劉本同，王麗玲，王衍彬，黃旭波，秦玉川

（浙江省林業(yè)科學(xué)研究院，浙江 杭州 310023）

鼠茅Vulpia myuros為越年生禾本科Poaceae 鼠茅屬Vulpia植物，每年9 月萌發(fā)，翌年6 月死亡，留下的種子可于當(dāng)年9 月萌發(fā)。目前，鼠茅主要用于果園抑草[1]和綠肥種植[2-3]，主要分布在江蘇、浙江、廣西等地，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。前期研究表明，不同產(chǎn)地的鼠茅在生理特性方面存在差異，特別是耐寒、耐旱性方面存在差異。近年來(lái)，對(duì)于鼠茅的研究也多集中在種植、生理特性等方面[4-7]，關(guān)于用分子標(biāo)記技術(shù)研究鼠茅遺傳多樣性及遺傳結(jié)構(gòu)的報(bào)道幾乎沒(méi)有。與其他分子標(biāo)記技術(shù)相比，簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性分子標(biāo)記（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是顯性標(biāo)記，具有穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、簡(jiǎn)便及易操作等優(yōu)點(diǎn)，被視為理想的遺傳標(biāo)記方法[8-10]。目前，ISSR 已在多種動(dòng)植物的遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、種質(zhì)資源鑒定、基因定位和遺傳圖譜構(gòu)建等研究方面得到應(yīng)用[11-14]。本研究應(yīng)用ISSR 分子標(biāo)記法分析來(lái)源于浙江省內(nèi)及市售日本種的鼠茅遺傳多樣性水平及親緣關(guān)系，以期對(duì)鼠茅資源的保護(hù)和開(kāi)發(fā)等方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2020 年4—5 月，采集浙江省各市的鼠茅的地上部分，將采摘的鼠茅存放于裝有干燥硅膠的密封袋中備用。日本種質(zhì)購(gòu)于種子市場(chǎng)，為日本鼠茅品種‘雪印’。共26 個(gè)樣品，樣品采集信息見(jiàn)表1。

1.2 試劑

TIANamp Genomic DNA Kit，天根生物科技（北京）有限公司；TS-GelRed 核酸染料（10 000×水溶液），北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司；Regular Agarose，西班牙Biowest 公司；50×TAE Tris-乙酸電泳緩沖液，福州Phygene 生物科技有限公司。

1.3 供試儀器

DK-S26 電熱恒溫水浴鍋，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FRESCO 21 微量冷凍離心機(jī)、NanoDrop2000 超微量分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo scientific 公司；Life ECO 擴(kuò)增儀，杭州博日科技有限公司；DYY-12C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；Bio-Rad 凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.4 引物序列

供試引物所采用的ISSR 擴(kuò)增引物信息見(jiàn)表2，共15 條引物。供試引物委托北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司合成。

表2 最優(yōu)ISSR 引物序列Table 2 The optimal ISSR primer sequence

1.5 DNA 的提取及檢測(cè)

取待提取鼠茅葉片，用無(wú)菌水清洗數(shù)遍，用濾紙吸干水分，加研磨珠在研磨機(jī)上徹底磨碎?；蚪MDNA 的提取參照天根TIANamp Genomic DNA Kit 試劑盒操作說(shuō)明書(shū)。利用NanoDrop 2 000 超微量分光光度計(jì)對(duì)樣品基因組DNA 進(jìn)行核酸純度及濃度的檢測(cè)，于-20℃冰箱儲(chǔ)藏備用。

1.6 PCR 引物的篩選、ISSR-PCR 擴(kuò)增及檢測(cè)

參考加拿大哥倫比亞大學(xué)（UBC）公布的100 條ISSR 引物序列，隨機(jī)選取2 個(gè)鼠茅樣品模板DNA，采用最優(yōu)ISSR-PCR 體系中的擴(kuò)增條件，從ISSR 引物中篩選出15 條反應(yīng)體系較穩(wěn)定、擴(kuò)增條帶較清晰且多態(tài)性較多的引物，最優(yōu)引物序列見(jiàn)表2。PCR 反應(yīng)體系為20 μL，含有DNA 樣品1 μL(40 mg·L-1)、引物1 μL，2×TSINGKE Master Mix 10 μL，加ddH2O 至體積20 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min，95℃變性1 min，52～ 57℃退火1 min，72℃總延伸5 min，共35 個(gè)循環(huán)，4℃保存。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)在LifeECO 基因擴(kuò)增儀（杭州博日）上進(jìn)行。PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，TS-GelRed 核酸染料染色，1×TAE 電泳緩沖液中電泳40 min，電壓為130V。Marker 為2 000 bp。電泳后，在Bio-Rad 凝膠成像儀上拍照并保存DNA 檢測(cè)結(jié)果。

