武壯壯，申 振，武太勇，王佳妮，李 健，陳士偉，靳文軒，楊美菊，呂 智*

（1.山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院，山西太原 030001；2.晉城市人民醫(yī)院，山西晉城 048000；3.山西醫(yī)科大學，山西太原 030001）

骨肉瘤（osteosarcoma,OS）是最常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，好發(fā)于青少年，發(fā)病率為3～4例/100萬人，其惡性程度高、侵襲性強、復發(fā)和轉移率高［1～3］，嚴重影響青少年的健康。近年，隨著新輔助化療及外科技術水平的提高，OS的治療效果已有明顯改善，但局部復發(fā)率仍可高達50%，且有15%～20%患者在初診時已發(fā)生影像學可見的肺轉移，50%患者在治療期間出現(xiàn)肺轉移，80%發(fā)生轉移的患者在5年內死亡［4］。腫瘤細胞在人體內的轉移大致經過以下幾個步驟：（1）腫瘤細胞穿過宿主的血管外基質進入血管內，而后進入血液循環(huán)；（2）在血液循環(huán)中得以存活；（3）在血液循環(huán)中逃逸免疫系統(tǒng)的監(jiān)視；（4）到合適的靶器官后腫瘤細胞駐足并穿出血管壁；（5）腫瘤細胞粘附在靶器官并且在靶器官的微環(huán)境中得以存活；（6）隨著細胞的擴增和腫瘤組織的長大，新生的腫瘤位點形成新生血管系統(tǒng)［5］。

以往研究表明，Necdin（NDN）是一種多功能蛋白質，可以直接與DNA結合，發(fā)揮轉錄因子的作用［6］，也可以通過與E2F1、p53等著名的轉錄因子相互作用調節(jié)其轉錄活性以間接調節(jié)轉錄［7，8］。Chapman和Knowles［9］研究表明，NDN在癌細胞系和原發(fā)性腫瘤中都存在下調，這表明NDN可能具有腫瘤抑制作用。本研究旨在探討骨肉瘤患者組織中NDN是否表達異常及其與臨床病理因素和預后之間的潛在相關性。

1 資料與方法

1.1 納入與排除標準

納入標準：（1）四肢骨肉瘤；（2）符合美國癌癥聯(lián)合委員會（AJCC）分期II期和Ⅲ期；（3）在本院行新輔助化療和根治性手術；（4）有活檢標本，用于免疫組織化學染色。

排除標準：（1）繼發(fā)性骨肉瘤；（2）骨外骨肉瘤；（3）骨膜或骨旁骨肉瘤；（4）患者術后未復查,無隨訪信息。

1.2 一般資料

2009年10月—2019年7月，山西醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨病科收治51例患者，符合上述標準，納入本研究。其中，男28例，女23例；年齡10～67歲，平均（27.04±17.40）歲。病理診斷為普通型骨肉瘤44例，軟骨母細胞型骨肉瘤2例，毛細血管擴張型骨肉瘤2例，巨細胞型骨肉瘤2例，低級別中央型骨肉瘤1例。Ennecking分期，ⅡA期34例，ⅡB期13例，Ⅲ期4例。本研究經山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院倫理審查委員會的批準［山西醫(yī)科大學第二醫(yī)院委員會（2021）YX第（098）號］，均征得患者本人或法定監(jiān)護人的知情同意。

1.3 治療方法

先采用切開取活檢術，取少量組織進行病檢，經病理科兩位專家確診為骨肉瘤。待傷口愈合后2周開始進行新輔助化療，鹽酸表柔比星：100 mg/m2，1次/d，連用3 d；順鉑：20 mg/m2，1次/d，連用5 d；術前化療2個療程。然后行瘤段切除假體重建術。瘤體送病檢，并檢測化療后腫瘤的壞死率。術后2周傷口愈合后拆線，并開始輔助化療。術后化療方案根據病檢中得出腫瘤壞死率來確定，如果壞死率＞90%，維持原化療方案；如果壞死率＜90%，改用異環(huán)磷酰胺1.5～2 g/m21次/d，連用5 d；順鉑30 mg/m2，1次/d，連用5 d。

1.4 免疫組織化學檢查

制備5 μ的石蠟切片，常規(guī)先行HE染色，顯微鏡下觀察細胞形態(tài)。然后行免疫組織化學檢測，二甲苯脫蠟，乙醇溶液復水，EDTA抗原修復液高壓修復。然后，用山羊血清封閉切片，用抗NDN抗體（Santa Cruz）在4℃孵育過夜。次日，切片用PBS洗滌3次，再與生物素標記山羊抗小鼠/兔IgG（北京中杉金橋，37℃）孵育1 h，滴加SABC，37℃孵育30 min，然后用3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）溶液（DAB顯色試劑盒，武漢博士德生物工程有限公司）顯影，蘇木素溶液短暫染色，鹽酸酒精返藍，中性樹膠封片。使用Pannorama MIDI數字載玻片掃描儀和掃描儀控制軟件（3DHISTECH,Ltd.，布達佩斯，匈牙利）分析抗NDN染色的強度。

