牛宇佳，徐同冉，林樹海

(廈門大學生命科學學院，細胞應激生物學國家重點實驗室，福建 廈門 361102)

在20世紀20—60年代，生物化學領域呈現(xiàn)突飛猛進的發(fā)展，科學家們鑒定了人類和其他物種的絕大多數(shù)代謝網(wǎng)絡中營養(yǎng)物質(zhì)利用和能量產(chǎn)生的過程[1].進入21世紀后，又迎來代謝復興的新時期.研究人員借助各類新技術、新儀器，如色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術，實現(xiàn)了高通量代謝物的定性、定量分析，可表征細胞、組織和體液在某一特定條件下的病理與生理變化，因此代謝組的變化可以看成是生化反應的指示劑；然而，這只解決了問題的一半，代謝組學反映的是靜態(tài)代謝物的豐度，而單獨某一種代謝物增加的原因既可能是合成途徑的活躍，也可能是消耗途徑的抑制，因此了解代謝物相關途徑活性的變化同樣重要[2].為了更好地定性與定量研究代謝物的代謝命運，代謝流分析技術伴隨穩(wěn)定同位素示蹤和質(zhì)譜技術的發(fā)展而產(chǎn)生.研究人員引入穩(wěn)定同位素來示蹤代謝物，依據(jù)代謝物分子的同位素分布模式推斷出相關代謝反應的通量[3]，以實現(xiàn)從靜態(tài)與動態(tài)角度均能剖析細胞代謝的變化.機體代謝處于動態(tài)平衡時，代謝物的產(chǎn)生量與消耗量應相等[2]；一旦打破這種穩(wěn)態(tài)(即代謝異常)，則常會導致代謝疾病的發(fā)生[3].為了精準地研究疾病特別是腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的代謝物動態(tài)變化，代謝流技術得以廣泛應用.依據(jù)已有報道，代謝流分析技術在識別新的代謝途徑、鑒定代謝物的代謝命運、發(fā)現(xiàn)新的代謝物，以及鑒定疾病診斷的生物標志物等方面取得了重要進展[4].

1 穩(wěn)定同位素示蹤劑的選擇

為量化細胞內(nèi)的代謝流通量，最重要且有效的方法之一是使用穩(wěn)定同位素示蹤劑[5].穩(wěn)定同位素示蹤劑是將某些特定原子替換成穩(wěn)定同位素標記的代謝物，常用的穩(wěn)定同位素標記有13C、2H、15N等.細胞的生命活動基本單元是碳骨架，細胞中最重要的碳源是葡萄糖，其他的代謝物如谷氨酰胺、棕櫚酸、乙酸、乳酸等也可作為細胞的碳源[6]，它們也參與重要的代謝反應如糖酵解、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖途徑等.本文從細胞代謝中若干重要代謝通路的角度闡述代謝流分析技術的流程及其在腫瘤代謝中的應用價值.

1.1 以[U-13C6]-葡萄糖為示蹤劑區(qū)分進入三羧酸循環(huán)的代謝途徑

經(jīng)典生物化學中，葡萄糖通過糖酵解通路轉(zhuǎn)化為丙酮酸，丙酮酸有兩種方式進入三羧酸循環(huán)[7-8]：一種途徑是通過丙酮酸脫氫酶(PDH)，即丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，乙酰輔酶A結合草酰乙酸生成檸檬酸；另一種途徑是通過丙酮酸羧化酶(PC)產(chǎn)生草酰乙酸[9](圖1).為了區(qū)分這兩條代謝途徑，可以使用[U-13C6]-葡萄糖作為示蹤劑.為了簡化研究策略，僅考慮一輪三羧酸循環(huán)歷程：對于第一種途徑，來自葡萄糖的丙酮酸經(jīng)PDH產(chǎn)生的檸檬酸標記應為[M+2]，即含有2個13C 標記；對于第二種途徑，來自葡萄糖的丙酮酸經(jīng)PC產(chǎn)生的草酸乙酸標記應為[M+3]，進而檸檬酸標記也含有3個13C標記.由此可以計算出檸檬酸同位素異型體[M+2]/[M+3]的比例，即為通過PDH與通過PC的通量分流比例，三羧酸循環(huán)中其他代謝物也可反映相同信息.因此，比較丙酮酸進入三羧酸循環(huán)的兩種不同方式的代謝通量，使用13C標記的葡萄糖或其他糖酵解過程中的代謝物(如丙酮酸)均可以實現(xiàn)研究目的.值得一提的是，若只為考察PC活性，可使用[1-13C]-丙酮酸作為示蹤劑，即通過PC轉(zhuǎn)化得到的檸檬酸含有1個13C，而通過PDH轉(zhuǎn)化得到的檸檬酸不含13C.

