劉星辰，呂泓玥，金揚湖，周 超

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022）

1980 年代中期人造納米技術發(fā)展迅速，納米材料被廣泛應用于電氣，醫(yī)學和材料領域[1]。近年來納米工藝愈加完善，納米消費品使用量日益增加，天然及人工合成的納米材料不可避免地被排入海洋、湖泊等環(huán)境，成為亟待解決的環(huán)境污染問題之一。納米銀顆粒作為已被廣泛應用的納米顆粒之一，于微電子領域及醫(yī)用消毒領域占據(jù)重要地位，每年天然開采以及人工合成的數(shù)量都在上升[2-4]。早有研究表明，納米銀顆粒于天然水中釋放銀離子，且觀察到不同大小和形狀的納米銀脅迫導致天然水域生物受到毒性作用[5]。已證明納米銀顆粒對大多數(shù)生物組織和生物體有毒性作用，例如細菌、人類、哺乳動物及藻類等[6-8]，所以研究納米銀對海洋生態(tài)系統(tǒng)毒性作用機制已迫在眉睫。

橈足類作為海洋種群數(shù)量最大的類群之一，憑借對各類污染物高度敏感性，常作為優(yōu)異海洋污染物監(jiān)測的模式生物[9-10]。水蚤作為最早人工養(yǎng)殖的濾食性橈足類，廣布于溫帶及亞熱帶地區(qū)，與輪蟲、鹵蟲同為經(jīng)濟崽魚的開口餌料，占據(jù)海洋生物食物鏈的特殊地位，對海洋生態(tài)系統(tǒng)物質循環(huán)及污染監(jiān)控與防范具有重大意義[11]。本研究樣品為湯氏紡錘水蚤Acartia tonsa，個體尺寸小，成幼體形態(tài)結構差異大，對外界刺激敏感，實驗室內可大規(guī)模培養(yǎng)，故可作海洋生態(tài)毒理學模式生物，其毒理學相關研究對海洋海域生態(tài)指標評定有重要指示作用[12]。

本文通過研究不同環(huán)境濃度暴露下納米銀對湯氏紡錘水蚤生殖力、酶活力水平及抗氧化相關基因表達水平的影響，探究納米銀暴露時間增加是否會導致其顆粒于水蚤體內富集，探究湯氏紡錘水蚤對納米銀刺激相關應激效應機制，為海洋納米銀污染監(jiān)控及治理奠定基礎，為橈足類生態(tài)毒理學評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 微藻餌料培養(yǎng)

培養(yǎng)湯氏紡錘水蚤所用微藻餌料為球等鞭金藻Isochrysis galbana Parke（Iso）、波海紅胞藻Rhodmonas baltica Karsten（Rhodo）及Rhinomonas reticulate Lucas（Rhino）3 種海水微藻。微藻藻種皆由意大利環(huán)境保護所提供，于實驗室恒溫培養(yǎng)箱內世代培養(yǎng)。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)條件：溫度（20±0.5）℃，海水鹽度30，光照條件（12 h光照：12 h 黑暗），光照強度為2 000 lx。每日監(jiān)測微藻密度，微藻生長至指數(shù)生長期時及時補充海水F/2 培養(yǎng)基[13]。微藻藻種每半個月保種1 次，將微藻無菌接種至含F(xiàn)/2 培養(yǎng)基的50 mL 細胞培養(yǎng)瓶，并置于搖床上培養(yǎng)。

1.2 水蚤樣品

研究所用湯氏紡錘水蚤初代水蚤樣品取自亞德里亞海瀉湖區(qū)，于浙江海洋大學國家海洋設施養(yǎng)殖工程技術研究中心浮游生物實驗室連續(xù)世代培養(yǎng)。水蚤樣品置于3 L 培養(yǎng)缸中培養(yǎng)，成體投喂Iso-Rhino 及Rhodo，幼體投喂Iso，其余培養(yǎng)條件同上。培養(yǎng)期間氣泵不間斷補氧，定期調整氣泵大小，保證產(chǎn)生氣泡不影響水蚤正常運動。培養(yǎng)過程中定期換水（海水取自舟山市長峙島攬月湖，篩網(wǎng)粗濾后，0.45 μm 濾膜進行抽濾，高溫滅菌后備用）、清理培養(yǎng)缸底藻渣及水蚤糞便，并且定期進行湯氏紡錘水蚤成幼體分離培養(yǎng)[14]。

