李 博 李 箐 郭亞娟 潘 碩 呂培軍 王 勇

近年來3D 打印技術(shù)因其個(gè)性化的優(yōu)點(diǎn)，在構(gòu)建骨組織缺損修復(fù)支架方面逐漸得到關(guān)注，其中高分子量的聚己內(nèi)酯因其具有良好的生物相容性，并且容易打印成形，作為牙槽骨、頜骨缺損修復(fù)的3D 打印支架得到廣泛應(yīng)用[1,2]。但是細(xì)胞在生長過程中與支架表面貼附，難以模擬體內(nèi)生長的三維微環(huán)境，并且受支架孔隙大小影響，種子細(xì)胞在支架表面及內(nèi)部分布不均勻[3]。

生物3D 打印技術(shù)可以將細(xì)胞與水凝膠混合，制備“生物墨水”，構(gòu)建細(xì)胞生長的三維微環(huán)境，并且利用患者缺損區(qū)域的醫(yī)學(xué)影像進(jìn)行模型構(gòu)建，可以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的均勻分布、支架外形的個(gè)性化設(shè)計(jì)，為骨組織缺損修復(fù)提供了新的解決思路。生物3D 打印基質(zhì)材料(明膠、海藻酸鈉、膠原、殼聚糖等[4,5,6])已經(jīng)得到成功應(yīng)用，然而低濃度海藻酸鹽/明膠在提高細(xì)胞存活的同時(shí)會(huì)導(dǎo)致支架機(jī)械強(qiáng)度不足，容易解體和破壞。高濃度水凝膠可以改善支架強(qiáng)度，但會(huì)抑制細(xì)胞存活。因此，設(shè)計(jì)更好機(jī)械強(qiáng)度、保持細(xì)胞存活及功能的支架仍然是生物3D 打印的重要挑戰(zhàn)。

為了提高骨組織工程支架強(qiáng)度，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞在支架內(nèi)的三維分布，本研究嘗試對細(xì)胞共混的生物3D 打印支架進(jìn)行初步改良，以聚己內(nèi)酯作為外周支架結(jié)構(gòu)，hASCs 與海藻酸鈉/ 明膠水凝膠共混成生物墨水后雙噴頭共同打印，并將納米羥基磷灰石加入水凝膠中，研究其對三維支架中細(xì)胞增殖及體外成骨向分化的影響，為今后復(fù)合支架體內(nèi)實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

1.材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 3D Bioplotter 三維生物打印機(jī)(Envision，德國)；hASCs 細(xì)胞(Scien Cell，美國，批號11578)；明膠(sigma，美國)；海藻酸鈉(sigma)；50nm 羥基磷灰石(sigma)；無水CaCl2(sigma)；CCK-8 試劑盒(dojindo，日本)；鈣黃綠素-AM(dojindo)；碘化丙啶(dojindo)；DMEM 培養(yǎng)基(sigma-Aldrich，美國)；聚己內(nèi)酯(分子量48000～80000)(sigma-Aldrich)；抗壞血酸(sigma-Aldrich)；胎牛血清(Gibco，美國)；0.25%胰蛋白酶(Gibco)；Realtime PCR 試劑盒(KAPA Biosystems，美國)；Trizol RNA 提取試劑盒(Invitrogen，美國)；細(xì)胞培養(yǎng)皿(Coming，美國)；孔板(Coming)。

1.2 含hASCs 水凝膠與聚己內(nèi)酯支架的三維生物打印

1.2.1 hASCs 的培養(yǎng)和傳代 將P2 代的hASCs 加入5ml 增殖培養(yǎng)基(Proliferation Medium，PM)中，即低糖DMEM 溶液+10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清+1%(體積分?jǐn)?shù))青鏈霉素，在5%CO2，37℃的細(xì)胞培養(yǎng)孵箱內(nèi)培養(yǎng)，3d 換液一次。hASCs 達(dá)到80～90%匯合時(shí)可進(jìn)行傳代，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化、離心、重懸后，將細(xì)胞按照5×104個(gè)/ ml密度接種于10cm 培養(yǎng)皿中。如此反復(fù)傳代3 次后得到P5 代hASCs，作為種子細(xì)胞備用。