圖1 [U-13C6]-葡萄糖作為示蹤劑短時間內(nèi)通過PDH和PC進入三羧酸循環(huán)

1.2 以[1,2-13C2]-葡萄糖為示蹤劑鑒別氧化型和非氧化型磷酸戊糖途徑

磷酸戊糖途徑含有氧化型和非氧化型兩條支路.在氧化型磷酸戊糖途徑中[10-11]，葡萄糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖-6-磷酸后，經(jīng)歷氧化和脫羧成為5-磷酸核酮糖，再經(jīng)非氧化型磷酸戊糖途徑回到糖酵解過程中的果糖-6-磷酸.由于葡萄糖-6-磷酸經(jīng)歷氧化脫羧過程，其碳骨架上第一個被標記的13C原子被脫去成為CO2釋放，所以重新進入糖酵解的果糖-6-磷酸只有1個標記的13C 原子；而未進入磷酸戊糖途徑的葡萄糖-6-磷酸有2個標記的13C原子，下游代謝物也是如此標記模式.可以使用糖酵解下游代謝產(chǎn)物(如丙酮酸或乳酸等)計算其同位素異型體[M+1]與[M+2]的標記比例，該比值即為葡萄糖經(jīng)磷酸戊糖途徑和僅經(jīng)糖酵解而不經(jīng)磷酸戊糖途徑的代謝通量分流比例(圖2).

圖2 [1,2-13C2]-葡萄糖為示蹤劑鑒別氧化型和非氧化型磷酸戊糖途徑

1.3 以[2,3,3-2H]-絲氨酸為示蹤劑鑒別線粒體和胞漿中的一碳代謝

由葉酸輔酶介導的一碳代謝支持多種生理活動的正常進行，包括核苷酸合成、氨基酸代謝、表觀遺傳調(diào)節(jié)和氧化還原穩(wěn)態(tài)的維持[12].近年來，越來越多的研究報道了線粒體中一碳代謝的生物學重要性，于是引入L-[2,3,3-2H]-絲氨酸作為穩(wěn)定同位素示蹤劑，以闡明一碳單元在細胞中的代謝模式.

首先，絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶(SHMT)利用四氫葉酸(THF)轉(zhuǎn)化絲氨酸為甘氨酸，并產(chǎn)生5,10-亞甲基四氫葉酸(5,10-meTHF)，且該反應可逆.SHMT1和SHMT2分別在胞漿和線粒體中分解絲氨酸，其流動方向取決于每個區(qū)室中一碳單元的供需情況[13].在這兩個區(qū)室中都編碼可以實現(xiàn)5,10-meTHF到甲酸的轉(zhuǎn)化代謝酶且該反應可逆，在胞漿中為亞甲基四氫葉酸脫氫酶1(MTHFD1)，在線粒體中為雙功能脫氫酶/環(huán)化水解酶(MTHFD2/2L)[14].另外，以5,10-meTHF為底物，胸苷合成酶(TYMS)可將一個甲基單位轉(zhuǎn)移至單磷酸脫氧尿苷(dUMP)上，以合成三磷酸脫氧胸苷(dTMP)，該過程發(fā)生在胞漿中.

通過追蹤[2,3,3-2H3]-絲氨酸中的2H插入一碳代謝的終產(chǎn)物(如胸苷)，可以確定絲氨酸的區(qū)室化代謝[15].絲氨酸若在線粒體中代謝會造成3位碳的1個質(zhì)子在氧化成甲酸鹽的過程中丟失(如圖3中藍色點所示).此外，[2,2-2H2]-甘氨酸在線粒體中代謝時2位碳的1個質(zhì)子氧化成甲酸鹽丟失(如圖3中綠色點所示).此時丟失的甲酸鹽在胞漿葉酸代謝池中發(fā)生還原反應，產(chǎn)生同位素異型體[M+1]的dTMP；而在胞漿中，被SHMT1分解的絲氨酸則把2個質(zhì)子轉(zhuǎn)移至5,10-meTHF上，產(chǎn)生[M+2]的dTMP.通過分析dTMP的同位素異型體[M+1]/[M+2]即可知絲氨酸在線粒體與胞漿中的代謝分流比例.