1.3 儀器

RXZ-500D 智能人工氣候箱（寧波江南儀器廠）；高壓滅菌鍋（上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；隔膜真空泵（天津津騰實驗設備有限公司）；SZ650BP 雙目體式顯微鏡（重慶奧特光學儀器有限公司）；BM-37XB 倒置生物顯微鏡（上海彼愛姆光學儀器制造有限公司）；TRIzon RNA 提取液（康為世紀生物科技有限公司）；熒光定量PCR 試劑盒（日本Takara 公司）；逆轉錄試劑盒（日本Takara 公司）。

1.4 急性、半慢性試驗

解剖鏡下用篩網(wǎng)分離培養(yǎng)體系中湯氏紡錘水蚤成及幼體，挑取500 只個體健康、肢體完整湯氏紡錘水蚤成體，于5 L 培養(yǎng)缸中暫養(yǎng)3 d，投喂4×105cell·mL-1微藻Iso，每日利用血細胞計算表計算剩余微藻濃度并補充餌料。其間保證曝氣，確保水蚤無大規(guī)模死亡，移除暫養(yǎng)過程中產(chǎn)生的卵，試驗開始取新鮮卵。根據(jù)文獻設立湯氏紡錘水蚤卵納米銀急性毒理試驗納米銀梯度濃度：0、0.1、0.5、1、2.5 和5 mg·L-1[15]，每個濃度組設定12 個平行，每孔放置10 枚健康紡錘水蚤卵，納米銀持續(xù)暴露48 h，光照（12 h 光照：12 h 黑暗），溫度20 ℃，根據(jù)試驗結果計算得到急性48 h-EC50=0.67 mg·L-1。依據(jù)納米銀對湯氏紡錘水蚤卵急性48 h-EC50設定半慢性毒理試驗濃度組：0、0.01、0.1、0.5 和1 mg·L-1，處理同上，持續(xù)刺激7 d，其他條件同上，計算得到卵半慢性7 d-EC50=0.2 mg·L-1。

1.5 慢性毒理試驗

根據(jù)納米銀對湯氏紡錘水蚤卵的半慢性7 d-EC50，設立湯氏紡錘水蚤納米銀慢性毒理試驗濃度為0，0.2 及0.4 mg·L-1，分別挑取1 對健康及肢體完整的雌雄湯氏紡錘水蚤置于100 mL 結晶皿，每組設立16個平行試驗，培養(yǎng)條件同上，水蚤于納米銀下暴露4 d，隔天轉移個體至新結晶皿，毒性刺激體系保持一致。觀察記錄成體死亡情況，若雄性個體死亡則補充雄體，雌性個體死亡則視為試驗失敗。其間分別記錄湯氏紡錘水蚤納米脅迫下的產(chǎn)卵量，卵孵化率以及排便量。

1.6 超氧化物歧化酶SOD 蛋白酶活性測定

挑取健康且肢體完整湯氏紡錘水蚤成體，暫養(yǎng)3 d。根據(jù)半慢性7 d-EC50設定0、1/8 EC50、1/4 EC50和1/2 EC50濃度組，每組50 只取形態(tài)大小差異小、運動能力強的成體置于100 mL 結晶皿中，培養(yǎng)體系為50 mL，其間正常投喂餌料，其他條件同上，進行慢性毒理試驗。設立取樣時間點：0、24、36、48、72 和96 h，將各個組各時間點的湯氏紡錘水蚤置于1.5 mL 離心管，加生理鹽水至1 mL，4 ℃暫存。冰浴條件下，研磨槍破碎水蚤樣品2 min，于4 ℃離心3 000 r·min-110 min，取上清液0.1 mL，按樣品比生理鹽水比例為1：9，稀釋成1%勻漿，使用南京建成總蛋白含量測定試劑盒，分別測定各個樣品OD 值，根據(jù)總蛋白標準曲線計算得湯氏紡錘水蚤總蛋白含量（mg prot·mL-1）。稀釋樣用南京建成超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒測定OD 值，結合總蛋白含量計算得納米銀脅迫后湯氏紡錘水蚤SOD 平均活力水平（U·mg-1prot）。

