王兆祥，田曉麗，齊振華，桂連友，王福蓮，張國輝

(1.長江大學 農(nóng)學院，昆蟲研究所，湖北荊州 434025；2.長江大學 生命科學學院，湖北荊州 434025；3.青島郵局海關，山東青島 266000)

嗅覺是大多數(shù)動物接收外界信息的一種重要感覺方式。它們利用嗅覺識別環(huán)境中的信息化合物，以此來調(diào)控它們的行為，如尋找食物源、定位配偶以及躲避天敵等。動物嗅覺機制研究的重大突破得益于1991年Buck和Axel[1]首次發(fā)現(xiàn)了哺乳動物氣味受體基因(odorant receptor,OR)。哺乳動物的氣味受體蛋白屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體家族，該家族的典型特征是具有7個跨膜區(qū)，氨基端位于膜外，羧基端位于膜內(nèi)。這類氣味受體蛋白著生于哺乳動物鼻腔嗅覺上皮組織嗅覺神經(jīng)元樹突膜上。一旦與氣味分子結合，氣味受體蛋白就利用G蛋白/cAMP信號通路把這種化學刺激信號轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)沖動信號進而調(diào)控動物相應的行為[2-4]。昆蟲氣味受體蛋白的發(fā)現(xiàn)遠滯后于哺乳動物，昆蟲中第1個氣味受體蛋白是1999年才在黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)中發(fā)現(xiàn)的[5-7]。昆蟲氣味受體蛋白著生于昆蟲觸角和下顎須表面嗅覺感器內(nèi)的嗅覺神經(jīng)樹突膜上[8-9]。雖然昆蟲氣味受體蛋白的跨膜結構與哺乳動物非常相似，但兩者也具有明顯不同[10-11]。第一，在細胞膜上的方向不同：昆蟲氣味受體蛋白的氨基端位于胞內(nèi)，羧基端位于胞外，而哺乳動物氣味受體蛋白的氨基端位于胞外，羧基端位于胞內(nèi)。第二，昆蟲氣味受體蛋白是以異源二聚體形式作為一個功能單位，其中包括1個在進化上高度分化的氣味受體蛋白ORx(用于識別特異性氣味物質(zhì))和1個進化上高度保守的氣味受體蛋白(odorant receptor co-receptor,Orco)，并且Orco只存在于昆蟲中[12-13]。Orco本身并不直接與氣味配體結合，也不具有氣味識別的功能，但它可以與ORx構成陽離子通道，并能引導氣味分子和ORx結合，促使信號傳導形成[10,12]。研究表明，每種昆蟲只有一種Orco,在不同昆蟲種間高度保守，尤其是在氨基酸序列的羧基端[14-19]。近年來，大量的相關研究表明，對Orco的表達進行干擾將會導致昆蟲嗅覺功能顯著受損[20-24]。因此，對Orco進行有效干擾或破壞，將會嚴重影響昆蟲對氣味分子的感知，進而干擾到昆蟲的取食、交配和產(chǎn)卵等重要的生命活動，這暗示Orco可以作為害蟲防治的一個潛在靶標[17]。

柑橘大實蠅(Bactroceraminax)屬雙翅目，實蠅科，果實蠅屬，大實蠅亞屬[25]，其幼蟲俗稱“柑蛆”，是一種危害柑橘類果實的主要害蟲[26]。該蟲在中國、尼泊爾、不丹和印度的柑橘生產(chǎn)區(qū)廣泛分布[25,27-28]，主要以幼蟲在果實內(nèi)取食進行為害，對柑橘果實的產(chǎn)量和品質(zhì)造成重大影響[29]。由于柑橘大實蠅幼蟲鉆蛀危害，不易防治，因此人們將防控重點放在柑橘大實蠅成蟲的防控上。眾所周知，利用嗅覺來誘捕害蟲是一個高效、環(huán)保的防治策略。因此，研究柑橘大實蠅的關鍵嗅覺基因不僅可以加深對柑橘大實蠅嗅覺的認知，同時也為研制高效引誘劑或驅(qū)避劑提供重要的理論依據(jù)。

