余雪嫣，黃 雪，李雨芯，羅毅華

（廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院老年病學消化內(nèi)科，廣西南寧 530021）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis, UC）是一種慢性非特異性炎癥性疾病，病變主要累及結(jié)直腸黏膜及黏膜下層，表現(xiàn)有腹痛、腹瀉、黏液膿血便及體重減輕等，嚴重影響患者生活質(zhì)量。目前，UC 發(fā)病率逐年上升，因其反復發(fā)作，現(xiàn)有的治療手段無法完全治愈，大部分患者須終身服藥，已被世界衛(wèi)生組織列為現(xiàn)代難治病之一[1]。近年由于我國民眾的生活習慣和生存環(huán)境的改變，國家醫(yī)療診斷技術(shù)的標準化和規(guī)范化，UC 的檢出率迅速上升[2]。迄今為止，UC 的病因尚未完全明確，目前認為可能由環(huán)境、腸道菌群、結(jié)腸免疫功能異常等多重因素相互影響[3]。因此，開展UC 的發(fā)病機制及藥物治療方面研究日益迫切。動物模型是研究過程中不可或缺的手段，構(gòu)建理想且成熟穩(wěn)定的動物模型對UC 發(fā)病機制、疾病發(fā)展規(guī)律、診療手段及新藥的研究和開發(fā)均有重要的研究意義。

白芨是一種傳統(tǒng)中藥，具有止血、消腫和促進組織再生等功效，廣泛用于臨床，已有文獻報道臨床上應(yīng)用白芨聯(lián)合其他中藥或西藥治療UC 患者均取得了較好的療效[4]。白芨多糖（Bletilla striata polysaccharide, BSP）是一種水溶性多糖，是白芨的主要生物活性物質(zhì)，具有抗炎、抗?jié)?、保護黏膜、促進傷口愈合及免疫調(diào)節(jié)活性等多種藥理作用，提示BSP 在臨床中具有廣泛的應(yīng)用前景及研究價值[5]。已有研究表明，BSP 對UC 動物模型具有良好的治療作用，但BSP 對UC 的作用機制尚未完全明確，具有廣闊的研究空間。

目前研究BSP 對UC 作用的文獻中，對于UC 動物模型的選擇尚不統(tǒng)一。黎笑蘭等[6]采用三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）作用于SD大鼠，柯昌毅等[7]和時松等[8]選用惡唑酮（oxazolidone, OXZ）作用于不同品系的小鼠，而王川[9]采用乙醇作用于SD 大鼠。各個模型使用的藥物和操作手法差別過大，很難保證實驗的穩(wěn)定性和可靠性。同時，以上文獻在進行BSP 對UC 作用研究時，對BSP濃度的選擇也差別較大，對最佳藥物濃度并未探討。本研究通過數(shù)次實驗探索，旨在建立最佳的UC 動物模型，并尋找BSP 對該模型最佳的作用條件和劑量，有利于后續(xù)研究者直接快速地建立模型，減少花費并提高效率。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑

健 康SPF 級C57BL/6 小 鼠48 只，雄 性，8 周 齡，體質(zhì)量22～24 g，由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，許可證號：SCXK 桂2014-0002。室內(nèi)溫度21～25 ℃，相對濕度（50±10）%，12 h 光照/黑暗循環(huán)，按照3R原則對實驗動物給予人道關(guān)懷。BSP（純度70%，上海源葉生物科技有限公司），DSS（分子量36～50 ku，美國MP Biomedicals），柳氮磺吡啶腸溶片（Salazosulfapyridine, SASP，上海信誼天平藥業(yè)有限公司），大便隱血測定試劑盒（干化學法，美利泰格診斷試劑（嘉興）有限公司），Claudin-1單克隆抗體（Abcam公司），GAPDH抗體（Cell Signaling Technology 公司）等。