NAD(P)+.氧化型輔酶Ⅱ(或Ⅰ)；NAD(P)H.還原型輔酶Ⅱ(或Ⅰ)；GLDC.甘氨酸脫羧酶.

1.4 2H標記示蹤NADH或NADPH

NADH和NADPH是細胞中重要的能量和還原物質(zhì).傳統(tǒng)的NADH和NADPH檢測使用試劑盒，僅能觀察細胞中NADH或NADPH的變化趨勢.盡管遺傳熒光標記可以實現(xiàn)亞細胞定位，但依然無法知曉NADH或NADPH的具體生化反應歷程.為此，有必要使用2H標記的穩(wěn)定同位素示蹤技術來準確地追蹤NADH或NADPH的產(chǎn)生.這些代謝物的降解速度比其他碳水化合物要快得多，特別是NADPH極易被氧化，故代謝物提取與檢測需要特別注意方法的選擇及優(yōu)化[16].磷酸戊糖途徑中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(G6PD)和6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶(6PGD)，其他酶如異檸檬酸脫氫酶(IDH)、蘋果酸激酶、乙醛脫氫酶和MTHFD也可催化產(chǎn)生NADPH[17-18]，故可引入[3-2H]-葡萄糖或[1-2H]-葡萄糖來標記NADP2H[19]；另外，葡萄糖的4位碳上標記2H，則可以通過 3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)的作用來標記NAD2H(圖4).由此可見，同一代謝物同一元素不同的標記位置所能示蹤的代謝通路不同，故需根據(jù)所要回答的科學問題和生物化學反應原理選擇合適的穩(wěn)定同位素標記示蹤劑.

LDH.乳酸脫氫酶.

2 代謝途徑通量實現(xiàn)的基本流程

2.1 天然同位素的校正

當引入穩(wěn)定同位素后，依據(jù)機體的生物化學反應，代謝物也會產(chǎn)生相應的同位素分布模式.同位素的產(chǎn)生有兩個來源：一方面是摻入帶有同位素標記的營養(yǎng)物質(zhì)；另一方面也可能是由天然的同位素豐度所致.生物分子中最常見的天然同位素是13C，天然豐度為1.07%[20].其他同位素原子比較少見，但還是會有重大影響.15N天然豐度為0.368%，2H天然豐度為0.011 5%，17O天然豐度為0.038%，18O天然豐度為0.205%，29Si天然豐度為4.683%，30Si天然豐度為3.087%[21-23].以細胞中主要的能量載體三磷酸腺苷(ATP，C10H16N5O13P3)為例，13C的天然豐度占[M+1]峰值的大部分，而18O是[M+2]峰的最大干擾因素.由于天然同位素的存在，依據(jù)二項式分布定理，原本標記水平較低的組分在數(shù)據(jù)上顯示水平較高，所以此時應對質(zhì)譜檢測到的同位素標記分布質(zhì)量分數(shù)解卷積，以求取準確的同位素標記分數(shù)，這一過程稱作同位素豐度校正.

目前已經(jīng)出現(xiàn)一系列校正軟件，以IsoCor軟件[24]為典型代表，其主要優(yōu)勢在于可校正各種元素種類，原理如下：

ICcor=CM-1·ICmeas，

(1)

其中，ICcor表示校正后的實際同位素分布信息，CM-1表示校正矩陣，ICmeas表示經(jīng)質(zhì)譜檢測得到的原始同位素分布信息.

相比于IsoCor軟件，AccuCor軟件[25]所得結果則更加準確.考慮到質(zhì)譜的分辨率(即區(qū)分兩個質(zhì)量相近離子的能力)，如對于絲氨酸(C3H7NO3)中的13C或15N均是[M+1]，若是低分辨率則無法區(qū)分，若是高分辨率則兩個峰得以分開.

Δm≥1.66×fwhm,

(2)

其中，Δm表示峰質(zhì)心的質(zhì)荷比差值，fwhm表示半峰全寬.式(2)考慮了質(zhì)譜分辨率，使IsoCor軟件在校正高分辨率質(zhì)譜所得數(shù)據(jù)誤差較大的問題得到明顯改善.

