高一誠，劉明強(qiáng)，陳海偉，康學(xué)文

（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院骨科，甘肅蘭州 730030）

腰痛（low back pain,LBP）可引起嚴(yán)重的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，大約80%的人一生中都會經(jīng)歷LBP，并且隨著人口老齡化趨勢的加劇，LBP的發(fā)生率和相關(guān)成本正在急劇上升［1-2］。雖然LBP的病因復(fù)雜，但椎間盤退變（intervertebral disc degeneration,IDD）引起的脊柱退行性疾病如椎管狹窄、椎體滑脫被認(rèn)為是主要的原因［3-4］。椎間盤（intervertebral disc,IVD）是位于相鄰椎體之間的纖維軟骨組織，約占整個脊柱長度的1/3，具有維持脊柱機(jī)械強(qiáng)度和靈活性的作用［5］。IDD由IVD中央部分的髓核（nucleus pulposus,NP）細(xì)胞驅(qū)動的改變，導(dǎo)致NP和纖維環(huán)（annulus fibrosus,AF）機(jī)械功能下降及進(jìn)行性AF裂形成和NP突出。與此同時，血管和傷害性神經(jīng)纖維向IVD內(nèi)生長，促進(jìn)免疫細(xì)胞浸潤，增加相關(guān)疼痛［6～7］。IDD的發(fā)展進(jìn)行性損害IVD吸收和分散脊柱壓力載荷的能力［8］。

作為一種自然的衰老現(xiàn)象，IDD可能難以預(yù)防。事實上，30歲以上的大多數(shù)成年人表現(xiàn)出某種形式的結(jié)構(gòu)性IVD變性，但沒有任何伴隨的癥狀，這阻礙了對IDD的早期診斷和有效干預(yù)［3～9］。目前臨床對IDD性疾病的治療方案是有限的，包括保守治療如止痛、抗炎、物理治療，和手術(shù)治療如椎間盤切除術(shù)和脊柱融合術(shù)等，只能緩解臨床癥狀，都未從IDD發(fā)生的潛在病理生理過程去解決問題［10］。因此需要一種旨在恢復(fù)IVD穩(wěn)態(tài)和再生受損組織的治療方法。為此，生物療法在臨床前研究中顯示出了希望。生長分化因子（growth differentiation factor,GDF）由于其在軟骨形成和軟骨組織穩(wěn)態(tài)中的關(guān)鍵作用，似乎具有令人興奮的前景［11～13］。因此，這篇綜述的重點是總結(jié)GDF家族成員GDF-5對IVD組織修復(fù)再生及潛在的治療作用，以其為后續(xù)研究提供參考。

1 IVD的結(jié)構(gòu)、功能和退變

IVD是人體最大的無血管組織，由三部分組成，即 NP、AF和軟骨終板（cartilaginous endplates,CEP）［14-15］。IVD的特性和功能依賴于其組織區(qū)域組成的特定微結(jié)構(gòu)，而這些微結(jié)構(gòu)又由不同的細(xì)胞群產(chǎn)生。NP由富含陰離子的蛋白聚糖（proteoglycan,PG）和Ⅱ型膠原構(gòu)成的細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM）及NP細(xì)胞組成。PG排列在不規(guī)則的Ⅱ型膠原晶格中，比例為27∶1［16］。高密度的帶負(fù)電荷的PG分子吸引并保持IVD組織的水分，使IVD能夠抵抗壓力載荷。NP被AF包繞，AF是一種主要由Ⅰ型膠原纖維組成的韌帶結(jié)構(gòu)，呈同心片層狀排列，其上、下纖維端錨定在CEP中。AF僅含有少量的PG成分。Ⅰ型膠原纖維斜向脊柱軸，可以防止在壓力負(fù)荷下IVD變形。CEP物理上限制了NP和AF的解剖邊界，并作為半透性屏障，支持營養(yǎng)物質(zhì)和液體交換，還可以通過纖維束分裂來增強(qiáng)力的分布［17］。