1.2 實驗分組及藥物干預

將小鼠隨機分為正常對照組、DSS 模型組及BSP 低、中、高劑量組和SASP 陽性對照組，每組各8 只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周。將DSS 溶于蒸餾水中配制成25 g/L 的DSS 溶液，且每2 天配制1 次新鮮的DSS 溶液，除正常對照組給予蒸餾水外，其余各組均采用自由飲用25 g/L 的DSS 溶液以誘導建立小鼠UC模型；連續(xù)飲用7 d，第8天開始全部換成蒸餾水。BSP 低、中、高（95、190、380 mg/kg）劑量組和SASP（320 mg/kg）陽性對照組在造模第2 天即開始灌胃給藥，灌胃量根據(jù)體質(zhì)量以10 μL/g 計算；正常對照組和DSS 模型組同樣按該比例灌胃生理鹽水；每天1 次，連續(xù)7 d，并保證每天給藥均在同一時段。

1.3 一般情況的觀察

實驗期間，每天觀察并詳細記錄各組小鼠的一般情況、活動反應(yīng)、精神狀態(tài)、體毛色澤、進食、飲水、體質(zhì)量變化、大便性狀、大便隱血/肉眼便血情況。比較各組小鼠的每日體質(zhì)量變化百分比（%）（每只每天同時段體質(zhì)量/第1 天體質(zhì)量）。

1.4 標本的采集處理及評估觀察

經(jīng)禁食12 h，于造模第9 天采用40 mL/L 的水合氯醛腹腔注射麻醉后處死。乙醇消毒腹部，用高壓消毒后的器械分離肛門至回盲部腸管，測量結(jié)腸長度，沿腸系膜緣縱軸剖開后迅速用4 ℃的生理鹽水將結(jié)腸沖洗干凈，將結(jié)腸平鋪于干燥濾紙上，肉眼觀察并拍攝記錄小鼠結(jié)腸炎癥嚴重程度及潰瘍情況，后續(xù)采用COOPER 等[10]評分標準，綜合體質(zhì)量變化、大便性狀和大便隱血/肉眼便血情況對各組小鼠每天情況進行DAI 評分。

選取病變明顯結(jié)腸段分成兩份，一份立即放入液氮中，過夜后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?；另一份置?0 g/L 的多聚甲醛固定液中固定24 h，常規(guī)制作4 μm 石蠟切片，經(jīng)HE 染色后在光學顯微鏡下觀察結(jié)腸組織形態(tài)學變化，并根據(jù)SHI 等[11]的評分標準對小鼠結(jié)腸組織切片進行組織病理學評分。

器械分離脾臟后，用濾紙吸干并稱重，計算脾臟指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量（mg）/小鼠體質(zhì)量（g）。

1.5 Western blotting 法檢測小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1 的表達

取小鼠結(jié)腸組織，用RIPA 裂解液裂解后勻漿，提取小鼠結(jié)腸組織總蛋白，并用BCA 法測得蛋白濃度；用120 g/L 的SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜后，在50 g/L 的脫脂牛奶中于搖床上室溫封閉1 h，然后將膜分別置于Claudin-1（1∶800）和GAPDH（1∶10 000）的一抗中4 ℃冰箱孵育過夜；次日，將膜置于熒光二抗（山羊抗兔IgG），搖床室溫避光孵育1 h 后，用近紅外熒光法，將膜放于Odyssey 雙色紅外激光掃膜儀，采用Licor Odyssey V3.0 軟件掃描圖片，再用ImageJ 軟件對條帶進行評估和量化。

1.6 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)均采用SPSS 25.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示。數(shù)據(jù)同時滿足正態(tài)分布和方差齊性條件時，采用單因素方差（ANOVA）分析，并采用LSD-t法進行兩兩比較；當數(shù)據(jù)不滿足正態(tài)分布和方差齊性時，采用非參數(shù)檢驗中的Kruskal-WallisH檢驗，多個樣本間的兩兩比較采用Nemenyi 法。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠的一般情況

