配備了電噴霧電離源。使用C18(1.9 μm,100 A)毛細(xì)管柱,流動相為0.1%甲酸/水和0.1%甲酸/乙腈進(jìn)行分離,并以正電離模式進(jìn)行檢測。收集數(shù)據(jù)后,通過Uniprot網(wǎng)站分析蛋白質(zhì)的細(xì)胞定位和功能。

1.4 蛋白免疫印跡技術(shù)檢測RILP蛋白的表達(dá)

分別加入0,10,20,30 μmol/L SFN處理A549細(xì)胞24 h后,使用含有蛋白酶抑制劑的RIPA緩沖液(Thermo Fisher Scientific,USA)裂解細(xì)胞,通過12% SDS-PAGE電泳分離對應(yīng)樣品中等量的蛋白質(zhì)分子(20 μg),根據(jù)目的蛋白分子量觀察對應(yīng)蛋白Marker的分離情況,一般在溴酚藍(lán)到達(dá)分離膠底部時轉(zhuǎn)膜,最后使用Odyssey Software Version啟動成像系統(tǒng)檢測不同濃度SFN處理后RILP(1 ∶1 000),β-actin(1 ∶5 000)蛋白的表達(dá)。

1.5 生物信息學(xué)分析

使用UALCAN數(shù)據(jù)庫分析肺癌與癌旁組織蛋白差異表達(dá);用ONCOLNC數(shù)據(jù)庫分析肺癌患者中RILP、ATP6V0D1蛋白表達(dá)與生存期的關(guān)聯(lián);用STRING數(shù)據(jù)庫(10.5版)來分析RILP與微管蛋白TUBB/TUBA1A、LC3Ⅱ之間的相互作用;用GEPIA數(shù)據(jù)庫分析RILP、ATP6V0D1、LC3Ⅱ蛋白間的相關(guān)性。

1.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)

2 結(jié)果

2.1 SFN誘導(dǎo)溶酶體核周聚集

免疫共聚焦熒光顯微鏡觀察顯示:對照組溶酶體散在、均一分于細(xì)胞質(zhì)中;SFN組SFN處理細(xì)胞后溶酶體團(tuán)成一簇聚集在核周(見圖1)。

紅色熒光表示溶酶體相關(guān)膜蛋白LAMP1;藍(lán)色熒光表示細(xì)胞核染料DAPI圖1 SFN對溶酶體核周聚集的影響Figure 1 Effect of SFN on the perinuclear aggregation of lysosomes

2.2 SFN誘導(dǎo)上調(diào)的蛋白富集到膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路

液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析表明:在SFN處理的A549細(xì)胞中,380個蛋白表達(dá)上調(diào)(紅色),同時278個蛋白表達(dá)下調(diào)(綠色),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖2A);利用Uniprot網(wǎng)站預(yù)測這些差異蛋白的功能與亞細(xì)胞定位,同時對上調(diào)的蛋白進(jìn)行聚類分析發(fā)現(xiàn)SFN處理后蛋白富集到膜轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)通路(見圖2B)。

A.火山圖分析蛋白表達(dá)差異 B.Uniprot網(wǎng)站中蛋白聚類分析圖2 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用分析差異蛋白的功能Figure 2 Function of differential proteins by liquid chromatography and mass spectrometry

2.3 SFN上調(diào)RILP及RILP與微管蛋白的相互作用

使用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測SFN處理A549細(xì)胞后RILP蛋白的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)隨著SFN濃度的升高RILP的表達(dá)水平逐漸上升,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見圖3A),表明SFN對RILP表達(dá)的調(diào)節(jié)呈濃度依賴性。同時該蛋白與微管蛋白TUBB/TUBA1A有相互作用(見圖3B)。

與0 μmol/L比較,*P<0.05B.STRING數(shù)據(jù)庫中PPI網(wǎng)絡(luò)分析A.SFN上調(diào)A549細(xì)胞中RILP蛋白表達(dá)圖3 SFN處理后RILP的表達(dá)及RILP與TUBB/TUBA1A蛋白表達(dá)關(guān)聯(lián)Figure 3 The expression of RILP after SFN treatment and the association of RILP with TUBB/TUBA1A protein