1.5 評價指標

從手術之日到死亡之日或直到2021年3月，對臨床結果進行跟蹤觀察。生存時間定義為從確診到死于原發(fā)腫瘤相關原因的時間跨度?；颊咝g后每3個月復查患肢X線片、胸部CT，每6個月復查全身骨掃描。記錄臨床病理變量，包括年齡、性別、初始磁共振圖像上腫瘤的最大直徑、Ennecking分期、局部復發(fā)、肺轉移。

免疫組化評定采用Image J圖像分析系統(tǒng)進行陽性結果判定。NDN分別以胞核中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。將陽性細胞的積分光密度值（integrated optical density,IOD）分為：無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，深棕色為3分。陽性面積百分比（染色面積），髙倍鏡（×400）下隨機選取5個視野，每個視野計數200個細胞，根據平均陽性細胞百分比分為：0%～25%為1分，26%-50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。兩項評分相乘：9＜強陽性≤12分,6＜陽性≤9分，3＜弱陽性≤6分，0≤陰性≤3分。

1.6 統(tǒng)計學方法

應用SAS 9.4軟件進行統(tǒng)計分析，使用Graphpad prism 7.0軟件統(tǒng)計圖繪制。計量資料以±s表示，資料呈正態(tài)分布時，采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析；資料呈非正態(tài)分布時，采用Mannwhitney U檢驗或Krushal-Wallis H檢驗。等級資料采用采用Krushal-Wallis H檢驗。計數資料采用Fisher確切概率法檢驗。采用Kaplan-Meier法估算生存率及平均生存期，Log-rank檢驗不同組別生存率的差異，Cox比例風險回歸模型進行多因素生存分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 臨床結果

本組51例患者均得到隨訪38以上，隨訪過程中，局部復發(fā)16例，轉移33例。末次隨訪時，無瘤生存10例，帶瘤生存5例，死亡36例。術后生存時間最長為78個月，最短者為16個月，絕大多數患者死亡原因為肺轉移以后導致的呼吸衰竭，以及出現(xiàn)轉移以后的全身惡病質。

按末次隨訪結局分組（無瘤生存組、帶瘤生存組、死亡組）進行比較，結果見表1，三組中年齡、性別、術前瘤體大小、NDN檢測差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。三組間骨肉瘤患者Ennecking分期比較，死亡組中IIB、III期所占比例明顯高于無瘤生存組和帶瘤生存組，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。死亡組中肺轉移率明顯高于帶瘤生存組和無瘤生存組（P＜0.05）。

2.2 NDN免疫組化結果與分組比較

顯微鏡下所見見圖1，NDN表達主要位于細胞的胞核中。NDN在骨肉瘤組織中的表達率為29.41%（15/51），明顯低于瘤旁骨組織陽性表達率80.00%（8/10），兩者差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002）。

圖1 NDN免疫組化染色所見 1a:瘤旁正常骨組織NDN表達呈陽性的細胞，被染成棕色（×40） 1b:高倍鏡下瘤旁正常骨組織NDN表達陽性的細胞，細胞核呈棕色，胞質、胞核均被染成深棕色（×400） 1c:骨肉瘤組織NDN表達多呈陰性的細胞，骨肉瘤細胞的細胞質、細胞核呈藍色（×40） 1d:高倍鏡下，可見部分蛋白表達陽性的細胞，胞質、胞核均被染成淺棕色（×400）

按NDN檢測陰性與陽性分兩組進行臨床比較，結果見表2。NDN蛋白表達陰性組的術前Ennecking分期為IIB、III期患者比例顯著高于陽性組（P＜0.05）。兩組年齡、性別、是否肺轉移、腫瘤大小、是否復發(fā)、生存結局差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表2 NDN檢測陰性與陽性兩組患者資料與比較

2.3 不同組別平均生存時間比較

不同組別平均生存時間比較結果見表3，IIA期、非肺部轉移、腫瘤大小＜5 cm、NDN檢測陽性骨肉瘤患者平均生存時間顯著高于IIB/III期、肺部轉移、腫瘤大小≥5cm、NDN檢測陰性患者（P＜0.05）。