正常對照組小鼠活動正常，反應(yīng)靈敏，精神狀態(tài)佳，毛發(fā)有光澤；進食飲水正常，體質(zhì)量呈上升趨勢；排便成型，無血便。DSS 模型組小鼠逐漸精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，倦怠懶動，毛發(fā)漸漸失去光澤；進食減少，體質(zhì)量明顯下降，逐漸出現(xiàn)大便隱血陽性或肉眼血便，部分有稀水樣便，提示造模成功。BSP 低、中、高劑量組小鼠在給藥干預后，上述表現(xiàn)較DSS 模型組均得到改善，而BSP 高劑量組改善最為明顯。

2.2 小鼠體質(zhì)量的變化

實驗結(jié)束時，與正常對照組相比，DSS 模型組小鼠體質(zhì)量明顯降低(P＜0.01)；與DSS 模型組相比，BSP高劑量組小鼠體質(zhì)量降低程度明顯減?。≒＜0.05，圖1，表1）。

圖1 BSP 對UC 小鼠體質(zhì)量的影響Fig.1 Effect of BSP on body weight of UC mice

2.3 各組小鼠DAI 評分的比較

實驗結(jié)束時，DSS 模型組小鼠DAI 評分較正常對照組顯著增加（P＜0.01）；與DSS 模型組比較，BSP 高劑量組小鼠DAI 評分明顯降低（P＜0.05，表1，圖2）。

圖2 BSP 對UC 小鼠DAI 評分的影響Fig.2 Effect of BSP on DAI score of UC mice

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化百分比和DAI 評分的比較Tab.1 Percentage of body mass change and DAI score of UC mice (±s, n=8）

表1 各組小鼠體質(zhì)量變化百分比和DAI 評分的比較Tab.1 Percentage of body mass change and DAI score of UC mice (±s, n=8）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與DSS 模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組DSS 模型組SASP 陽性對照組BSP 低劑量組BSP 中劑量組BSP 高劑量組體質(zhì)量變化(%)105.82±1.92 85.35±4.53*93.35±4.28*#90.71±3.76*92.03±5.85*#97.41±1.02*#DAI 評分0.00±0.00 3.98±0.78*2.78±0.50*#3.39±0.25*2.50±0.81*#2.17±0.43*#

2.4 各組小鼠脾臟指數(shù)的比較

與正常對照組比較，DSS 模型組小鼠脾臟腫大，脾臟指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與DSS 模型組比較，BSP 低、中、高劑量組小鼠脾臟腫大緩解，脾臟指數(shù)均降低（P＜0.05，圖3 和表2）。

圖3 BSP 對UC 小鼠結(jié)腸和脾臟的影響Fig.3 Effect of BSP on the colon and spleen of UC mice

2.5 各組小鼠結(jié)腸組織的大體形態(tài)改變及長度變化

正常對照組小鼠結(jié)腸長度正常，無充血水腫和潰瘍；與正常對照組比較，DSS 模型組小鼠結(jié)腸長度顯著縮短（P＜0.01），結(jié)腸充血紅腫明顯，局部有糜爛、出血，內(nèi)壁可見淺潰瘍灶，病變累及整段結(jié)腸；與DSS 模型組比較，BSP 低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸縮短程度均有減?。≒＜0.05），結(jié)腸充血紅腫的癥狀均有減輕，內(nèi)壁潰瘍灶明顯緩解，以BSP 高劑量組最為明顯（圖3 和表2）。

表2 BSP 對UC 小鼠結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)的影響Tab. 2 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colon length and spleen index of UC mice (±s, n=8）

表2 BSP 對UC 小鼠結(jié)腸長度和脾臟指數(shù)的影響Tab. 2 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colon length and spleen index of UC mice (±s, n=8）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與DSS 模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組DSS 模型組SASP 陽性對照組BSP 低劑量組BSP 中劑量組BSP 高劑量組結(jié)腸長度（cm）9.17±0.33 4.90±0.33*7.05±0.52*#5.73±0.40*#6.42±0.40*#6.92±0.44*#脾臟指數(shù)（mg/g）2.42±0.19 5.95±0.61*4.50±0.85*#4.52±0.98*#4.46±1.21*3.57±1.06*#

