蔣 威，相艷麗，岳學亮，杜亞博，關(guān)景林

（1.新鄉(xiāng)鑫瑞博生物工程有限公司，河南 新鄉(xiāng) 453800；2.辛集市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 辛集 052300；3.河南省獲嘉縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河南 新鄉(xiāng) 453800；4.河北省昌黎縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 昌黎 066600）

非洲豬瘟是一種急性、高熱、高度接觸性傳染病，由于其具有發(fā)病率高、病程短、死亡率高等特點，給發(fā)病地區(qū)的養(yǎng)豬業(yè)造成沉重的打擊。同時，由于傳統(tǒng)滅活疫苗生產(chǎn)工藝制備的非洲豬瘟滅活疫苗無法起到保護作用；弱毒疫苗存在散毒風險；亞單位疫苗和DNA疫苗免疫原性較差等原因難以投入到實際生產(chǎn)應(yīng)用，導(dǎo)致對該病預(yù)防和治療的難度極大。

中藥對生豬有一定的保護作用，主要是中藥能夠促進生豬非特異類型的免疫功能。此非特異性免疫力的作用比疫苗更廣泛，同時也能夠進一步提升豬群的疾病感染閾值。所以，對生豬的非特異性免疫功能和非洲豬瘟間的相關(guān)性、評估防控參數(shù)需加強探究。

豬群免疫系統(tǒng)的非特異性免疫力由三道免疫防線組成，第一道免疫防線為黏膜屏障保護，主要包括體表皮膚和體內(nèi)黏膜，中藥對黏膜屏障的保護是通過特異性分泌型免疫球蛋白SIgA、以及機械和化學屏障對豬進行保護。

在豬群非特異類型免疫功能的防線中，第2道防線涉及免疫器官(淋巴結(jié)、脾臟、胸腺、扁桃體等)、相關(guān)免疫細胞(T淋巴細胞、B淋巴細胞、單核細胞、巨噬細胞、自然殺傷細胞等)，是豬群對外界病原體刺激產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要部位。機體的非特異性免疫力主要是通過免疫器官和免疫細胞來衡量，因此評價中藥對第二道免疫防線是否增強主要通過免疫器官和免疫細胞的活性變化進行評價。

動物非特異性免疫力的第三道防線主要通過分泌Ⅰ型干擾素、白細胞介素（IL）、其他細胞因子等來實現(xiàn)。非洲豬瘟病毒入侵第一道和第二道防線后，會抑制豬干擾素、白細胞介素等的分泌，所以，生豬受到非洲豬瘟病毒感染之前，體內(nèi)可以形成較多白細胞介素與干擾素，可以改善生豬保護功能，降低豬群發(fā)病風險。基于非特異性免疫力與非洲豬瘟防控關(guān)系，本文通過對免疫器官（胸腺和脾脹指數(shù)）和細胞因子（IL-2、IL-4活性）進行實驗和數(shù)據(jù)分析，驗證了中藥在非特異性免疫方面的作用，為非洲豬瘟的防控提供基礎(chǔ)。

1 實驗材料

1.1實驗動物18~22g雌性昆明小鼠100只；

1.2實驗中藥復(fù)方中藥“穩(wěn)健”的主要成分：蚤休、人工牛黃、人參、黃芪、當歸、白術(shù)、蒼術(shù)、白芍、三七、紅景天、刺五加、金銀花等。

1.3試劑環(huán)磷酰胺、轉(zhuǎn)移因子（杭州）、轉(zhuǎn)移因子（洛陽）、小鼠白細胞介素-4 ELISA試劑盒（索萊寶）、小鼠白細胞介素-2 ELISA試劑盒（索萊寶）等。

2 實驗方法

2.1分組和給藥方式將100只小鼠隨機分為7組，空白組、模型組（環(huán)磷酰胺）、陽性對照A組（轉(zhuǎn)移因子-杭州）、陽性對照B組（轉(zhuǎn)移因子-洛陽）、“穩(wěn)健”低、中、高劑量組；每組5只。適應(yīng)性喂養(yǎng)5d，飼養(yǎng)室溫度21～26℃，濕度45%～55%，光/暗交替12h，可自由飲水和攝食。

對小鼠實施維持用藥15d，2次/d，低劑量、中劑量、高劑量的“穩(wěn)健”組中，依次予以每日劑量是5g/kg、15g/kg、30g/kg，陽性對照組給轉(zhuǎn)移因子（杭、洛）0.01mg/g，正常對照組以及模型對照組小鼠予以相同劑量的蒸餾水，除了正常對照組之外，其他各個組別在用藥第7~15d，給小鼠腹腔注入藥物，用藥是環(huán)磷酰胺，劑量是60mg/kg.d，構(gòu)建免疫抑制小鼠模型，1次/d，而對照組小鼠而予以相同用量的生理鹽水，給予形式也是腹腔注入，具體方案見表1。實施實驗之后，小鼠體重測定1次/d，了解其體重改變、進食狀況、活動情況等。

表1 實驗動物用藥實驗方案

在第16日，將小鼠眼球給予摘掉，采集血液，采取2000g實施離心干預(yù)，維持時長是15 min，對血清樣品給予處置，放在-20℃下存儲，對血清內(nèi)所含細胞因子（具體涉及IL-2因子、IL-4因子）實施測定。對小鼠頸椎實施脫臼后整死，對小鼠實施解剖操作，將脾臟以及胸腺拿出，測定濕重數(shù)據(jù)，分析脾臟指數(shù)結(jié)果以及胸腺指數(shù)結(jié)果。

