呂博雅，張珍悅，趙 李，李曉萍，李家創(chuàng)，白宇皓，刁慧珊，劉 洋，楊群慧，劉淑會(huì)，武 軍，陳新宏

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院/陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西楊凌 712100;2.陜西省興平市種子管理站，陜西興平 713100)

小麥?zhǔn)鞘澜缟献钪匾募Z食作物之一，加快小麥育種進(jìn)程，提高小麥產(chǎn)量、品質(zhì)和抗逆性仍是小麥育種工作者的主要目標(biāo)。但是，小麥遺傳變異范圍較窄、遺傳多樣性降低等因素阻礙了小麥育種的發(fā)展。利用遠(yuǎn)緣雜交技術(shù)可以將優(yōu)良基因?qū)肫胀ㄐ←?，豐富小麥遺傳多樣性。華山新麥草(Keng)屬于禾本科小麥族新麥草屬，是中國(guó)秦嶺山脈華山地區(qū)特有的小麥近緣野生種。華山新麥草具有早熟、多分蘗、多小穗、抗逆(抗旱、耐鹽堿、耐瘠薄)、抗病(抗條銹病、白粉病和全蝕病)等優(yōu)良性狀，是小麥遺傳改良的重要基因源。

為了利用華山新麥草中的優(yōu)良性狀，陳漱陽(yáng)等在20世紀(jì)80年代開始了華山新麥草與普通小麥的遠(yuǎn)緣雜交，并獲得了一批小麥-華山新麥草衍生后代。之后，傅 杰等、武 軍等和Zhao等等也創(chuàng)造出了一系列的小麥-華山新麥草異附加系、異代換系和易位系。本課題組前期通過(guò)回交和自交，獲得了一套農(nóng)藝性狀優(yōu)良、抗病性強(qiáng)的小麥-華山新麥草全套(1Ns～7Ns)二體附加系。與此同時(shí)，研究者們還建立了鑒定和檢測(cè)小麥-華山新麥草后代外源染色體或基因的方法，這些方法包括生化鑒定(同工酶、種子貯藏蛋白分析)，細(xì)胞學(xué)鑒定(C-分帶、基因組原位雜交、熒光原位雜交)等。但遠(yuǎn)緣雜交后代穩(wěn)定性差，分離復(fù)雜且數(shù)量龐大，以上方法成本高且耗時(shí)長(zhǎng)，限制了華山新麥草在小麥遺傳育種中的應(yīng)用。而RAPD、EST-SSR、EST-STS和SCAR標(biāo)記，成本相對(duì)較低，便于高通量分析，可有效地確定小麥背景中異源染色體的同源關(guān)系。其中SCAR標(biāo)記(通常為18～24 bp)具有較高的特異性和可重復(fù)性，是鑒定植物的重要標(biāo)記之一。利用RAPD、AFLP、SSR和ISSR技術(shù)，已開發(fā)出多種類型的小麥SCAR標(biāo)記。陳林剛等利用200個(gè)RAPD隨機(jī)引物，經(jīng)BLAST分析和Southern雜交鑒定，篩選出3條華山新麥草基因組的特異重復(fù)序列，但尚未轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記。隨后，研究者們利用RAPD標(biāo)記開發(fā)了一系列特異性SCAR標(biāo)記，包括5個(gè)Ns基因組特異性SCAR標(biāo)記、1個(gè)1Ns染色體特異性SCAR標(biāo)記、2個(gè)3Ns染色體特異性SCAR標(biāo)記和3個(gè)5Ns染色體特異性SCAR標(biāo)記。Du等也在278個(gè)SSR標(biāo)記的基礎(chǔ)上，開發(fā)了華山新麥草1Ns染色體特異性SCAR標(biāo)記。截止目前，尚未見(jiàn)2Ns、4Ns、6Ns和7Ns染色體特異性SCAR標(biāo)記的研究報(bào)道。

為獲得華山新麥草2Ns染色體的特異性SCAR標(biāo)記，本研究利用180個(gè)隨機(jī)引物R1～R180(10 bp)擬先篩選出華山新麥草2Ns染色體上的PAPD分子標(biāo)記，然后將其轉(zhuǎn)化為特異性SCAR標(biāo)記，并對(duì)SCAR標(biāo)記的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，以期準(zhǔn)確快速地篩選出小麥-華山新麥草雜交后代(特別是大批量衍生材料)中含有華山新麥草2Ns染色體的材料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

親本普通小麥7182(AABBDD，2=6=42)、華山新麥草(NsNs，2=2=14)以及一套完整的小麥-華山新麥草二體附加系(1Ns～7Ns，2=44=22II)共9份材料，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院陜西省植物遺傳工程育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供(表1)。