異常壓力載荷等不利因素刺激可引起IDD的發(fā)生，退化性NP和AF細(xì)胞產(chǎn)生許多促炎因子，包括白細(xì)胞介素 （IL） -1α，-1β，-2，-4，-6，-8，-10，干擾素-γ，腫瘤壞死因子α（TNF-α）和前列腺素E2（PGE2）［18］。隨后，趨化因子招募和激活免疫細(xì)胞誘導(dǎo)IVD的炎癥微環(huán)境，這種環(huán)境反過來引起NP和AF細(xì)胞的一系列病理反應(yīng)，包括NP標(biāo)記基因（Ⅱ型膠原、PG）的失調(diào)及細(xì)胞表型的變化如過度自噬、衰老和凋亡［19］。同時，退化的NP和AF細(xì)胞增加了基質(zhì)降解酶的表達(dá)，包括基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs），-3，-9，-13，以及解聚蛋白樣金屬蛋白酶（a disintegrins and metalloproteinases with thrombospondin motifs,ADAMTSs），-1，-4，-5。這進(jìn)一步加速Ⅱ型膠原和富含PG的ECM降解，以及纖維性Ⅰ型膠原瘢痕樣組織的替代［20］。這些變化直接導(dǎo)致IVD機(jī)械功能異常，最終破壞IVD結(jié)構(gòu)，如纖維環(huán)斷裂、NP突出等。

2 GDF-5與IDD的關(guān)系

GDF第一次被提及是作為牛軟骨的組成部分，是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族的成員［21］。GDF-5被稱為軟骨來源的形態(tài)發(fā)生蛋白-1，可以誘導(dǎo)軟骨和肌腱樣組織的形成，如軟骨內(nèi)成骨和韌帶維持，而不誘導(dǎo)骨樣組織的形成［22］。多項研究表明GDF-5與IDD密切相關(guān)，且在退變的IVD組織中，特別是NP中，GDF-5的表達(dá)降低。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GDF-5表達(dá)缺陷的小鼠IVD組織ECM的含量下降，體外用重組GDF-5基因治療可以增加Ⅱ型膠原和PG基因的表達(dá)。此外，研究人員還發(fā)現(xiàn)，在退化動物椎體模型中注射GDF-5或轉(zhuǎn)導(dǎo)GDF-5基因數(shù)周后，ECM合成代謝增加，IVD高度明顯恢復(fù)［23］。上述研究結(jié)果均表明GDF-5可能是減緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD進(jìn)程的有效靶點。因此，探究GDF-5在IDD過程中的作用機(jī)制，進(jìn)而明確治療IDD的有效靶點是當(dāng)務(wù)之急。

3 GDF-5治療IDD的作用機(jī)制

3.1 GDF-5促進(jìn)干細(xì)胞向NP樣細(xì)胞分化

研究發(fā)現(xiàn)許多生長因子如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth factor,FGF）、胰島素樣生長因子-1（insulin-like growth factor-1,IGF-1）和血小板源性生長因子（platelet derived growth factor,PDGF）可以誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞向NP樣細(xì)胞分化［24］。然而，這些研究關(guān)注的是一般的軟骨生成標(biāo)記物，而不是那些現(xiàn)在與特定NP分化相關(guān)的標(biāo)記物。GDF-5同樣被證明可以誘導(dǎo)一般軟骨生成基因的表達(dá)，如Ⅱ型膠原、PG等，更重要的是還可以誘導(dǎo)NP特異性基因（KRT18,KRT19,CA12,Brachyury(T),CD24,HIF-1α）的表達(dá)（表1）。當(dāng)GDF-5補(bǔ)充到高密度培養(yǎng)干細(xì)胞的培養(yǎng)基中時，干細(xì)胞軟骨分化明顯增加。然而，一些研究也注意到肥大和骨化標(biāo)記物的增加，包括堿性磷酸酶、Ⅰ型和Ⅹ型膠原以及骨橋蛋白；這些特征表明誘導(dǎo)軟骨分化向軟骨內(nèi)成骨的方向發(fā)展，這對NP細(xì)胞是不利的［25～29］。現(xiàn)階段對GDF-5在誘導(dǎo)干細(xì)胞向NP樣細(xì)胞分化研究的證據(jù)有限，因此需要進(jìn)一步的體外和體內(nèi)研究。