關于同時校正雙同位素(如C和N)標記的軟件也逐漸出現(xiàn)[26].校正天然同位素豐度的軟件日趨理想化將有助于獲取真實標記信息.

2.2 代謝通量分析(MFA)的相關算法

當引入穩(wěn)定同位素示蹤后，分析目的是準確映射出示蹤劑參與代謝通路的活性變化[23,27].MFA已是一項發(fā)展成熟的定量研究代謝的重要技術[28]，使用穩(wěn)定同位素標記的示蹤信息可計算出通量，即細胞的代謝反應速率.

如圖5(a)所示，當引入穩(wěn)定同位素標記A后，B的生成通量是fin，消耗通量是fout，若此時達到代謝物穩(wěn)態(tài)，則滿足

fin=fout=fB.

(3)

若處于代謝物穩(wěn)態(tài)而同位素標記非穩(wěn)態(tài)時，如圖5(b)所示，當B的未標記形式逐漸被標記形式所取代，可得B的未標記形式隨時間變化的函數(shù)

FC表示代謝物的同位素分布模式濃度占代謝物總濃度的百分比.

(4)

其中，cB,U表示未標記的B的濃度，cB,T表示代謝物B的總濃度，其解析解為

(5)

此時即可求得穩(wěn)定狀態(tài)下B的代謝通量fB.

然而在非穩(wěn)定狀態(tài)下求解代謝通量較為復雜，對于B的標記變化情況可列出

(6)

其中,ΔmB表示經(jīng)過t時間后B的標記模式(同位素標記分布比例)凈改變，mA和mB分別表示代謝物A和B的標記模式，V表示細胞的體積.

已知非穩(wěn)態(tài)代謝模式下，代謝物的標記模式受代謝物的生成通量和濃度大小影響，

(7)

當明確cB,T以及mA、mB后，即可求得此時fin的值.

有關MFA中常用的穩(wěn)定同位素標記及其所示蹤的關鍵代謝通路見表1.

表1 常用穩(wěn)定同位素示蹤劑及其在代謝通路示蹤中的應用

3 代謝流分析技術應用以及腫瘤代謝的解析

3.1 葡萄糖的代謝命運——新生化途徑的發(fā)現(xiàn)

代謝性疾病發(fā)生的一個重要原因是過多的營養(yǎng)攝取導致溢流代謝(overflow metabolism)的發(fā)生，主要表現(xiàn)為代謝底物的不完全氧化及代謝副產(chǎn)物的產(chǎn)生.如Warburg效應指出：在腫瘤細胞中，不論氧氣是否充足，葡萄糖代謝都更傾向于向乳酸的轉(zhuǎn)化[52-53].乙酰輔酶A是一個中心碳代謝的中間代謝物，被廣泛用于生物大分子合成和能量產(chǎn)生，以支持細胞生長和增殖，在人體中其主要來自葡萄糖或其他常規(guī)碳源，如谷氨酰胺和脂肪酸等[54-55].已有研究報道在一些壓力應激條件下(如缺氧)，腫瘤細胞會利用乙酸作為其主要的碳源以支持細胞存活和增殖.乙酸鹽的代謝為乙酰輔酶A的產(chǎn)生提供了一個并行途徑，因此乙酸鹽可以支持蛋白乙?；爸舅岷铣?，而與檸檬酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A無關[56].鑒于可替代的碳源通常來自溢流代謝，Locasale課題組[39,57-58]開展了對細胞內(nèi)乙酸合成路徑的研究：通過引入18O標記的氧氣，運用液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測腫瘤細胞中新生成的被18O標記的乙酸，證明活性氧(ROS)可以作為親核試劑；隨后結合[13C3]-丙酮酸穩(wěn)定同位素標記，證實丙酮酸經(jīng)非酶促反應生成乙酸鹽.上述結果提示葡萄糖代謝在清除ROS中發(fā)揮一定作用[59].如何結合葡萄糖代謝與氧化應激并將其作為抗癌的合成致死策略，可能是腫瘤治療未來研究的一個新方向.