2.6 各組小鼠結(jié)腸組織的病理學評估

HE 染色結(jié)果顯示（圖4），正常對照組小鼠結(jié)腸黏膜上皮結(jié)構(gòu)完整，腺體結(jié)構(gòu)完整且排列整齊，基本不見炎性細胞浸潤；DSS 模型組小鼠結(jié)腸黏膜上皮嚴重破壞、結(jié)構(gòu)紊亂，腺體呈現(xiàn)變形甚至消失，隱窩萎縮扭曲，黏膜及其下層可見大量炎性細胞浸潤，偶有隱窩膿腫形成，提示成功構(gòu)建小鼠UC 模型。根據(jù)SHI 等[11]的評分標準，綜合炎癥程度、損傷深度、隱窩損傷程度對小鼠結(jié)腸組織切片進行組織病理學評分，每個組織切片隨機選取3 個以上高倍視野（×200），由2 人進行盲法評分，取平均值作為最終結(jié)果。與正常對照組比較，DSS 模型組小鼠結(jié)腸組織病理學評分明顯升高（P＜0.01）；與DSS 模型組比較，BSP 低、中、高劑量組小鼠結(jié)腸黏膜損傷程度均得到改善，組織病理學評分均有降低（P＜0.05），BSP 高劑量組降低最多，改善也最為明顯（表3）。

圖4 各組小鼠結(jié)腸組織的病理學改變Fig.4 The histopathological changes of the colon in mice of each group(HE staining,×200,ruler=50 μm）

表3 BSP 對UC 小鼠結(jié)腸組織病理學評分的影響Tab. 3 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colonic histopathological score of UC mice (±s，n=8）

表3 BSP 對UC 小鼠結(jié)腸組織病理學評分的影響Tab. 3 Effect of Bletilla striata polysaccharide on colonic histopathological score of UC mice (±s，n=8）

與正常對照組比較，*P＜0.01；與DSS 模型組比較，#P＜0.05。

組別正常對照組DSS 模型組SASP 陽性對照組BSP 低劑量組BSP 中劑量組BSP 高劑量組組織病理學評分1.11±0.75 9.11±0.83*5.28±0.68*#7.00±0.81*#5.50±0.96*#3.99±0.99*#

2.7 BSP對UC小鼠腸道Claudin-1蛋白表達的影響

Western blotting 檢測結(jié)果顯示，與正常對照組比較，DSS 模型組腸道緊密連接蛋白Claudin-1 表達明顯下降（P＜0.01）；與DSS 模型組比較，BSP 低、中、高劑量組緊密連接蛋白Claudin-1 表達均明顯增加（P＜0.05），其中BSP 高劑量組表達最接近正常組（圖5）。

圖5 各組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1 蛋白表達的比較Fig.5 Comparison of tight junction protein Claudin-1 expression in mouse colon

3 討 論

在開展實驗研究前應(yīng)根據(jù)研究方向及實際可行性等，應(yīng)充分考慮動物模型和造模方式的選擇。選擇合適的造模對象，摸索出可靠的造模濃度和方式等，有助于節(jié)省時間人力，建立高成功率的UC 模型。