1.2.2 hASCs 生物墨水的制備 以生理鹽水為溶劑，海藻酸鈉∶明膠=2∶8(質(zhì)量比)配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的溶液，Co60 滅菌備用。取對數(shù)期生長的第5 代hASCs，胰蛋白酶消化后離心，加入增殖培養(yǎng)基，移液槍輕吹，配置細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)。按照1×106個(gè)/ ml 的細(xì)胞濃度，將細(xì)胞懸液與海藻酸鈉/ 明膠水凝膠混合，裝入1 號儲(chǔ)料管；將細(xì)胞懸液與海藻酸鈉/ 明膠水凝膠混合，再加入納米羥基磷灰石粉末，設(shè)置5 個(gè)質(zhì)量分?jǐn)?shù)梯度：0.5%、0.75%、1%、1.25%、1.5%，攪拌均勻，動(dòng)作盡量輕柔，裝入2 號儲(chǔ)料管。

1.2.3 聚己內(nèi)酯高溫熔融 將聚己內(nèi)酯晶體放入高溫打印頭3 號儲(chǔ)料管內(nèi)，升溫至80℃使聚己內(nèi)酯熔融，備用。

1.2.4 含hASCs 支架三維生物打印 使用2 號管生物墨水直接打印含hASCs 的三維結(jié)構(gòu)體，記為AG 組；將2 號管生物墨水與3 號管熔融PCL進(jìn)行雙噴頭打印，記為AGP 組。雙噴頭打印模型通過直接建模制作。打印環(huán)境溫度為15℃，打印噴頭直徑均為300μm，打印過程中設(shè)置打印速度范圍為5mm/ s～15mm/ s，打印壓力范圍為0.05～0.4MPa，水凝膠打印溫度梯度設(shè)置為20℃、22℃、24℃、26℃、28℃，最后根據(jù)水凝膠、熔融PCL細(xì)絲擠出是否均勻、連續(xù)，三維結(jié)構(gòu)體邊緣是否完整來確定適宜的打印參數(shù)。三維生物打印機(jī)根據(jù)導(dǎo)入的模型圖及打印參數(shù)擠出細(xì)絲，落入無菌培養(yǎng)皿中，逐層交錯(cuò)疊加成具有三維結(jié)構(gòu)的打印體。每組打印體完成后，均使用100mmol/ L CaCl2溶液交聯(lián)5min，吸凈CaCl2溶液，PBS 沖洗3 次，加入增殖培養(yǎng)基，37℃孵箱培養(yǎng)。

1.3 含hASCs 水凝膠與聚己內(nèi)酯三維支架的檢測

1.3.1 含hASCs 水凝膠與聚己內(nèi)酯三維支架的力學(xué)強(qiáng)度檢測 制備15mm×15mm×5mm 大小的AG 水凝膠支架、AGP 支架，每組打印體完成后，均使用100mmol/ L CaCl2溶液交聯(lián)5 分鐘，吸凈CaCl2溶液，PBS 沖洗3 次，將兩組支架材料放置在材料萬能試驗(yàn)機(jī)上進(jìn)行測試。每種材料測試3 個(gè)樣本，取平均值。

1.3.2 含hASCs 三維支架中細(xì)胞增殖情況檢測 將AG 組、AGP 組打印體置于增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在打印后1d、3d、5d、7d 分別置于24 孔板中對細(xì)胞進(jìn)行CCK-8 檢測。記錄450nm 各孔光密度值(Optical Density,OD)，繪制增殖曲線。

1.3.3 含hASCs 三維支架中細(xì)胞存活情況檢測 在打印1 天和7 天后，分別對AG 組、AGP組打印體中hASCs 的細(xì)胞存活率進(jìn)行檢測。三維打印體PBS 漂洗3 次，用含有5μmol/ L 鈣黃綠素-AM(CAM)和3μmol/ L 碘化丙啶(PI)的生理鹽水在37℃，5%二氧化碳的孵箱中孵育45min，PBS 漂洗3 次，用激光共聚焦顯微鏡分別在488nm(綠光，活細(xì)胞)和543nm(紅光,死細(xì)胞)的波長下觀察結(jié)構(gòu)體內(nèi)細(xì)胞活性，對活死細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)并計(jì)算各組三維生物打印體內(nèi)hASCs 的存活率：細(xì)胞存活率=活細(xì)胞總數(shù)/ (活細(xì)胞總數(shù)+死細(xì)胞總數(shù))×100%。