1.7 Ferritin 及Hsp70 基因表達水平測定

挑取健康且肢體完整湯氏紡錘水蚤成體50 只，暫養(yǎng)3 d。根據(jù)半慢性7 d-EC50設定0、1/8 EC50、1/4 EC50和1/2 EC50濃度組，處理條件同上，進行慢性毒理試驗。設立取樣時間點0、24、48、72 和96 h，將30 只水蚤成體置于1.5 mL 離心管。設計湯氏紡錘水蚤Hsp70 及Ferritin 基因的熒光定量PCR 引物及1 對βactin 基因（內參基因）引物，通過Trizol 試劑提取法提取水蚤RNA 后，通過TAKARA 反轉錄試劑盒反轉錄成cDNA 模板，對上述反轉錄產(chǎn)物進行RT-qPCR 試驗，目的基因與內參各設置10 個技術重復，排除重復組別中差異較大的數(shù)據(jù)，其余數(shù)據(jù)采用2-△△CT法進行基因表達分析。引物見表1。

表1 湯氏紡錘水蚤Hsp70 及Ferritin 基因熒光定量PCR 引物Tab.1 RT-PCR primers for Hsp70 and Ferritin genes in A.tonsa

1.8 結果計算及數(shù)據(jù)處理

湯氏紡錘水蚤孵化率計算：統(tǒng)計放置的新卵、孵化后的空卵及無節(jié)幼體數(shù)量進行綜合計數(shù)，攝食力通過統(tǒng)計糞便數(shù)計算。研究相關數(shù)據(jù)擬用SPSS25.0 軟件進行顯著性及方差分析，最終計算結果以均值±標準差（x±s）表示，P＜0.05 表示有顯著性差異。

2 結果

2.1 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤產(chǎn)卵量及卵孵化率的影響

研究結果顯示，納米銀慢性毒理試驗毒性積累具備時間效應。湯氏紡錘水蚤受納米銀脅迫時間增加，導致其產(chǎn)卵量逐日下降（圖1）。暴露于0.2 mg·L-1納米銀下，湯氏紡錘水蚤前兩日產(chǎn)卵量未受到影響，24 h 均產(chǎn)（11±1.5）枚卵，48 h 均產(chǎn)卵（11.5±1.7）枚。水蚤72 h 時產(chǎn)卵量開始出現(xiàn)下降趨勢，均產(chǎn)（10±0.9）枚卵，且于96 h 時有最低均產(chǎn)卵量為（6.1±1.8）枚（P＜0.05），產(chǎn)卵量相比對照組下降了58.8 %。隨著納米銀濃度增加，水蚤產(chǎn)卵量顯著下降。湯氏紡錘水蚤暴露于0.4 mg·L-1納米銀下，24 h 均產(chǎn)卵（8.1±1.6）枚，48 h 均產(chǎn)卵（6.3±1.2）枚，72 h時均產(chǎn)卵（5.3±1.3）枚，96 h 時有最低均產(chǎn)卵量為（2.9±0.6）枚（P＜0.05），各個時間段產(chǎn)卵量相較于對照組及0.2 mg·L-1納米銀組都有顯著下調。

圖1 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤產(chǎn)卵量的影響Fig.1 Effect of Ag NPs exposure on egg production of A.tonsa spawning quantity