2.4 RILP的表達(dá)與肺癌患者生存率有相關(guān)性

TCGA數(shù)據(jù)分析顯示RILP在肺腺癌和肺鱗癌組織中較正常組織表達(dá)顯著降低(P<0.05,見圖4A)。且ONCOLNC數(shù)據(jù)庫顯示高表達(dá)RILP的肺癌患者生存率高(P<0.05,見圖4B)。

A.TCGA數(shù)據(jù)庫中RILP蛋白的表達(dá)B.ONCOLNC數(shù)據(jù)庫中NSCLC患者生存曲線分析圖4 RILP在肺癌中的表達(dá)及RILP蛋白高表達(dá)的肺癌患者生存曲線Figure 4 The expression of RILP in lung cancer and the survival curve of lung cancer patients with high RILP expression

2.5 RILP與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的相關(guān)性

STRING數(shù)據(jù)庫顯示,RILP與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ(基因名:MAP1LC3B)存在相互作用(見圖5A),TCGA數(shù)據(jù)庫分析顯示在肺鱗癌與肺腺癌中RILP與LC3Ⅱ的表達(dá)呈正相關(guān)(肺腺癌:r=0.20,P<0.01;肺鱗癌:r=0.37,P<0.01,見圖5B)。

2.6 肺癌中RILP與ATP6V0D1的相關(guān)性

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示在肺鱗癌和肺腺癌中RILP與ATP6V0D1呈正相關(guān)(肺腺癌:r=0.37,P<0.01;肺鱗癌:r=0.54,P<0.01,見圖6)。

2.7 ATP6V0D1上調(diào)自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的表達(dá)

ONCOLNC數(shù)據(jù)庫顯示ATP6V0D1在肺腺癌和肺鱗癌中表達(dá)較正常組織顯著降低(P<0.05),且ONCOLNC數(shù)據(jù)庫顯示ATP6V0D1高表達(dá)的患者生存率顯著提高(P<0.05,見圖7)。

A.STRING數(shù)據(jù)庫中PPI網(wǎng)絡(luò)分析B.TCGA數(shù)據(jù)庫中基因相關(guān)性分析圖5 肺癌患者中RILP與LC3Ⅱ的相關(guān)性分析Figure 5 Correlation between RILP and LC3Ⅱ in lung carcinoma patients

A.肺腺癌B.肺鱗癌圖6 TCGA數(shù)據(jù)庫分析RILP與ATP6V0D1在肺腺癌和肺鱗癌中的相關(guān)性Figure 6 Correlation between RILP and ATP6V0D1 in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma by TCGA database

B.ONCOLNC數(shù)據(jù)庫中NSCLC患者生存曲線分析A.TCGA數(shù)據(jù)庫中ATP6V0D1蛋白表達(dá)分析圖7 ATP6V0D1在肺癌的表達(dá)及ATP6V0D1高表達(dá)的肺癌患者生存曲線Figure 7 The expression of ATP6V0D1 in lung cancer and the survival curve of lung cancer patients with high ATP6V0D1 expression

2.8 肺癌中ATP6V0D1與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的相關(guān)性

TCGA數(shù)據(jù)庫顯示在肺鱗癌和肺腺癌中,ATP6V0D1與自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ呈正相關(guān)(肺腺癌:r=0.48,P<0.01;肺鱗癌:r=0.57,P<0.01,見圖8)。

A.肺腺癌患者基因相關(guān)性分析B.肺鱗癌患者基因相關(guān)性分析圖8 TCGA數(shù)據(jù)庫分析肺腺癌和肺鱗癌患者ATP6V0D1與LC3Ⅱ的相關(guān)性分析Figure 8 Correlation between ATP6V0D1 and LC3Ⅱ in lung adenocarcinoma and lung squamous cell carcinoma by TCGA database