1.7 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)樣品的ISSR 擴(kuò)增譜帶信息，按照鄒喻萍等[15]制定的標(biāo)準(zhǔn)，以擴(kuò)增條帶有計(jì)為“1”，無(wú)計(jì)為“0”。用Image Lab 軟件對(duì)圖譜上的條帶進(jìn)行人工標(biāo)記，并導(dǎo)出為0-1 矩陣的數(shù)據(jù)。用NTSYS 2.10 軟件對(duì)來(lái)源于不同地區(qū)的鼠茅進(jìn)行個(gè)體間的非加權(quán)成對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）聚類(lèi)分析，使用軟件中的SimQual 程序計(jì)算樣品間的Dice 遺傳相似系數(shù)，用SAHN 程序進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)分析，通過(guò)Tree plot 模塊生成聚類(lèi)圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 I SSR-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

用篩選出的15 條引物對(duì)采集的25 個(gè)樣品和1 個(gè)日本種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出87 條條帶，在多態(tài)性條帶中其有效條帶數(shù)為83 條，有效條帶數(shù)占總條帶數(shù)的95.40%。15 條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量均為2～ 12 條，其中，引物848 擴(kuò)增出的條帶數(shù)量最多，為12 條；PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)表3。引物835 對(duì)鼠茅的PCR 擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 引物835 對(duì)鼠茅的PCR 擴(kuò)增結(jié)果Figure1 PCR amplification of primer 835 on V.myuros

表3 鼠茅ISSR 標(biāo)記的多態(tài)性Table 3 Polymorphism of ISSR markers in V.myuros

2.2 遺傳相似性分析

將15 條引物擴(kuò)增出的條帶作為原始矩陣，利用NTSYS-pc 軟件計(jì)算26 份鼠茅種質(zhì)間的Dice 遺傳距離，結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，26 份種質(zhì)之間的遺傳距離均介于0～ 0.707，平均為0.457。其中，浙江省內(nèi)種質(zhì)間遺傳距離最大的為1 號(hào)和3 號(hào)、3 號(hào)和12 號(hào)，其遺傳距離均為0.679，表明兩者間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；遺傳距離最小的為7 號(hào)和13 號(hào)，其遺傳距離為0，說(shuō)明這兩者親緣關(guān)系非常近，可能來(lái)源于同一祖先。此外，日本種質(zhì)26號(hào)與浙江種質(zhì)的鼠茅遺傳距離都較遠(yuǎn)，其中與3 號(hào)的遺傳距離最大，為0.707，與24 號(hào)和25 號(hào)的遺傳距離最近，均為0.555。這表明浙江的這25 份鼠茅種質(zhì)為浙江特有種質(zhì)，均非人工播種的日本種質(zhì)。26 份試樣間的遺傳距離詳見(jiàn)表4。

2.3 聚類(lèi)結(jié)果分析

使用Ntsys 2.1 軟件對(duì)26 個(gè)鼠茅樣品基于遺傳相似性系數(shù)進(jìn)行UPGMA 聚類(lèi)，聚類(lèi)結(jié)果見(jiàn)圖2?由圖2 聚類(lèi)結(jié)果顯示，在遺傳相似系數(shù)0.63 處劃分，26 個(gè)樣品可聚為2 類(lèi)，其中，來(lái)自麗水的3 號(hào)種質(zhì)單獨(dú)為一類(lèi)，其余25 個(gè)種質(zhì)為一類(lèi)；在遺傳相似系數(shù)0.78 處，可將第一類(lèi)的25 份樣品進(jìn)一步細(xì)分為兩類(lèi)，其中，日本種質(zhì)26 號(hào)單獨(dú)為一類(lèi)，其余24 份樣品聚為一類(lèi)；相同產(chǎn)地的鼠茅聚類(lèi)關(guān)系都較近，如12 號(hào)、13 號(hào)、14 號(hào)來(lái)自臺(tái)州的鼠茅種質(zhì)均在同一個(gè)分叉上，4 號(hào)和5 號(hào)來(lái)自麗水的鼠茅種質(zhì)也聚集較近，也有少數(shù)同一產(chǎn)地的鼠茅種質(zhì)沒(méi)有聚在一類(lèi)，如來(lái)自杭州的23 號(hào)、24 號(hào)種質(zhì)聚類(lèi)較遠(yuǎn)，說(shuō)明兩者的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)?結(jié)合產(chǎn)地聚類(lèi)和個(gè)體聚類(lèi)結(jié)果可知，除3 號(hào)種質(zhì)外，浙江省內(nèi)鼠茅的親緣關(guān)系都較近，且相互交叉。這與遺傳距離分析結(jié)果一致，鼠茅不同種源的基因交流程度較高，遺傳分化較小。

圖2 26 份種質(zhì)的UPGMA 遺傳聚類(lèi)圖Figure 2 Dendrogram constructed for 26 germplasms based on UPGMA

3 討論

本研究利用ISSR 分子標(biāo)記方法對(duì)浙江省內(nèi)25 份不同地理來(lái)源的鼠茅和1 份從市場(chǎng)采購(gòu)的日本種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析?由遺傳多樣性分析結(jié)果可知，鼠茅具有豐富的遺傳多樣性。遺傳距離是用來(lái)比較群體或個(gè)體間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的度量參數(shù)，距離越小，說(shuō)明親緣關(guān)系近，遺傳背景的一致性越強(qiáng)，由遺傳距離進(jìn)行親緣關(guān)系分析，26 份鼠茅種質(zhì)之間遺傳距離為0～ 0.707，其遺傳距離總體來(lái)說(shuō)比較小，表明浙江省內(nèi)鼠茅個(gè)體間的親緣關(guān)系較近；進(jìn)一步的聚類(lèi)結(jié)果分析可知，來(lái)自衢州的7 號(hào)種質(zhì)和來(lái)自臺(tái)州的13 號(hào)種質(zhì)，以及來(lái)自臺(tái)州的14 號(hào)種質(zhì)和