2.2脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)的測定試驗小鼠采血后頸椎脫臼處死，并迅速解剖，取脾臟和胸腺稱量濕重，以小鼠臟器重量（mg）/體重（g）來計算脾臟、胸腺的臟器指數(shù)。小鼠體重、胸腺和脾臟重量，根據(jù)公式，計算胸腺和脾臟指數(shù)。

2.3IL-2、IL-4因子的檢測IL-2、IL-4因子的檢測按照小鼠白細胞介素-4 ELISA試劑盒、小鼠白細胞介素-2 ELISA試劑盒說明書操作進行。

3 實驗結(jié)果

3.1癥狀表現(xiàn)實施實驗的過程中，注入環(huán)磷酰胺之后，模型組及對照組中的小鼠經(jīng)由對比，模型組進食量得以降低，活動量降低，存在弓背表現(xiàn)，其體重降低，予以用藥時，其抵抗行為減弱，轉(zhuǎn)移因子陽性對照組和“穩(wěn)健”給藥組在進食情況、活動狀況、體重大小、精神表現(xiàn)等均獲得改善。

3.2脾臟指數(shù)結(jié)果及胸腺指數(shù)結(jié)果模型組和對照組在脾臟指數(shù)結(jié)果、胸腺指數(shù)結(jié)果方面差距比較大，提示環(huán)磷酰胺造模得以成功，且對照組給予對比，給藥組以上兩項指數(shù)提示，復(fù)方中藥“穩(wěn)健”高劑量組、中劑量組獲得良好效果，差別較高；提示環(huán)磷酰胺可引發(fā)胸腺指數(shù)降低，和對照組給予比對，模型組胸腺指數(shù)結(jié)果降低；和模型組實施對比，“穩(wěn)健”低劑量組、中劑量組、高劑量組及轉(zhuǎn)移因子使小鼠脾臟指數(shù)有恢復(fù)效果，“穩(wěn)健”中劑量給藥組對小鼠效果較為明顯。結(jié)果見表2和圖1、2。

表2 “穩(wěn)健”對免疫抑制小鼠胸腺及脾臟指數(shù)的影響

圖1 不同組別小鼠具體胸腺指數(shù)結(jié)果（單位是mg/g，n=5）

圖2 雌性各組小鼠脾臟指數(shù)結(jié)果（mg/g，n=5）

3.3復(fù)方中藥“穩(wěn)健”對免疫抑制小鼠血清IL-2和IL-4影響為分析復(fù)方中藥“穩(wěn)健”對存在免疫抑制狀況的小鼠身體免疫能力形成的影響，測定其IL-2指標及IL-4指標。和對照組實施對比，模型組中的血清IL-2指標下降，提示模型組細胞免疫能力對減弱，IL-4指標也減少，提示模型組體液免疫功能也降低；和模型組給予評比，用量較少的復(fù)方中藥“穩(wěn)健”對IL-4存在加強效果，不過影響作用缺乏顯著性，中劑量組、高劑量組可提升IL-4含量，復(fù)方中藥“穩(wěn)健”低劑量組、中劑量組、高劑量組均能顯著增加血清細胞因子IL-2分泌水平，說明復(fù)方中藥“穩(wěn)健”均能增強細胞因子IL-2和IL-4 的分泌,相對來講復(fù)方中藥“穩(wěn)健”增強見IL-2分泌水平更強（見表3、圖3和圖4）。

表3 復(fù)方中藥“穩(wěn)健”對免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4含量的影響

圖3 環(huán)磷酰胺致雌性小鼠免疫力低下模型血清中IL-2的含量

圖4 環(huán)磷酰胺致雌性小鼠免疫力低下模型血清中IL-4的含量

4 結(jié)論

本研究通過對小鼠腹腔注射環(huán)磷酰胺造模型，并給予復(fù)方中藥“穩(wěn)健”用藥，觀察小鼠非特異性免疫指標。復(fù)方中藥“穩(wěn)健”可促進存在免疫抑制狀況的小鼠體重大小、脾臟指數(shù)結(jié)果和胸腺指數(shù)指標得到提升，通過也能夠促進細胞因子IL-2和IL-4的表達，進而改善機體的免疫功能。證明了復(fù)方中藥“穩(wěn)健”在改善小鼠等動物的免疫功能低下癥狀，提高機體非特異性免疫力方面具有一定的功效。

5 小結(jié)

中藥能夠提升動物身體非特異性免疫功能，也存在可量化特征，中藥經(jīng)由加強動物免疫系統(tǒng)功能實現(xiàn)非特異性免疫能力提高。中藥主要是通過調(diào)節(jié)免疫體系關(guān)鍵活性物質(zhì)，進而對免疫功能給予改善，能夠依據(jù)免疫體系項目改變給予評估結(jié)果情況。參考中藥存在的優(yōu)越性，采取中藥能夠?qū)Ψ侵挢i瘟實施積極預(yù)防及控制。

中國的中醫(yī)藥歷史悠久，中藥相關(guān)理論較深，對傳染病的防治應(yīng)用實踐經(jīng)驗較多。由于非洲豬瘟疫苗的開發(fā)難度較大，在非洲豬瘟疫苗未研制成功之前，在做好外部生物安全的同時，要充分利用我國優(yōu)勢的中藥資源，通過提高動物的非特異性免疫力對動物進行保護存在重要性，對非洲豬瘟的預(yù)防及控制存在有效性。