表1 GDF-5對干細(xì)胞培養(yǎng)的影響

3.2 GDF-5對ECM代謝的影響

MMPs是基質(zhì)降解酶的一種，其在IVD組織降解和再吸收過程中起著關(guān)鍵作用。MMPs水平的升高與 IDD 的程度密切相關(guān)［31］。Zhang 等［32］通過免疫組織化學(xué)染色和蛋白質(zhì)免疫印跡法發(fā)現(xiàn)MMP16的表達(dá)量與IDD程度呈正相關(guān)，MMP-16能夠降解PG和Ⅱ型膠原等重要的ECM成分，導(dǎo)致IVD脫水和變性；上述結(jié)果表明MMPs的表達(dá)對ECM代謝平衡至關(guān)重要。Cui等［13］用重組GDF-5蛋白處理小鼠離體NP細(xì)胞后，通過蛋白質(zhì)免疫印跡實驗和實時逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測PG、Ⅱ型膠原和MMP3蛋白和基因的表達(dá)來評估GDF-5的治療效果，發(fā)現(xiàn)GDF-5可抑制MMP3的表達(dá)，進(jìn)而減少Ⅱ型膠原、PG的降解。這提示GDF-5可能通過抑制MMPs的表達(dá)來減緩ECM的分解，這為阻止ECM降解提供了新的方向。

GDF-5已被證明對NP細(xì)胞合成代謝有促進(jìn)作用。重組GDF-5在體外以濃度依賴性方式促進(jìn)人NP細(xì)胞分泌Ⅱ型膠原和 PG［33］。Yan 等［34］通過將 PLAG負(fù)載的rhGDF-5注射到退化的小鼠IVD組織中，發(fā)現(xiàn)IVD的高度明顯恢復(fù)，并且上調(diào)Ⅱ型膠原和PG基因的表達(dá)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)GDF-5還能促進(jìn)Ⅱ型膠原和PG蛋白的合成。在另一研究中，GDF-5促進(jìn)AF和NP細(xì)胞中PG和Ⅱ型膠原的合成，尤其是PG的合成。Luo等［35］用腺病毒成功將GDF-5基因轉(zhuǎn)導(dǎo)到人NP細(xì)胞中，與空白對照組和腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)對照組相比，腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)GDF-5組的PG和Ⅱ型膠原的表達(dá)水平明顯升高；同樣，細(xì)胞免疫熒光顯示腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)GDF-5組的PG免疫熒光的強(qiáng)度在胞漿含量較高，而核區(qū)域稍低。上述結(jié)果表明腺病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)GDF-5具有促進(jìn)NP細(xì)胞分泌ECM的作用。綜上所述，GDF-5可能通過抑制MMPs的表達(dá)和增加PG，Ⅱ型膠原的表達(dá)來延緩IDD的進(jìn)展，未來需要進(jìn)一步深入研究其作用機(jī)制。

3.3 GDF-5抑制IVD細(xì)胞炎癥反應(yīng)

IDD過程中伴隨著IVD細(xì)胞炎癥因子（TNFα，IL-1β，IL-6和IL-17）分泌增加，這些炎癥因子不僅可以上調(diào) ADAMTS-4/5、MMP-1、-2、-3、-13、-14等多種分解代謝酶的表達(dá)，抑制Ⅱ型膠原和PG等重要ECM基因的表達(dá)，還可以觸發(fā)IVD細(xì)胞發(fā)生過度自噬、衰老和凋亡等病理反應(yīng)，從而導(dǎo)致IVD結(jié)構(gòu)異常和脊柱不穩(wěn)定，最終引起IVD突出，誘發(fā)坐骨神經(jīng)痛甚至椎管狹窄等疾病［5～36］。炎癥因子的合成是由NF-κB介導(dǎo)的，NF-κB是促炎基因表達(dá)最重要的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子之一［37］。Shen 等［38］研究發(fā)現(xiàn)GDF-5可抑制NF-κB信號通路的激活，減少炎癥因子基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而下調(diào)炎癥因子的表達(dá)；與對照組相比，GDF-5過表達(dá)顯著抑制了脂多糖誘導(dǎo)的NP細(xì)胞中TNF-α、IL-1β、前列腺素E2(PGE2)和NO的表達(dá)水平；此外，GDF-5過表達(dá)促進(jìn)了Ⅱ型膠原、PG表達(dá)水平的上調(diào)。這些結(jié)果表明GDF-5可能通過抑制炎癥因子的產(chǎn)生和釋放來延緩IDD的進(jìn)展。然而，具體的分子機(jī)制仍有待完全闡明（圖1）。