3.2 谷氨酰胺的代謝命運——碳與氮的協(xié)同代謝

增殖的腫瘤細胞會進行細胞代謝重編程，以適應不利的生長環(huán)境(如缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏等).Warburg效應提及腫瘤細胞會增加葡萄糖的代謝通量用以分泌乳酸，這提示腫瘤細胞的生長缺失了重要的碳源葡萄糖[60].然而細胞中另一種營養(yǎng)物質(zhì)谷氨酰胺，是血液中含量最豐富的氨基酸，也可作為一種重要的碳源以支持能量產(chǎn)生及物質(zhì)積累.一個谷氨酰胺分子包含5個C原子和2個N原子.當谷氨酰胺中的C被過度利用時，已有研究報道谷氨酰胺可通過谷氨酰胺酶(GLS)和谷氨酸脫氫酶(GLUD)的脫氨作用為細胞提供α-酮戊二酸[61]，伴隨此過程產(chǎn)生大量的溢流氨會對細胞產(chǎn)生毒性，這對于增殖的腫瘤細胞非常不利.

近期，李兵輝團隊[62]揭示了谷氨酰胺中C和N的協(xié)同代謝機制.目前谷氨酰胺中的C用于合成脂類已得到廣泛認可，已有研究報道谷氨酰胺的N在腫瘤細胞中代謝成氨，具有潛在毒性[63].在缺氧條件下，核苷酸的前體在腫瘤細胞中積累，主要包括氨甲酰天冬氨酸、二氫乳清酸和乳清酸等；進一步使用多種穩(wěn)定同位素標記的示蹤分析，發(fā)現(xiàn)谷氨酰胺的N在缺氧條件下主要富集在二氫乳清酸和乳清酸中，并被排出體外[63-65].該研究揭示了谷氨酰胺中C和N的協(xié)同代謝命運，為臨床上腫瘤的靶向治療提供了重要參考.

實際上，異常改變的、高活性的代謝過程中生成的氨可以作為“代謝廢物”回收，被重新利用合成氨基酸為腫瘤細胞提供氮源[66]；而且氨的過度累積可以被鳥氨酸脫羧酶的蛋白翻譯過程所“感知”，具有調(diào)控多胺合成從而影響腫瘤細胞增殖的生物學功能[67].

3.3 亞細胞結構之間的代謝互作——線粒體與細胞質(zhì)

代謝活動的亞細胞區(qū)室定位是定義真核細胞的重要標志之一.不同代謝底物和酶的混合池提供了細胞代謝的靈活性，以適應細胞的內(nèi)部需求并響應外部干擾.已有報道指出在細胞器之間的代謝互作可支持腫瘤細胞的存活與生長[68-70].如胞質(zhì)中的一碳通量可以彌補線粒體中葉酸代謝途徑的缺失，線粒體與胞質(zhì)間的蘋果酸-天冬氨酸穿梭機制在電子傳遞鏈受損時可以支持腫瘤細胞的生長等，然而細胞器之間的代謝交互目前尚不清晰[71].Lee等[68]建立了基于亞細胞器區(qū)室分離的空間代謝組學方法，描述了在腫瘤細胞中谷氨酰胺代謝的全景.已有研究報道了多種快速分離細胞器的方法及豐富的腫瘤細胞內(nèi)代謝物信息；為了進一步明確定量線粒體與胞質(zhì)之間的代謝通量，以宮頸癌HeLa細胞為研究對象，結合穩(wěn)定同位素標記([U-13C6]-葡萄糖和[U-13C5]-谷氨酰胺)、線粒體快速分離技術、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用及數(shù)學模型建立的空間代謝流組學方法，定量谷氨酰胺在線粒體及胞質(zhì)之間的代謝通量，揭示了在標準常氧條件下，還原型IDH1調(diào)控的谷氨酰胺可以作為細胞中脂肪酸生物合成的碳源凈貢獻者[68].該工作將代謝流的研究進一步拓展到亞細胞器層次，具有重要的參考意義.從這一角度來講，關于細胞內(nèi)其他細胞器(如溶酶體、過氧化物酶體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等)中所包含的代謝生化反應及代謝互作仍有待于研究，且此方法是否可應用于臨床診斷或?qū)で笊飿酥疚锶孕枭钊胩剿?