表3 Kaplan-Meier生存期及對數等級分析結果

不同骨肉瘤組織NDN表達陰性與陽性患者的Kaplan-Meier生存曲線見圖2，可見NDN陽性表達患者生存時間顯著長于NDN陰性表達患者。

圖2 NDN檢測陰性與陽性的Kaplan-Meier生存曲線

骨肉瘤患者Cox比例風險回歸分析結果見表4，引入水準為0.05，剔除水準為0.1。結果表明，Ennecking分期 （HR=1.530）、肺轉移 （HR=4.662）、腫瘤大?。℉R=3.398）是生存的危險因素，而NDN陽性（HR=0.207）是生存的保護性因素。

表4 骨肉瘤生存風險的Cox多因素分析結果

3 討論

目前，骨肉瘤的治療手段主要是術前化療，手術治療，術后化療，但由于骨肉瘤的組織異質性、遺傳不穩(wěn)定性、局部強侵襲性，大多數患者早期即出現(xiàn)肺轉移，預后并不滿意。目前關于細胞起源的研究、OS干細胞特征的研究、各種信號傳導通路、腫瘤微環(huán)境、免疫治療等領域的深入研究，以及建立更好的疾病模型將會開辟治療此腫瘤的新思路，最終將會提高 OS 患者的療效［10］。

NDN是一種生長抑制蛋白，首次在有絲分裂后神經元中被發(fā)現(xiàn)［11］。NDN最初被認為是有絲分裂后神經元細胞增殖的抑制因子，由于NDN的構成性和終身表達，導致分化的神經元永久退出細胞周期［12］。編碼人類NDN的基因位于染色體15q11上，這是普拉德-威利綜合征（Prader-Willi syndrome）的母系印記區(qū)域，是以發(fā)育遲緩和行為異常為特征的神經遺傳學疾?。?1］。NDN基因是母系印記的，僅從父親的等位基因轉錄，在PWS患者中不表達。NDN是黑色素瘤抗原（MAGE）家族的成員，該家族由60多個共享高度保守的MAGE同源結構域（MHD）的基因組成［13，14］。

Yang等［15］研究發(fā)現(xiàn)，NDN在正常卵巢上皮中持續(xù)表達，在大多數卵巢癌中表達下調。NDN的重新表達抑制了細胞的生長，降低了細胞的運動性和遷移性。Chapman等［16］的研究發(fā)現(xiàn)，在28個膀胱癌細胞系中有26個（92.9%）和58個膀胱癌腫瘤中有35個（60%）NDN轉錄本下調，并觀察到端粒酶催化亞單位hTERT可誘導正常人尿路上皮細胞NDN表達下調。膀胱癌細胞系和腫瘤提示NDN可能是腫瘤抑制基因。Hoek等［17］研究發(fā)現(xiàn)，與正常黑色素細胞相比，NDN在被測試的8個黑色素瘤細胞株中有6個下調，而在黑色素瘤細胞系中的異位重新表達導致了體外生長抑制，NDN的低表達仍然有利于腫瘤的生長，就像其他腫瘤抑制因子所顯示的那樣。Virani等［18］研究發(fā)現(xiàn)，NDN在一些腫瘤中高表達，并且有致癌的作用。NDN在不同的腫瘤中表現(xiàn)出不同的作用，可能與其所在的微環(huán)境和細胞環(huán)境有關［19］，了解其不同機制，對于NDN在腫瘤方面的研究非常重要。本研究發(fā)現(xiàn)，NDN在骨肉瘤組織中表達下調，在正常骨組織中高表達，NDN高表達的骨肉瘤患者，其生存率明顯高于NDN低表達的骨肉瘤患者。由此證明NDN在骨肉瘤中扮演著抑癌基因的角色。

骨肉瘤的轉移與Notch通路、Wnt/β-catenin信號通路、Src激酶、免疫逃逸、Fas信號通路等有關系［20］。Lee 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，與正常組織相比，乳腺癌中NDN的表達有所下降，這表明NDN可能發(fā)揮著腫瘤抑制因子的作用，NDN表達水平的提高抑制了高度侵襲性小鼠乳腺腫瘤細胞株的轉移能力，NDN很可能是作為轉錄調節(jié)因子和轉移抑制因子，在種系水平上發(fā)揮其影響。本研究應用單因素和多因素生存分析發(fā)現(xiàn)，NDN表達、Ennecking分期、肺轉移是影響骨肉瘤患者預后的獨立因素，這表明NDN也可能通過抑制骨肉瘤的肺轉移來提高骨肉瘤患者的生存率。未來的研究方向應該結合臨床，將靶點的發(fā)現(xiàn)盡早轉化為臨床可用的新型靶向治療藥物以及加強對聯(lián)合用藥的探索以提高骨肉瘤化療療效。此外，提高腫瘤局部化療藥物濃度也可能是一種可行的策略［22］。本研究結果提示，NDN可能作為治療骨肉瘤肺轉移的一個靶點，其低表達是骨肉瘤患者預后不良的潛在指標。