來(lái)自寧波的15 號(hào)種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，表明這些地區(qū)鼠茅種質(zhì)的親緣關(guān)系較近，遺傳背景較為一致。同時(shí)，從聚類(lèi)關(guān)系圖也可看出，同一個(gè)地區(qū)的鼠茅并未聚集在一起，如來(lái)自寧波的15～ 19 號(hào)種質(zhì)，分布在聚類(lèi)圖的各分叉上，這可能與鼠茅的繁殖方式相關(guān)，并與基因的交流程度有關(guān)。此外，來(lái)自麗水的3 號(hào)種質(zhì)在聚類(lèi)圖上單獨(dú)聚為一類(lèi)，這說(shuō)明該鼠茅種質(zhì)的遺傳上與其他種質(zhì)有較大差異，在后續(xù)的育種等方面值得關(guān)注。

ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)能夠揭示鼠茅不同種質(zhì)間的遺傳差異及親緣關(guān)系，雖然目前對(duì)鼠茅種質(zhì)間的遺傳多樣性的研究較少，但在其他物種中得到了很好運(yùn)用。如：李曼等[16]采用ISSR 分子標(biāo)記對(duì)39 個(gè)不同產(chǎn)地的牛膝Achyranthes bidentata種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析，將其分為2 大類(lèi)群6 個(gè)亞群，這說(shuō)明牛膝具有豐富的遺傳多樣性；李勇慧等[17]采用ISSR 分子標(biāo)記法對(duì)洛陽(yáng)地區(qū)35 個(gè)牡丹Paeonia suffruticosa品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，結(jié)果表明，35 個(gè)牡丹品種的遺傳多樣性豐富，可分為5 大類(lèi)，為合理利用牡丹種質(zhì)資源提供分子水平的研究基礎(chǔ)?蔣明等[18]對(duì)8個(gè)居群共125份日本莢蒾Viburnum japonicum樣品進(jìn)行了ISSR遺傳多樣性分析，聚類(lèi)分析結(jié)果表明，同一地理來(lái)源的日本莢蒾大多聚為一類(lèi)，呈一定的地域分布規(guī)律，日本莢蒾遺傳多樣性水平高，但主要存在于居群間，島嶼之間的地理隔離可能是遺傳分化的主要原因。因此，本文通過(guò)ISSR 分子標(biāo)記方法對(duì)鼠茅親緣關(guān)系鑒定，結(jié)合不同鼠茅的生理生化特征，可為鼠茅規(guī)范化種植及資源保護(hù)開(kāi)發(fā)等提供科學(xué)依據(jù)?

4 結(jié)論

本研究對(duì)浙江地區(qū)及市售日本種質(zhì)共26 份鼠茅樣品進(jìn)行ISSR 遺傳多樣性分析。用篩選出的15 條引物對(duì)26 份種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，共擴(kuò)增出87 條條帶，其中有效條帶數(shù)為83 條，占總條帶數(shù)的95.40%；15 條引物擴(kuò)增出的條帶數(shù)量均為2～ 15 條，其中，引物848 擴(kuò)增出的條帶數(shù)量最多，為12 條。26 份種質(zhì)之間的遺傳距離均介于0～ 0.707，平均為0.457，其中，浙江省內(nèi)種質(zhì)間遺傳距離最大的為1 號(hào)和3 號(hào)、3 號(hào)和12 號(hào)，其遺傳距離均為0.679，表明兩者間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，遺傳距離最小的為7 號(hào)和13 號(hào)，其遺傳距離為0；此外，日本種質(zhì)26 號(hào)與浙江種質(zhì)的鼠茅遺傳距離都較遠(yuǎn)，其中與3 號(hào)的遺傳距離最大，為0.707。UPGMA 聚類(lèi)結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)0.63 處劃分，26 個(gè)樣品共聚為2 類(lèi)，其中，來(lái)自麗水的3 號(hào)種質(zhì)單獨(dú)為一類(lèi)，其余25 個(gè)種質(zhì)為一類(lèi)；在遺傳相似系數(shù)0.78 處，可將上述第一類(lèi)的25 份樣品進(jìn)一步細(xì)分為兩類(lèi)，其中日本種質(zhì)26 號(hào)單獨(dú)為一類(lèi)，其余24 份樣品聚為一類(lèi)。同一地理來(lái)源的鼠茅大多聚為一類(lèi)，呈現(xiàn)一定的地域分布規(guī)律，但也不僅僅局限于地域聚類(lèi)，不同地域遺傳相似度較高，鼠茅遺傳分化程度也不高。以上研究結(jié)果，可以為鼠茅的異地種植、資源保護(hù)提供理論依據(jù)。