3.4 能量代謝中被忽視的碳源

哺乳動物組織通過血液循環(huán)促進營養(yǎng)物質(zhì)包括糖、脂肪、蛋白等的供應[72].在有氧條件下，通常認為葡萄糖被組織經(jīng)三羧酸循環(huán)方式完全“燃燒”產(chǎn)生CO2.然而Warburg效應提示組織和腫瘤細胞會更傾向于將大部分葡萄糖進行糖酵解，經(jīng)分解代謝成為乳酸.長久以來，基于劇烈運動下的肌肉或缺氧組織中積累的特性，乳酸都被視作無氧條件下細胞呼吸代謝產(chǎn)生的廢物.盡管被認知為代謝廢物，但機體并不能直接排泄乳酸，關于血液中乳酸代謝的生理意義及潛在代謝機制也尚不明確.

Joshua Rabinowitz團隊[73]提出了顛覆性觀點：乳酸不僅是無氧條件下的代謝產(chǎn)物，更可能是人體最重要的能量載體，同時它還是癌細胞最重要的直接營養(yǎng)來源.通過13C標記追蹤血液循環(huán)中葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺等30種含碳代謝物的流通量，他們得出循環(huán)通量最大的是乳酸，這表明乳酸不僅是缺氧條件下的一種代謝產(chǎn)物(即所熟知的代謝廢物)，而且是與葡萄糖、氨基酸和酮體一樣關鍵的能量載體，甚至比這些以往認為的供能物質(zhì)更重要[73].這一發(fā)現(xiàn)為今后糖尿病和其他有關能量代謝疾病的研究提供了新思路，對于癌癥的研究也有重要意義.實驗室傳統(tǒng)的研究均基于體外培養(yǎng)的細胞，而不能使細胞完全模擬體內(nèi)環(huán)境，因此真正在體內(nèi)水平了解癌癥的代謝特性才更有助于發(fā)現(xiàn)癌癥的代謝弱點并給予治療.

類似地，丙氨酸可以逆轉(zhuǎn)為丙酮酸進入三羧酸循環(huán)，特別是在自噬條件下，腫瘤細胞可利用丙氨酸作為能量來源的替代碳源[74].此外，肌苷通過嘌呤核苷磷酸化酶產(chǎn)生1-磷酸核糖，轉(zhuǎn)化成5-磷酸核糖，進而通過磷酸戊糖途徑和糖酵解通路進入三羧酸循環(huán)以提供能量[75].絲氨酸消旋酶(serine racemase)不僅可以把L-絲氨酸轉(zhuǎn)化為D-絲氨酸，還可以水解產(chǎn)生丙酮酸，為腫瘤細胞提供能量[76].通?？梢圆捎梅€(wěn)定同位素標記的示蹤分析檢測三羧酸循環(huán)中間產(chǎn)物的標記情況，從而獲悉感興趣的代謝物能否在某些特定病理、生理條件下作為替代碳源參與能量代謝.

3.5 果糖——真實的代謝命運

由于人們對甜味的滿足感，在過去的兩個世紀里，果糖的人均消費量增大約100倍[77].高果糖的攝入也逐漸被認為是代謝疾病的罪魁禍首.流行病學統(tǒng)計顯示果糖攝取與肥胖、非酒精性脂肪肝、Ⅱ型糖尿病、腎功能紊亂和心血管疾病之間具有很強的相關性[38]，然而這種聯(lián)系的生物學機制仍存在爭論.已有研究報道，果糖轉(zhuǎn)變?yōu)楣?1-磷酸主要是由己酮糖(磷酸)激酶(KHK)調(diào)控的，且KHK主要在肝臟中表達，因此一般認為飲食中攝入的果糖代謝主要在肝臟中完成[78].Joshua Rabinowitz團隊[73]在小鼠實驗中發(fā)現(xiàn)：正常飲食攝入的果糖約90%主要在小腸中代謝，而并非過去認為的肝臟；如果攝入果糖量過高，那么多余的部分會被轉(zhuǎn)移至肝臟中進行分解代謝.上述研究通過穩(wěn)定同位素標記的代謝流分析證實小腸是果糖代謝的主要場所，這提示體內(nèi)代謝流分析技術對于鑒定重要小分子的代謝命運具有重要意義.