圖1 GDF-5延緩IDD進(jìn)程的分子機(jī)制示意圖

4 GDF-5注入體內(nèi)的方式

由于生長因子在體內(nèi)的半衰期較短，注射生理劑量的生長因子對IDD性疾病的長期治療效果有限，反復(fù)注射可能會損害IVD的機(jī)械完整性，并可在注射部位引起炎癥反應(yīng)，而大劑量的注射則由于脫靶效應(yīng)可能引起安全問題［39］。因此，發(fā)展有效的GDF-5體內(nèi)注射方法是有必要。目前的方法包括腺病毒或質(zhì)粒載體遞送GDF-5基因，遞送小干擾RNA以阻斷可能下調(diào)GDF-5基因的信號通路，miRNA遞送、抑制或基因編輯技術(shù)。其他方法可能依賴于GDF-5蛋白的受控遞送，如GDF-5與生物材料結(jié)合的微球包裹遞送。這些選擇既可用于控制內(nèi)源性細(xì)胞群，也可與細(xì)胞植入物（如間充質(zhì)干細(xì)胞）結(jié)合。

Liang等［40］將攜帶GDF-5基因的腺病毒載體注入小鼠IVD組織，GDF-5基因成功表達(dá)并產(chǎn)生了活性的GDF-5因子，通過磁共振成像檢測發(fā)現(xiàn)IVD的高度顯著恢復(fù)，并改善了IVD組織的水化。將GDF-5非病毒轉(zhuǎn)染入NP細(xì)胞或間充質(zhì)干細(xì)胞可能是一個更有吸引力的選擇。在牛IVD變性器官培養(yǎng)模型中，將GDF-5非病毒轉(zhuǎn)染到電穿孔間充質(zhì)干細(xì)胞中培養(yǎng)21 d，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)GDF-5，并且上調(diào)NP相關(guān)基因的表達(dá)［41］。另外，可控生長因子給藥系統(tǒng)可以防止給藥至退化IVD組織的生長因子降解，允許使用較低濃度的生長因子，并實現(xiàn)局部給藥而展現(xiàn)出良好的前景。聚合物微球包裹是控制生長因子釋放的常用方法。在大鼠穿刺誘導(dǎo)IDD模型中，GDF-5包裹微球且遞送持續(xù)42 d，使PG增加，IVD高度部分恢復(fù)［34］。因此，成功的生長因子治療可能涉及生長因子傳遞的方式、遞送周期和劑量。研究者還必須通過體內(nèi)實驗確定。

5 小結(jié)與展望

小分子療法，特別是與細(xì)胞植入相結(jié)合，為IVD退行性疾病的治療帶來了希望。在IVD組織中NP、ECM組成的變化與功能之間的聯(lián)系意味著選擇正確的生物活性分子是至關(guān)重要的。GDF-5在被運送到NP細(xì)胞時作為直接合成因子，以及被運送到間充質(zhì)干細(xì)胞時作為NP細(xì)胞特異性分化刺激因子，都顯示出了巨大的潛力。GDF-5本身能顯著促進(jìn)ECM主要成分的合成，尤其是Ⅱ型膠原和PG，這有利于退變IVD組織的修復(fù)，維持IVD組織的生理和力學(xué)功能。GDF-5還可通過下調(diào)促炎因子的表達(dá)，減少炎癥反應(yīng)進(jìn)而延緩ECM的降解，考慮到退行性IVD的促炎環(huán)境以及GDF-5和炎癥因子信號在激酶級聯(lián)上的聚合，需要進(jìn)一步的研究來確定這種相互作用的性質(zhì)，這可能促進(jìn)識別新的治療靶點，從而優(yōu)化GDF-5治療IDD性疾病。大量研究表明，GDF-5對退行性IVD的修復(fù)有顯著效果，增強(qiáng)了研究者對GDF-5進(jìn)一步研究的信心。然而，目前的研究也有很多的局限性。GDF-5在IDD中的作用機(jī)制非常復(fù)雜，許多信號通路尚未被明確研究；目前體內(nèi)和體外實驗均以動物模型為基礎(chǔ)，這都不能完全模擬人體復(fù)雜的IVD內(nèi)部環(huán)境，使GDF-5最終可能不會像預(yù)期的那樣在無血管的IVD組織中發(fā)揮作用。并且尚不完全清楚注射治療的方法及其注射治療是否安全可靠。今后需要進(jìn)行更深入廣泛的基礎(chǔ)和臨床研究，以期GDF-5能夠早期應(yīng)用于延緩甚至逆轉(zhuǎn)IDD性疾病。