表1 試驗(yàn)中使用的材料

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取

采用CTAB法提取所有材料葉片的基因組DNA，使用ddHO稀釋至工作濃度。

1.2.2 RAPD分析

使用180個(gè)隨機(jī)引物(R1～R180)，以9個(gè)材料的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出華山新麥草特異RAPD標(biāo)記。PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括2 μL 10×PCR Buffer，1.6 μL dNTPs(2.5 μmol·mL)，2 μL引物(5 μmol·mL)，2.5 μL模板DNA(100 ng·μL)，0.2 μL Taq酶(5 U·μL)，11.7 μL ddHO。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，36.9 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，44個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min；12 ℃冷卻后4 ℃保存。擴(kuò)增完成后，加入5 μL Loading Buffer，使用8%的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，觀察并拍照保存。

1.2.3 擴(kuò)增產(chǎn)物的克隆和測(cè)序

使用OMEGA公司的聚丙烯酰胺凝膠回收試劑盒對(duì)僅在華山新麥草及其二體附加系中擴(kuò)增出的特異性條帶進(jìn)行回收，然后連接到pMD19-T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。采用菌落PCR藍(lán)白斑篩選法篩選陽(yáng)性克隆，送上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 測(cè)序結(jié)果的分析與SCAR引物的設(shè)計(jì)

使用Oligo 7.37進(jìn)行序列分析，并在NCBI網(wǎng)站使用BLASTn和BLASTx進(jìn)行序列同源性比對(duì)。根據(jù)RAPD產(chǎn)物的核苷酸序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)候選SCAR引物。SCAR引物的設(shè)計(jì)包括18～22個(gè)堿基和相應(yīng)RAPD片段框架內(nèi)的結(jié)合位點(diǎn)，由北京奧科生物技術(shù)有限公司合成。

1.2.5 SCAR標(biāo)記的檢測(cè)與分析

以9個(gè)材料的基因組DNA為模板，對(duì)特異SCAR標(biāo)記進(jìn)行PCR檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系同 1.2.2，反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性50 s，65 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；12 ℃冷卻后4 ℃保存。擴(kuò)增完成后，使用1%的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)并分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 2Ns染色體特異RAPD標(biāo)記鑒定結(jié)果

用R1～R180這180個(gè)引物對(duì)9個(gè)供試材料進(jìn)行初步篩選，共發(fā)現(xiàn)有26個(gè)特異引物，其中21個(gè)為華山新麥草基因組特異性RAPD標(biāo)記，4個(gè)為華山新麥草其他染色體特異性標(biāo)記，僅有1個(gè)引物R131(GTGCAACGTA)為2Ns染色體特異性標(biāo)記。進(jìn)一步利用R131引物對(duì)9個(gè)供試材料進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果(圖1)發(fā)現(xiàn)，僅在華山新麥草及其2Ns二體附加系中擴(kuò)增出一條約1 000 bp的特異性條帶，而在其他6個(gè)二體附加系和普通小麥7182中均未擴(kuò)增出該條帶(圖1)。因此，R131可以作為華山新麥草2Ns染色體的特異性標(biāo)記。

1：1Ns二體附加系；2：2Ns二體附加系3：3Ns二體附加系；4：4Ns二體附加系；5：5Ns二體附加系；6：6Ns二體附加系；7：7Ns二體附加系；8：普通小麥7182；9：華山新麥草；M：DNA marker。箭頭所示為華山新麥草及其2Ns二體附加系上的特異擴(kuò)增產(chǎn)物。圖4同。

2.2 序列分析

回收R131引物擴(kuò)增出的華山新麥草2Ns染色體特異性條帶，連接到pMD19-T載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，菌落PCR發(fā)現(xiàn)，陽(yáng)性克隆可擴(kuò)增出一條約1 000 bp的條帶(圖2)，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序，得到全長(zhǎng)為1 126 bp的片段，命名為F，其序列如圖3所示。序列分析表明，F(xiàn)的GC含量為50.9%，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)內(nèi)部串聯(lián)重復(fù)序列、反向重復(fù)序列以及回文序列等特征。將該序列提交到NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為MF405182。序列比對(duì)分析未發(fā)現(xiàn)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中有與F相同的序列，而URGI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST搜索顯示F的239個(gè)核苷酸(核苷酸238到536)與3DL染色體參考序列的同源性為80%，表明F與公共數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列無(wú)顯著的同源性。

箭頭表示單克隆菌落PCR擴(kuò)增帶FR-131。

2.3 特異性SCAR標(biāo)記的設(shè)計(jì)與驗(yàn)證結(jié)果

根據(jù)F的克隆序列，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異SCAR標(biāo)記引物S131，長(zhǎng)度為561 bp。S131序列在圖3中用雙線表示，即S131-F：CAACCTGCCTAACTCTATGTCA和S131-R：CGACTTGGGGAGAAGGCTG。

雙下劃線部分表示SCAR標(biāo)記S131的上、下游引物。

利用S131對(duì)9個(gè)供試材料進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果(圖4)顯示，僅華山新麥草及其2Ns二體附加系可擴(kuò)增出561 bp的條帶，而在其他材料中均未擴(kuò)增出該條帶，表明該條帶是華山新麥草2Ns染色體所特有，即2Ns染色體特異條帶。此結(jié)果證明，RAPD標(biāo)記R131已成功轉(zhuǎn)化為特異SCAR標(biāo)記S131，可用于快速準(zhǔn)確地鑒定華山新麥草2Ns染色體。