4 代謝流分析技術在腫瘤動態(tài)變化中的應用

腫瘤細胞代謝重編程是腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要特征.根據(jù)具體的科學問題，選擇合適的穩(wěn)定同位素示蹤劑開展代謝流分析，有助于解析代謝通路活性隨腫瘤發(fā)生發(fā)展的動態(tài)變化，從而鑒定腫瘤的代謝弱點，實現(xiàn)個性化治療[79].以受體酪氨酸為例，不同受體酪氨酸可能驅(qū)動不同的代謝模式.為此，本課題組[80]采用多種穩(wěn)定同位素標記的示蹤劑，發(fā)現(xiàn)表皮生長因子受體(EGFR)驅(qū)動的腫瘤細胞多依賴于絲氨酸合成通路，而成纖維細胞生長因子受體(FGFR)驅(qū)動的腫瘤細胞則依賴于乳酸代謝；因此，使用絲氨酸合成通路的限速酶3-磷酸甘油酸脫氫酶抑制劑或LDH抑制劑，可分別有效抑制EGFR或FGFR驅(qū)動的腫瘤生長.對于小鼠體內(nèi)的代謝流分析，則可通過頸靜脈插管灌流穩(wěn)定同位素標記的示蹤劑，同樣可以定量分析癌組織與癌旁組織的代謝通路活性差異[81].當使用[1,2-13C2]-葡萄糖作為示蹤劑時，鑒定了非氧化型戊糖磷酸途徑的轉(zhuǎn)酮醇酶促進肝癌發(fā)生發(fā)展的一個重要機制，即促進氧化型戊糖磷酸途徑回流至糖酵解通路而產(chǎn)生過量乳酸；而當敲除轉(zhuǎn)酮醇酶基因時，5-磷酸核糖出現(xiàn)累積并促進核苷酸合成，從而穩(wěn)定基因組，減緩肝臟損傷和腫瘤的生長[82].在肺癌研究中，以13C標記的谷氨酰胺或谷氨酸示蹤還原型谷胱甘肽的合成，發(fā)現(xiàn)小鼠體內(nèi)肺癌組織比癌旁組織中的谷胱甘肽合成更快[83].

代謝流分析技術還可以揭示體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)代謝物的周轉(zhuǎn)通量，以及組織中糖酵解中間代謝物的來源，這將有助于鑒定器官代謝交流[84].最近一項研究將體內(nèi)代謝流分析技術應用于黑色素瘤的斑馬魚(Daniorerio)模型，結果發(fā)現(xiàn)肝臟與黑色素瘤之間存在丙氨酸循環(huán)[85].穩(wěn)定同位素標記的示蹤分析還可以解析腫瘤微環(huán)境中的代謝物競爭與交換.近期的一項研究中，用穩(wěn)定同位素標記的代謝流分析技術證實了腫瘤微環(huán)境中的B細胞可以分泌出γ-氨基丁酸，進而發(fā)揮抗腫瘤的免疫調(diào)節(jié)作用[86].綜上所述，開發(fā)和運用穩(wěn)定同位素標記的代謝流分析技術，有助于解析代謝通路活性、代謝重編程規(guī)律與代謝物交換等生物化學機制.

5 總結與展望

本文所提及的體外研究均最大程度地利用了代謝流分析的優(yōu)勢和特點，著眼于某一關鍵代謝底物或中間代謝產(chǎn)物，通過監(jiān)測代謝物在特定代謝途徑和局部代謝網(wǎng)絡上的流通發(fā)現(xiàn)新機制.不僅如此，在體內(nèi)研究中，甚至發(fā)現(xiàn)了新的顛覆性代謝通路的可能性，即腫瘤細胞的營養(yǎng)來源.由于體內(nèi)環(huán)境復雜，細胞間、器官間的信號傳遞十分頻繁，所以研究人員將整個研究置于更復雜的層次上，以組織、器官整體以及血液循環(huán)作為研究對象，再通過代謝流分析技術監(jiān)測和定量代謝物的分布與通量變化.體內(nèi)與體外的代謝流分析分別從宏觀與微觀的角度研究代謝，兩者互補且充分結合了定性與定量的思想，從而精準地追蹤代謝物的代謝命運.可以預見，代謝流技術方法的進步與完善將為人們揭開更多生物代謝的謎團.

目前代謝流分析技術尚存一些未解決的問題，如在亞細胞層次上的研究進展有限，所需成本較高，且如何保持代謝物的狀態(tài)也是關鍵.針對這些問題，有必要發(fā)展快速分離細胞器以及同時分離多種細胞器的方法，提高檢測更多代謝物的能力，更新代謝模型和分析軟件，并兼顧降低成本的問題.