本研究基于長江大學昆蟲生理生化課題組已獲得的柑橘大實蠅成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，采用RT-PCR技術克隆柑橘大實蠅Orco基因，并對其進行生物信息學分析，同時，通過實時熒光定量PCR技術檢測該基因在雌雄成蟲不同組織的表達特征，以期為柑橘大實蠅后續(xù)的嗅覺分子機制研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

昆蟲樣本：柑橘大實蠅取自長江大學農(nóng)學院昆蟲化學生態(tài)實驗室的室內(nèi)飼養(yǎng)種群[30]。分別收取1～3日齡雌雄成蟲的觸角、頭(不含觸角)、胸、腹、足、翅等組織，將收取的組織樣本存放于 -80 ℃冰箱，備用。

試劑及儀器：MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、PremixTaqTM(LATaqTMVersion 2.0)、DL2000 DNA Marker、TB GreenTMPremixExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0均購自寶生物工程(大連)有限公司；普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司；pGEM-T easy vector，Promega；F-DH5α感受態(tài)細胞，唯地生物。Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)，T100TMPCR儀，Bio-Rad CFX connect Real-Time System,美國Bio-Rad公司。

1.2 方 法

1.2.1 總RNA提取 柑橘大實蠅各組織總RNA使用MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提??；第一鏈cDNA用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成。-20 ℃保存，備用。

1.2.2 柑橘大實蠅Orco基因的克隆鑒定 從柑橘大實蠅成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中獲得Orco基因序列，通過NCBI網(wǎng)站BLAST序列比對鑒定，使用Primer 5軟件設計基因全長驗證引物(表1，酶切位點用下劃線標示)克隆柑橘大實蠅Orco基因。以觸角組織的cDNA為模板進行PCR擴增。PCR反應體系( 25 μL)：cDNA模板 2 μL、PremixTaq(LATaqVersion 2.0)12.5 μL、上下游引物各 1 μL(10 μmol/L)、ddH2O 8.5 μL。反應條件:95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，58 ℃ 30 s， 72 ℃ 100 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。將PCR產(chǎn)物用10 g/L 的瓊脂糖凝膠電泳檢測正確后，使用普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收目的片段。將回收的目的片段連接到pGEM-T easy vector,再轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中并進行培養(yǎng)，挑取單克隆進行菌液PCR檢測。菌液PCR檢測后，使用TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver.4.0提取檢測正確的質(zhì)粒DNA送樣測序。序列測定及引物合成均由北京六合華大基因科技有限公司完成。

1.2.3 柑橘大實蠅Orco基因的生物信息學分析 柑橘大實蠅Orco核苷酸序列利用ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)查找開放閱讀框，通過DNAMAN 7.0軟件推導氨基酸序列；利用Expasy的ProtParam(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；信號肽采用SignalP5.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/)服務器進行預測，同時運用TMHMM Server v.2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對其跨膜域進行預測；利用NCBI獲取已知昆蟲Orco氨基酸序列，其氨基酸序列的多重比對由DNAMAN 7.0軟件完成；選取鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和直翅目共45種昆蟲Orco氨基酸序列，運用MEGA 5.1軟件中鄰接法(NJ樹)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，設置Bootstrap為1 000，并使用iTOL(https://itol.embl.de/)編輯進化樹。