目前，國內(nèi)外對UC 動物模型研究頗多?；蛐揎椃▽夹g(shù)和條件要求高，價格昂貴，且多為單一基因模型，無法完全模擬人類UC 疾病。自發(fā)型動物來源稀少，價格更貴。免疫誘導法造模周期長，操作復雜，對技術(shù)和條件要求也較高，成功率低。由于化學藥物誘導UC 模型的廉價、造模方法簡便、成功率較高，而被廣泛應(yīng)用。既往研究中，王川[9]采用乙酸誘導UC 模型，但該模型是利用其直接刺激作用而引起結(jié)腸出現(xiàn)急性化學損傷的單純性炎癥反應(yīng)，不能反映免疫學變化，且自愈性強，易導致與藥物療效評價相混[12]；黎笑蘭等[6]選用的TNBS 誘導大鼠UC 模型，炎癥時間長，缺乏急性期表現(xiàn)[13]，且TNBS 模型免疫反應(yīng)以Th1、Th17 反應(yīng)為主，組織學改變主要是跨膜炎癥和水腫[14]，與人類克羅恩病癥狀相似，故不適用于UC 的研究；柯昌毅等[7]和時松等[8]采用的OXZ 誘導UC 模型，建立的疾病維持時間短、自愈性強，同時還需進行皮膚預致敏操作[15]，故亦不做優(yōu)選。DSS 是一種易溶于水的肝素樣硫酸多糖，能抑制血液凝固、血小板聚集、增強纖維蛋白溶解作用及結(jié)腸黏膜組織缺氧，加重腸道出血、產(chǎn)生血便[16]，便于直觀觀察是否造模成功。DSS 誘導UC 模型方法簡便，結(jié)果可靠，易于復制，周期可長可短，維持性好，不需灌腸等有創(chuàng)操作，經(jīng)過多年摸索，建模成功率最高，并且其誘導所致的上皮破壞、局灶性病變和淺表炎癥類似于UC 在人體中的表現(xiàn)[17]。DSS 可從多方面破壞腸上皮屏障緊密連接結(jié)構(gòu)，使腸黏膜屏障通透性增加，以致菌群和大分子物質(zhì)進入黏膜或黏膜下層，進而引發(fā)一系列炎癥反應(yīng)。這種病理性的定植侵入會刺激先天和適應(yīng)性免疫應(yīng)答，上調(diào)多種促炎細胞因子和趨化因子的分泌，激活某些通路，類似人類UC 發(fā)病機制，是目前最為理想的UC 模型，可作為后續(xù)研究人類UC 的免疫機制奠定實驗基礎(chǔ)[18]。故本實驗選此方法進行造模。

不同種屬和種系的動物對DSS 易感性不同，臨床表現(xiàn)、炎癥程度和病變部位也不同。在既往文獻中，黎笑蘭等[6]和王川[9]選用SD 大鼠，柯昌毅等[7]、時松 等[8]、崔 向 磊[19]分 別 選 用KM 小 鼠、NIH 小 鼠 和BALB/c 小鼠，研究對象未形成統(tǒng)一。經(jīng)文獻證實，C57BL/6J 小鼠對DSS 誘導的結(jié)腸炎敏感，其病變主要集中在中遠端結(jié)腸，表現(xiàn)為出血、腹瀉、潰瘍、淋巴細胞和中性粒細胞浸潤，與人類UC 臨床和組織學表現(xiàn)相似[20]。同時C57BL/6J 來源充足且費用低廉、適應(yīng)環(huán)境能力強、樣本量大、體型小、易飼養(yǎng)操作，故本實驗選其作為實驗對象。

既往研究證明，用分子量較?。?0 ku）的DSS 處理小鼠可出現(xiàn)結(jié)腸炎癥狀，而使用分子量較大（500 ku）的DSS 則無上述表現(xiàn)。另有研究證明，用分子量5 ku和40 ku 的DSS 分別誘導結(jié)腸炎，后者較前者病變重，且病變主要在遠端結(jié)腸，所造成的病理變化與人類結(jié)腸炎相似[21]。因此，本實驗選擇36～50 ku 的DSS 進行造模，其可靠性優(yōu)于崔向磊等[19]使用分子量為5 ku 的DSS 所誘導的UC 模型。