研究發(fā)現(xiàn)卵孵化率與產(chǎn)卵量變化趨勢相似，納米銀暴露也會導致湯氏紡錘水蚤的卵孵化率顯著性下降，且濃度越高，平均卵孵化率與對照組差異越大（圖2）。0.2 mg·L-1納米銀暴露下，湯氏紡錘水蚤新卵孵化率低于對照組卵孵化率（P＜0.05），隨著暴露時間增加，卵孵化率分別為24 h（65.5±3.1）%，48 h（58.84±4.2）%，72 h（56.09±5.3）%，96 h 孵化率下降至最低值（44.89±4.1）%。0.4 mg·L-1納米銀作為高濃度組，組內卵孵化率相較于對照組和0.2 mg·L-1納米銀組有顯著差異，24 h及48 h 孵化率無明顯下降，72 h 孵化率為（31.54±2.2）%，96 h有最低孵化率為（15.71±4.1）%，2 個時間段卵孵化率顯著性降低（P＜0.05）。

圖2 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤卵孵化率的影響Fig.2 Effect of Ag NPs exposure on hatching rate of A.tonsa eggs

2.2 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤排便量的影響

試驗結果發(fā)現(xiàn)，納米銀暴露使水蚤攝食力大幅下降（圖3）。湯氏紡錘水蚤饑餓馴化24 h 后，相比于對照組水蚤的排便量，試驗組排便量顯著性減少。0.2 mg·L-1納米銀組于24 及48 h 下降幅度較小，從72 h 觀察到（79.8±11.9）個糞便（P＜0.05），96 h 時有最低排便量（56.8±9.2）個糞便（P＜0.05）。0.4 mg·L-1納米銀暴露下，湯氏紡錘水蚤排便量遠低于對照組，呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，24 h 平均糞便量（70.7±7.8）個，48 h 平均糞便量（56.5±5.1）個，72 h 平均糞便量（49.8±9.1）個，96 h 觀察到最低平均糞便量（27.1±12.2）個。納米銀慢性脅迫下，湯氏紡錘水蚤排便量受納米銀濃度及暴露時間調控。

圖3 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤排便量的影響Fig.3 Effect of silver nanometer exposure on fecal pellet of A.tonsa

2.3 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤SOD 蛋白酶活性的影響

納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤SOD 蛋白酶活力影響見圖4，可知納米銀脅迫下12 h 時SOD 酶活皆受到抑制，1/2 EC50納米銀暴露下平均SOD 酶活為（27.5±4.8）U·mg-1prot 遠低于對照組（48.6±4.5）U·mg-1prot。1/8 EC50納米銀于24 h 時有最高SOD 酶活（67.6±8.5）U·mg-1prot（P＜0.05），該濃度組SOD 活力水平隨后回復正常水平。48 h 時2 個高濃度組SOD 活力水平都到達峰值，1/4 EC50SOD 平均酶活為（92.2±3.9）U·mg-1prot（P＜0.01），1/2 EC50納米銀脅迫下SOD 平均酶活為（70.3±3.1）U·mg-1prot（P＜0.05）。72 h 之后1/4 EC50及1/8 EC50組SOD 酶活恢復正常水平，而1/2 EC50納米銀脅迫抑制SOD合成及酶活力，活性水平遠低于對照組水平（P＜0.05）。

圖4 納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤SOD 酶活水平的影響Fig.4 Effect of Ag NPs exposure on SOD enzyme activity of A.tonsa

2.4 納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤Ferritin 及Hsp70 基因表達水平的影響

通過RT-PCR 對湯氏紡錘水蚤Ferritin 及Hsp70 基因，以湯氏紡錘水蚤β-action 為內參基因，選取對照組湯氏紡錘水蚤表達水平作為參照，每個處理進行3 次重復，試驗結果表明，納米銀脅迫湯氏紡錘水蚤，其Ferritin 及Hsp70 基因于不同時間段及不同濃度組下呈現(xiàn)出差異性表達（圖5，圖6）。

圖5 納米銀對湯氏紡錘水蚤Ferritin 基因表達水平的影響Fig.5 Experssion level of Ferritin in A.tonsa with Ag NPs exposure