1.2.4 柑橘大實蠅Orco基因的組織表達分析 利用 Primer 5.0軟件設計實時熒光定量PCR中使用的特異性引物(表1)，內(nèi)參基因選用GAPDH。采用實時熒光定量PCR試劑TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)和Bio-Rad CFX connect Real-Time System檢測Orco的組織表達水平。實時熒光定量PCR體系為25 μL：cDNA 模板 2 μL、上下游引物各1 μL(10 μmol/L)、ddH2O 8.5 μL、TB GreenTMPremix ExTaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)12.5 μL。反應條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，39個循環(huán)。設置2次生物學重復，每個生物學重復進行3次技術重復。用溶解曲線分析擴增產(chǎn)物，采用2-ΔΔCt法[31]對柑橘大實蠅Orco基因的相對表達量進行分析。

表1 引物信息

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。不同組織間的差異采用單因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan’s檢驗分析，顯著性水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 柑橘大實蠅Orco基因克隆與序列分析

柑橘大實蠅Orco開放閱讀框全長1 431 bp，編碼476個氨基酸(圖1)，等電點為8.69，分子質(zhì)量53.41 ku,不穩(wěn)定指數(shù)為29.00，親水性總平均值(GRAVY)為0.296，是穩(wěn)定的疏水性蛋白，帶負電荷的殘基(Asp+Glu)總數(shù)為31，帶正電荷的殘基(Arg+Lys)總數(shù)為37。序列分析表明該基因編碼的蛋白中無信號肽；跨膜結構分析表明，推導出的柑橘大實蠅Orco氨基酸序列含有7個跨膜結構域(7-TM)，分別為 TM-1= 40～62 aa、TM-2= 72～90 aa、TM-3= 131～153 aa、TM-4=185～207 aa、TM-5= 337～359 aa、TM-6= 374～396 aa、TM-7= 450～472 aa，并且氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外(圖1，圖2)。

終止密碼子用星號顯示；下劃線標出跨膜結構域1-7(TM1-7)

跨膜結構域是紅色的，里面是藍色，外面是紫色

2.2 柑橘大實蠅Orco的系統(tǒng)進化分析

氨基酸序列比對結果(圖3)表明，柑橘大實蠅Orco氨基酸序列與鞘翅目、雙翅目、鱗翅目、半翅目、膜翅目和直翅目昆蟲氨基酸序列有較高的相似性(68.19%、86.42%、65.15%、56.43%、63.84%和59.92%)，尤其是和雙翅目昆蟲的氨基酸序列一致性最高，而且在羧基端高度保守?；诓煌坷ハxOrco的氨基酸同源序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)，發(fā)現(xiàn)同一目昆蟲的Orco均聚為一支，符合進化關系。柑橘大實蠅Orco位于雙翅目分支上，與桔小實蠅Bactroceradorsalis的BdorOrco和地中海實蠅Ceratitiscapitata的CcapOrco聚在一起，可知柑橘大實蠅與同為果實蠅屬的桔小實蠅遺傳距離較近，其次是地中海實蠅，與半翅目昆蟲的遺傳距離最遠。

BminOrco.柑橘大實蠅Orco；TcasOrco.赤擬谷盜Orco(XP_008194693.1，鞘翅目)；DmelOrco.黑腹果蠅Orco(NP_001097687.1，雙翅目)；McinOrco.腰帶長體繭蜂Orco(AGI62937.2，膜翅目)；HarmOrco.棉鈴蟲Orco(ADQ13177.1，鱗翅目)；LmigOrco.東亞飛蝗Orco(ALD51504.1，直翅目)；LhesOrco.西部牧草盲蝽Orco(AFX73447.1，半翅目)。序列一致性.黑色=100%，綠色≥75%，紫色≥50%?？缒そY構域1～7 (TM 1～7)用線表示