DSS 濃度是實驗成功至關(guān)重要的因素。DSS 造模通常采用給予20～50 g/L DSS溶液自由飲用5～7 d。一般在給藥后2～3 d 就可出現(xiàn)大便潛血陽性和腹瀉；隨后癥狀加重，或有肉眼血便，體質(zhì)量明顯下降，直至6～7 d 出現(xiàn)明顯的結(jié)腸炎癥狀，符合UC 模型急性期的表現(xiàn)[22]。本實驗經(jīng)過多次摸索，最終使用25 g/L 的DSS 很好重復了前述癥狀。

DSS 給藥方式多為自由飲用，有學者質(zhì)疑該方法會因小鼠飲水量的差異造成DSS 攝入量不同而導致組內(nèi)差異較大。但目前已有多項研究表明，DSS誘導UC 小鼠模型的結(jié)腸黏膜損傷程度主要取決于DSS 濃度，而非攝取的DSS 總量[23]。當造模小鼠DSS 總攝取量超過最低閾值后，即可成功建立急性UC 模型。另有研究者探究了自由飲用和灌胃的差異，結(jié)果顯示DSS 灌胃造模的效果并不及自由飲用法，這可能是小鼠自由飲用方式的攝入緩慢持久，可長久刺激機體的結(jié)果；灌胃法藥物代謝速度快，雖給藥量大，但刺激時間短，效果不佳[24]。

目前UC 尚無特異的治療方法，西醫(yī)主要運用5-氨基水楊酸、糖皮質(zhì)激素及免疫抑制劑進行治療，雖起效快、短期臨床緩解率高，但維持緩解治療長達數(shù)年甚至終身，停藥易復發(fā)，不良反應(yīng)多，治標不治本[25]。中藥價廉易得、資源豐富、應(yīng)用廣泛，已有不少從傳統(tǒng)中藥中分離出的天然產(chǎn)物已被臨床研究及基礎(chǔ)實驗證實對UC 具有有益作用。隨著藥理學的發(fā)展，研究者發(fā)現(xiàn)一些中藥有效成分（如多糖類等）在治療UC 上取得了一定的效果。BSP 作為白芨的主要成分，不僅有止血、促進骨髓造血、促進創(chuàng)傷愈合、保護胃黏膜、抗?jié)?、抗氧化、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等作用，并且具有自身降解性，無毒副作用，有良好的生物相容性[19]。本實驗結(jié)果顯示，BSP 對UC 有治療作用。與正常對照組相比，BSP 高劑量組體質(zhì)量下降不明顯、結(jié)腸長度縮短不明顯、DAI 評分升高減少、結(jié)腸組織病理學評分較低，整體作用效果甚至略優(yōu)于SASP陽性對照組，這從多個角度提示380 mg/kg 的BSP 對UC 具有最佳的治療效果，是后續(xù)研究者可供選擇的最佳給藥濃度。

大量研究表明，腸上皮屏障功能障礙與UC 的進展有著密不可分的關(guān)系。緊密連接是腸上皮屏障的最重要組成部分，對于維持腸上皮屏障的正常功能至關(guān)重要[26]。Claudin-1 作為腸上皮屏障緊密連接中的重要蛋白，可通過檢測Claudin-1 的表達觀察BSP 對腸道屏障的作用，探討其對UC 的作用。本研究用Western blotting 檢測各組小鼠結(jié)腸組織緊密連接蛋白Claudin-1 的表達，從蛋白水平證明高劑量的BSP 可明顯增強腸道屏障功能從而對結(jié)腸炎有明顯治療效果，更進一步明確了高濃度BSP 是治療UC 的優(yōu)選。

作為一種低價且療效甚佳的中藥制劑，BSP 具有廣闊的研究前景。本研究探索BSP 治療UC 小鼠的最佳動物模型和藥物干預濃度，為進一步研究BSP 對UC 的作用打下基礎(chǔ)。本研究既建立了具有典型病理改變的UC 動物模型，又找到了合適有效的BSP 藥物干預濃度，在節(jié)約資源的同時又具有發(fā)展價值，具有一定的社會經(jīng)濟效益。