圖6 納米銀對湯氏紡錘水蚤Hsp70 基因表達水平的影響Fig.6 Experssion level of Hsp70 in A.tonsa with Ag NPs exposure

分析結果如下：不同濃度納米銀脅迫下湯氏紡錘水蚤Ferritin 基因mRNA 表達24 h 時皆有顯著性低量表達，1/2 EC50納米銀暴露下有最低表達量僅對照組表達水平0.13 倍；48 h 時1/2 EC50有最大表達量，1/4 EC50表達水平到達峰值（P＜0.05）；72 h 除1/8 EC50組表達量到達峰值后（P＜0.05），其余組別皆呈現(xiàn)下降趨勢；水蚤受納米銀脅迫96 h 后，各組Ferritin 基因表達水平相對回落。Hsp70 基因mRNA 表達量于納米銀脅迫下24 h 同為低量表達；48 h 時1/2EC50表達量到達峰值（P＜0.05），其余組別依舊為低表達；1/8 EC50及1/4 EC50納米銀組于72 h 時有最高表達量（P＜0.05）。高濃度納米銀脅迫對Ferritin 及Hsp70 表達量的抑制遠高于低濃度納米銀組，說明納米銀脅迫對2 種基因表達水平存在時間效應及濃度效應。

3 討論

湯氏紡錘水蚤作為典型海洋濾食性浮游生物，因自身缺乏作為排毒器官的肝胰腺，消化道僅由一層上皮細胞組成，并負責水蚤消化道的消化作用。ZHOU，et al[16]通過電鏡發(fā)現(xiàn)湯氏紡錘水蚤成體會攝入附著納米鎳顆粒的微藻，并在消化道上富集，導致機體攝食力降低。研究發(fā)現(xiàn)50 nm 左右的納米材料不但可以滲透到水蚤的消化器官，甚至于生殖器官和胚胎都可以發(fā)現(xiàn)納米顆粒存在[17]。結果顯示納米顆粒暴露導致湯氏紡錘水蚤產(chǎn)卵量顯著下降，說明具備小尺寸效應的納米銀顆粒能夠進入水蚤體內，從消化道轉移至生殖器官，對水蚤產(chǎn)生生殖毒性[18]。隨暴露時間及納米銀濃度增加，毒性積累越多，對水蚤生殖能力抑制越強。LEE，et al[19]研究發(fā)現(xiàn)納米顆?？梢酝ㄟ^胚胎絨毛膜孔，直接脅迫胚胎發(fā)育。納米銀可導致斑馬魚Danio rerio 絨毛膜上氧氣交換效率降低或停滯，造成胚胎孵化延遲、心率降低、心包水腫和胚胎死亡。湯氏紡錘水蚤卵孵化率同樣隨納米銀濃度及時間增加而降低，這可能是水蚤成體在納米銀暴露時攝入納米銀顆粒，進入生殖系統(tǒng)，穿刺水蚤卵細胞，干預卵細胞生長發(fā)育；另一種可能是卵直接暴露在納米銀環(huán)境中，小顆?；蛴坞x的銀離子通過細胞膜進入水蚤卵，抑制水蚤卵細胞發(fā)育，并產(chǎn)生致死作用。