紫色.鞘翅目；黃色.雙翅目；黑色.鱗翅目；綠色.半翅目；粉色.膜翅目；藍色.直翅目；ApisOrco.豌豆蚜(XP_001951646.2)；YsigOrco.錘脅蹺蝽(AVO63533.1)；ClecOrco.溫帶臭蟲(NP_001303637.1)；LhesOrco.西部牧草盲蝽(AFX73447.1)；AlucOrco.綠盲蝽(AHC72290.1)；OasiOrco.亞洲小車蝗(QAB43939.1)；LmigOrco.東亞飛蝗(ALD51504.1)；SgreOrco.沙漠蝗(AEX28371.1)；NvitOrco.麗蠅蛹集金小蜂(NP_001164465.1)；McinOrco.腰帶長體繭蜂(AGI62937.2)；MmedOrco.中紅側(cè)溝繭蜂(ABM05966.1)；CcinOrco.北美麥莖蜂(NP_001310774.1)；AmelOrco.西方蜜蜂(NP_001128415.1)；MsexOrco.煙草天蛾(XP_030036707.1)；BmorOrco.家蠶(NP_001037060.1)；LbotOrco.葡萄花翅小卷蛾(AXF48755.1)；PoctOrco.綠頭卷葉蛾(AJF23826.1)；EposOrco.蘋淡褐卷蛾(ACJ12928.2)；AsegOrco.黃地老虎(AGS41440.1)；SlitOrco.?；页嵋苟?ABQ82137.1)；HvirOrco.煙芽夜蛾(PCG73648.1)；HarmOrco.棉鈴蟲(ADQ13177.1)；HzeaOrco.美洲棉鈴蟲(AAX14773.1)；PstrOrco.黃曲條跳甲(ACD40044.1)；AcorOrco.銅綠麗金龜(AKC58535.1)；HoblOrco.華北大黑鰓金龜(AEE69033.1)；HparOrco.暗黑鰓金龜(AEG88961.1)；OcomOrco.廣聚螢葉甲(QEE83332.1)；AglaOrco.光肩星天牛(XP_018568191.1)；CbowOrco.大猿葉蟲(ALR72547.1)；AquaOrco.榆紫葉甲(AJF94638.2)；DponOrco.中歐山松大小蠹(XP_019768125.1)；TcasOrco.赤擬谷盜(XP_008194693.1)；TmolOrco.黃粉蟲(AJO62219.1)；AgamOcro.岡比亞按蚊(XP_312379.3)；AaegOrco.埃及伊蚊(NP_001345400.1)；CquiOrco.致倦庫蚊(ABB29301.1)；CcapOrco.地中海實蠅(NP_001266301.1)；BdorOrco：桔小實蠅 (ACC86853.1)；MdomOrco.家蠅(AFH96944.1)；DbusOrco.醋果蠅(XP_017848171.1)；DpseOrco.擬暗果蠅(XP_001359364.3)；DsuzOrco.斑翅果蠅(SAL89172.1)；DmelOrco.黑腹果蠅(NP_001097687.1)；BminOrco.柑橘大實蠅

2.3 柑橘大實蠅Orco的組織表達模式

柑橘大實蠅Orco的組織表達譜(圖5)顯示，柑橘大實蠅Orco基因在成蟲觸角中的相對表達量顯著高于其他組織，并且在雌成蟲觸角中的表達量顯著高于雄成蟲；在頭部(不含觸角)、胸、腹、足和翅中微量表達。

不同字母表示不同組織間差異顯著(P<0.05，Duncan’s test),小寫字母表示雌成蟲，大寫字母表示雄成蟲

3 討 論

本研究鑒定分析柑橘大實蠅非典型性氣味受體基因BminOrco。昆蟲Orco氨基酸序列羧基端的4個保守基序(conserved motifs)RSAIKYWVERHKHVVR, IFGNRL, WYDGSEEAK 和 FASVLGATVTYFMVLVQLK被認為是昆蟲Orco家族的典型特征[22,32]。柑橘大實蠅BminOrco序列的羧基端也發(fā)現(xiàn)了這些保守基序(RSAIKYWVERHKHVVR (residues 325-340), IFGNRL (residues 400～405), WYDGSEEAK (residues 421～429)and FASVLGAVVTYFMVLVQLK (residues 458～476)，但BminOrco序列第4個基序的第8位氨基酸突變?yōu)槔i氨酸(V)。前人的研究表明，昆蟲氣味受體蛋白的氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外[10,33]。BminOrco跨膜結構的分析結果顯示，BminOrco的氨基端位于膜內(nèi)，羧基端位于膜外(圖2)。這一結果同已被試驗證實的果蠅D.melanogaster和榕小蜂ApocryptabakeriOrco 的膜拓撲學(membrane topology)是一致的[11,34]。以上結果進一步說明昆蟲氣味受體蛋白不同于哺乳動物氣味受體蛋白。