3 討論

既往研究發(fā)現(xiàn)SFN是一種有潛力的抗癌活性物質(zhì),通過調(diào)節(jié)自噬誘導(dǎo)凋亡并能抑制多種腫瘤細(xì)胞增殖、浸潤[8]。本研究我們進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)SFN可以上調(diào)RILP的表達(dá),增強(qiáng)RILP與溶酶體ATP6V0D1蛋白及LC3Ⅱ的關(guān)聯(lián),從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞自噬體與溶酶體融合。這些研究結(jié)果對于我們分析SFN調(diào)節(jié)的自噬機(jī)制及其潛在的抗癌靶點(diǎn)提供了新的思路。

自噬是一種重要的細(xì)胞降解過程,其中功能失調(diào)的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)容物被溶酶體水解酶消化。在自噬過程中,伴隨著一些囊泡的融合,包括自噬體和溶酶體的融合,導(dǎo)致自噬溶酶體中的內(nèi)容物降解和清除[9]。實(shí)驗(yàn)室前期結(jié)果顯示,SFN及其代謝物可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞形成自噬體,同時抑制自噬體與溶酶體的融合,阻礙腫瘤細(xì)胞內(nèi)的錯誤折疊蛋白和受損細(xì)胞器的降解,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[10]。

RILP蛋白作為溶酶體膜蛋白,通過與其上游蛋白RAB7相互作用,調(diào)節(jié)核內(nèi)體和溶酶體之間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)并參與自噬小體的成熟,同時有文獻(xiàn)報道其在自噬溶酶體形成中也扮演著至關(guān)重要的作用[11]。生物信息學(xué)分析顯示RILP高表達(dá)的肺癌患者生存率顯著升高,這意味著RILP是一個抑癌蛋白,上調(diào)RILP可能成為治療肺癌的新方向。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示:SFN上調(diào)RILP蛋白的表達(dá);同時免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SFN誘導(dǎo)溶酶體在核周聚集,這提示我們在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中,SFN可能通過調(diào)節(jié)RILP蛋白誘導(dǎo)溶酶體向核周聚集。研究表明,SFN靶向細(xì)胞中多種蛋白,其中以α-tubulin蛋白為主。SFN可以與α-tubulin共價結(jié)合,破壞其二級和三級結(jié)構(gòu),抑制微管聚合,從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[12]。為了研究RILP蛋白與自噬之間的關(guān)聯(lián),我們使用TCGA數(shù)據(jù)庫分析RILP蛋白與自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)RILP蛋白可與LC3Ⅱ、tubulin相互作用,這進(jìn)一步證明在非小細(xì)胞肺癌中,RILP蛋白能夠調(diào)控自噬溶酶體形成,并且微管蛋白tubulin可能調(diào)控RILP蛋白介導(dǎo)的自噬。

溶酶體作為細(xì)胞內(nèi)的“清道夫”,可以與自噬體融合,從而消化細(xì)胞內(nèi)受損的細(xì)胞器,與溶酶體膜上蛋白質(zhì)復(fù)合體V-ATPase密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),V-ATPase具有質(zhì)子泵的活性,能為溶酶體水解酶提供酸性環(huán)境,從而維持溶酶體正常功能[13]。有文獻(xiàn)報道RILP可以通過調(diào)控V-ATPase進(jìn)而影響溶酶體的功能,而ATP6V0D1作為V-ATPase中的一種亞基,在膜轉(zhuǎn)運(yùn)以及膜融合方面扮演著重要的角色[14,15]。生物信息學(xué)分析顯示ATP6V0D1與LC3Ⅱ在肺腺癌和肺鱗癌的表達(dá)均呈正相關(guān),LC3Ⅱ蛋白作為一種微管相關(guān)蛋白,主要存在于自噬體膜上,并在自噬溶酶體的形成中發(fā)揮作用,這提示我們ATP6V0D1在自噬溶酶體形成中也扮演著重要的角色。同時,ATP6V0D1高表達(dá)的肺癌患者生存率顯著升高,這表明ATP6V0D1是一個抑癌蛋白,可能成為治療肺癌的新靶點(diǎn)。

綜上所述,我們證明SFN在亞細(xì)胞水平抑制自噬溶酶體形成的機(jī)制,這些結(jié)果可以為開發(fā)新的抗癌療法提供理論支持。