圖4 SCAR引物R131在小麥-華山新麥草二體附加系及其親本中的擴(kuò)增結(jié)果

3 討 論

在小麥育種中，利用小麥野生近緣植物中的優(yōu)良基因可以提高小麥的產(chǎn)量、品質(zhì)以及抗逆性。然而，只有當(dāng)外源遺傳物質(zhì)較少時(shí)，連鎖阻力減小，減數(shù)分裂行為趨于規(guī)則，這些外源優(yōu)良基因才可以被小麥育種者利用，為了利用這些優(yōu)良基因，在進(jìn)一步產(chǎn)生易位系(特別是小片段易位系)之前，需要構(gòu)建對(duì)應(yīng)的附加系和代換系。因此，如何快速準(zhǔn)確地鑒定外源染色體(片段)是否已轉(zhuǎn)入普通小麥至關(guān)重要。

華山新麥草由于其具有良好的性狀被世界各地的育種家作為重要的供體廣泛利用。特別是2Ns染色體上含有可以增加小花數(shù)、穗粒數(shù)、分蘗數(shù)和穗長(zhǎng)的基因，為提高小麥產(chǎn)量提供了新的遺傳資源。另外，小麥-華山新麥草2Ns二體附加系和2Ns/2D二體代換系對(duì)條銹病具有較強(qiáng)的抗性，因此，華山新麥草2Ns染色體的抗條銹病基因可以改善小麥對(duì)條銹病的抗性，進(jìn)一步提高小麥的產(chǎn)量潛力。鑒于小麥-華山新麥草2Ns二體附加系的優(yōu)良性狀，準(zhǔn)確有效地將含有2Ns染色體的材料與大量的小麥-華山新麥草雜交后代區(qū)分開來(lái)具有重要的意義。雖然目前已經(jīng)開發(fā)了RAPD、EST-SSR、EST-STS等標(biāo)記，可用來(lái)篩選小麥-華山新麥草2Ns二體異附加系和異代換系，但與SCAR標(biāo)記相比，它們操作復(fù)雜，成本更高。而SCAR標(biāo)記只需要對(duì)每個(gè)植物樣本進(jìn)行一次反應(yīng)，且具有更高的重復(fù)性、穩(wěn)定性和特異性。研究證實(shí)，特異SCAR標(biāo)記可用于高效、快速地鑒定目標(biāo)物種中的外源染色體(片段)。

本研究用180個(gè)隨機(jī)引物對(duì)一整套小麥-華山新麥草二體附加系及其親本進(jìn)行了篩選。在這些引物中，共篩選到21個(gè)華山新麥草基因組特異RAPD標(biāo)記和5個(gè)華山新麥草染色體特異標(biāo)記，華山新麥草染色體特異標(biāo)記的篩查率明顯低于其基因組特異標(biāo)記。以前的研究已經(jīng)證實(shí)了這一觀點(diǎn)。由于RAPD標(biāo)記的設(shè)計(jì)不依賴于華山新麥草的基因組序列，并且普通小麥與華山新麥草基因組序列之間幾乎沒(méi)有同源性，那么華山新麥草染色體特異性標(biāo)記的篩選效率低于其基因組特異性標(biāo)記可能是由于華山新麥草同源類群之間基因組序列的同源性相對(duì)較高。本研究只有1個(gè)RAPD引物成功轉(zhuǎn)化為穩(wěn)定的SCAR標(biāo)記，表明從RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR標(biāo)記的效率較低，這與蘇佳妮等的觀點(diǎn)一致。在本研究中，RAPD標(biāo)記的退火溫度由前人研究的32.0～34.0 ℃被優(yōu)化為36.9 ℃，可以消除非特異性條帶。因此，本研究開發(fā)的華山新麥草2Ns染色體SCAR標(biāo)記的特異性更高，更穩(wěn)定，根據(jù)特定條帶的存在與否，對(duì)結(jié)果更容易觀察判斷，有利于大量樣品的快速分析。華山新麥草染色體特異性SCAR標(biāo)記如1Ns、3Ns和5Ns染色體特異性SCAR標(biāo)記已有報(bào)道。未來(lái)的研究中，可進(jìn)一步開發(fā)華山新麥草其他染色體上的SCAR標(biāo)記，為華山新麥草在小麥育種中的高效利用奠定基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用RAPD技術(shù)開發(fā)了一個(gè)特異性SCAR標(biāo)記S131，可用于快速、準(zhǔn)確地篩選含有2Ns染色體的小麥-華山新麥草雜交后代，為利用2Ns染色體上的優(yōu)良基因奠定基礎(chǔ)。RAPD和SCAR的結(jié)合為追蹤華山新麥草及其他物種的染色體(片段)提供一種簡(jiǎn)單、可靠的方法。