系統(tǒng)樹分析顯示，6個目昆蟲的Orco被分成6個不同的組(圖4)，來自相同目的昆蟲總是聚在一起，說明昆蟲Orco基因可能來自1個共同祖先，隨后由于不同的選擇壓力產(chǎn)生了相應分化。然而，Orco在不同目昆蟲間好像又可以實現(xiàn)功能同源，因為來自谷實夜蛾Helicoverpazea、地中海實蠅Ceratitiscapitata和岡比亞按蚊Anophelesgambiae的Orco在Orco(Or83b)缺陷的果蠅突變體中轉(zhuǎn)基因表達后，該果蠅可以恢復對乙酸乙酯等氣味的嗅覺反應[35]。昆蟲Orco要實現(xiàn)在不同昆蟲中的功能同源性，就必須保證其氨基酸序列的關鍵氨基酸或者結構域在不同昆蟲種類中保持高度保守。序列多重比較的結果顯示，昆蟲Orco序列在羧基端高度保守，這暗示這段高度保守區(qū)域可能是Orco在不同昆蟲中行使相同功能的保證。其中位于第6跨膜區(qū)和第7跨膜區(qū)之間的環(huán)被認為是Orco與ORx互作過程中不可或缺的區(qū)域[10]。位于第7跨膜區(qū)的酪氨酸(Y)(在家蠶BombyxmoriOrco位于464位Y464，在果蠅D.melanogasterOrco位于第478位Y478)被認為在ORx/Orco 復合體形成陽離子通道的過程中起了重要作用[36]。在柑橘大實蠅Orco中它位于第468位(Y468)。

組織表達模式的結果顯示，BminOrco主要在柑橘大實蠅雌雄成蟲觸角中高度表達，這與許多昆蟲Orco在組織中的表達分布情況相符合，推測是因為觸角作為昆蟲的主要嗅覺器官，其上分布著大量嗅覺感受器，在接收外界信息的過程中起著關鍵作用[14-19,37]。柑橘大實蠅BminOrco在頭(不含觸角)、胸、腹、足、翅等組織中僅微量表達，這種現(xiàn)象在其他昆蟲中也有類似情況[15-19]。另外，昆蟲Orco的表達還會受昆蟲性別和發(fā)育時期的影響，如張帥等[14]對中紅側(cè)溝繭蜂Orco在成蟲羽化不同時期的表達量進行研究時發(fā)現(xiàn)，雌雄成蟲觸角之間的表達量在羽化的不同時期差異比較大，而董鈞鋒等[16]對棉鈴蟲齒唇姬蜂Orco的研究中發(fā)現(xiàn)，該基因在雄蜂觸角中的表達量是在雌蜂觸角中表達量的8.0倍。本研究發(fā)現(xiàn)，BminOrco在雌成蟲觸角中的表達量高于雄成蟲觸角中的表達量，且二者之間差異顯著。這是否意味著柑橘大實蠅雌成蟲具有更多的嗅覺行為表現(xiàn)，需要進一步研究。

本研究從柑橘大實蠅成蟲轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定、克隆得到BminOrco基因，并對其進行生物信息學分析，通過實時熒光定量PCR明確該基因的組織表達譜，研究結果為進一步研究柑橘大實蠅Orco的結構和功能奠定一定的基礎。