水環(huán)境中納米顆粒團聚、沉降行為是評估其水環(huán)境暴露風險的重要憑證[20]。目前研究表明，納米材料團聚及沉降對水環(huán)境底棲生物更有威脅。納米材料由于自身尺寸較小，相對比表面積大、表化學能高，環(huán)境中的納米顆粒會自發(fā)團聚，或結合其他有機物、有害物質形成復合體[21]。AAL，et al[22]發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦團聚，會增加其在水環(huán)境中的停滯時間，增加其被水體食物鏈富集可能性，從而對高等生物產(chǎn)生毒性迫害。納米銀顆粒憑借范德華力、靜電力等作用力，納米銀顆粒自發(fā)團聚，于水蚤體運動器官上富集，導致水蚤運動能力大幅下降，干擾生命活動，其中攝食力大幅度下降，排便量也相應地減少。納米銀顆粒也能通過攝食途徑被湯氏紡錘水蚤成體攝入，于其體內富集，并積累在消化道內，造成水蚤消化能力減弱，觀察到的糞便量也因此減少。研究發(fā)現(xiàn)納米氧化鋅顆粒會導致大型蚤肢體受損，體內脂類過氧化，能量儲備能力下降。而通過攝食的納米顆粒會導致水蚤體內與氧運輸和抗氧化酶有關的指數(shù)下降[23]。因此納米銀顆粒進入湯氏紡錘水蚤正常健康細胞中，可能引起各種細胞功能的自我調節(jié)，如發(fā)生氧化應激、細胞本身或細胞器膜的損傷。湯氏紡錘水蚤在納米銀脅迫之下，游離銀離子對其器官細胞產(chǎn)生強烈的氧化反應，并在暴露初期不徹底破壞其抗氧化系統(tǒng)情況下，短期內促進機體合成超氧化物歧化酶對抗這種氧化反應，但隨著暴露時間及納米銀濃度增加，對水蚤抗氧化系統(tǒng)會造成不可逆的損傷，SOD 酶合成水平逐漸下降，進而導致機體生殖能力、運動能力下降，并機體逐漸失去活力或者死亡。

熱激蛋白作為應激類功能蛋白家族，在細胞受到刺激就會大量合成。Hsp70 是熱激蛋白家族中研究比較透徹的一種，能對抗外界不利因素。Ferritin 鐵蛋白存在于各種有機體體內，參與儲存及釋放鐵離子，同樣可以反映機體對外界環(huán)境產(chǎn)生應激反應。研究表明，日本虎斑猛水蚤Tigriopus japonicus 暴露在納米塑料顆粒中，水蚤體內活性氧水平上升，抗氧化劑相關的基因表達受到調節(jié)，抗氧化酶的活性顯著變化[18]。研究表明暴露于納米銀中的奧利亞羅非魚，其所有組織中均觀察到高水平的Hsp70 表達，加之肌肉、腎臟和肝臟等免疫組織化學染色反映了羅非魚Oreochromis mossambicus 對納米顆粒強烈的應激反應[24]。本研究中納米銀脅迫湯氏紡錘水蚤Hsp70 及Ferritin 2 個基因，二者的表達水平存在相對時間效應及相對濃度效應。納米銀初脅迫對水蚤機體造成損傷，24 h 有顯著低量表達。試驗期間會產(chǎn)生表達峰值，到達峰值后，反而會呈現(xiàn)顯著下降的趨勢，說明湯氏紡錘水蚤成體長期暴露下會產(chǎn)生基因毒性，且這個毒性會隨時間積累。2 種基因變化趨勢說明湯氏紡錘水蚤機體會受納米銀脅迫，受到氧化損傷，機體產(chǎn)生應激反應，Hsp70和Ferritin 短期內會大量表達，隨著毒性積累超過水蚤能夠承受的閾值，可能會影響湯氏紡錘水蚤的生殖能力及攝食能力，同樣可能造成抗氧化相關基因不可逆的損傷，甚至因體內ROS 過量導致死亡。

綜上所述，納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤生殖力，酶活力以及抗氧化基因表達水平皆存在較強抑制作用。水蚤體內抗氧化機制存在納米銀低濃度初期誘導，長期及高濃度暴露有顯著抑制趨勢，因此湯氏紡錘水蚤對納米銀脅迫的響應存在著明顯的時間效應以及濃度效應。本文通過研究納米銀暴露對湯氏紡錘水蚤生理指標、酶活力指標及基因表達水平響應機制，從生態(tài)毒理學層面初步分析納米銀脅迫對湯氏紡錘水蚤的毒性作用機制，為海洋橈足類毒理學研究提供基礎數(shù)據(jù)，為海洋納米銀污染監(jiān)控及治理提供監(jiān)測手段。