1.3.4 含hASCs 三維支架中細(xì)胞成骨分化檢測 使用1 號管中不含納米羥基磷灰石的生物墨水打印成三維結(jié)構(gòu)體，記為ag 組，作為空白對照。將ag 組、AG 組、AGP 組共三組結(jié)構(gòu)體打印兩個(gè)批次。三組結(jié)構(gòu)體打印后在基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，第一個(gè)批次在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，第二個(gè)批次轉(zhuǎn)入成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)(ostegenic medium，OM)，成分為高糖DMEM+10%FBS+10nmol/ L 地塞米松+0.2mmol/ L 抗壞血酸+10mmol/ L β-磷酸甘油+1%青鏈霉素。兩個(gè)批次細(xì)胞均3 天換液一次。細(xì)胞培養(yǎng)2 周后進(jìn)行RT-PCR 檢測，步驟按realtime PCR試劑盒說明書進(jìn)行，提取細(xì)胞總RNA，測試各組打印體細(xì)胞中成骨相關(guān)基因RUNX2、OCN、OSX 的表達(dá)，其中RUNX2、OCN、OSX 引物序列如表。

表1 real-time PCR引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)均采用采用SPSS 17.0軟件分析。在方差齊性的基礎(chǔ)上，應(yīng)用單因素方差分析對各組打印體內(nèi)細(xì)胞增殖、存活率，成骨相關(guān)基因的相對表達(dá)量進(jìn)行總體分析，檢測水準(zhǔn)為雙側(cè)α=0.05。

2.結(jié)果

2.1 復(fù)合支架打印結(jié)果 調(diào)試打印機(jī)壓力、速度、溫度等參數(shù)后，可打印出具有穩(wěn)定構(gòu)象的三維結(jié)構(gòu)體，打印參數(shù)如下：水凝膠打印速度8.0mm/ s，打印壓力0.25MPa；根據(jù)水凝膠擠出形態(tài)(圖1)，選擇打印溫度26℃，nHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%；熔融PCL打印速度6mm/ s，打印壓力0.12MPa。

圖1 不同打印溫度及nHA 質(zhì)量分?jǐn)?shù)時(shí)水凝膠形態(tài)

2.2 含hASCs 水凝膠與聚己內(nèi)酯三維支架的力學(xué)強(qiáng)度檢測 經(jīng)萬能材料試驗(yàn)機(jī)測試后，AG 組、AGP 組支架的彈性模量結(jié)果分別是1.27±0.17MPa、10.34±0.24MPa(圖2)。統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果顯示AGP 組三維支架與AG 組水凝膠支架在彈性模量的差別上有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。說明將PCL 作為水凝膠的外周支架，有利于提高支架的抗壓強(qiáng)度。

圖2 兩種支架彈性模量測試結(jié)果

2.3 含hASCs 三維支架中細(xì)胞增殖情況CCK-8 結(jié)果顯示AG 組、AGP 組在1d、3d、5d、7d 均呈現(xiàn)增殖趨勢(圖3)，且在7d 時(shí)兩組支架的OD 值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明熔融狀態(tài)的PCL 與水凝膠共同打印對hASCs 增殖活性無明顯影響。

圖3 打印后hASCs 增殖曲線

2.4 含hASCs 三維支架中細(xì)胞存活情況CAM/ PI 染色結(jié)果如圖4A,對打印后1 天和7 天各組細(xì)胞存活率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示：打印后1d 時(shí)AG 組、AGP 組細(xì)胞存活率(圖4B)分別為87.64%±0.21%、87.32%±0.45%，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，打印后7d 時(shí)分別為90.53%±0.32%、90.45%±0.29%，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；而AG 組、AGP 組的存活率在7d 時(shí)明顯高于1d(P＜0.05)。

圖4 CAM/ PI 染色及hASCs 存活率

2.5 含hASCs 三維支架中細(xì)胞成骨分化檢測體外培養(yǎng)14d 后，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，成骨誘導(dǎo)的ag 組、AG 組、AGP 組打印體內(nèi)hASCs 成骨相關(guān)基因RUNX2、OSX 和OCN 的表達(dá)高于增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)中的各組(P＜0.05)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的AG OM 組、AGP OM 組明顯高于ag OM，增殖培養(yǎng)基中的AG PM 組、AGP PM 組明顯高于ag PM，表明與hASCs 共混的納米羥基磷灰石可促進(jìn)成骨相關(guān)基因表達(dá)。

圖5 成骨基因表達(dá)的RT-PCR 檢測結(jié)果

3.討論

生物三維打印的骨組織支架除要求生物相容性外，還需要具有一定的力學(xué)強(qiáng)度，以填補(bǔ)骨缺損外形，為新骨形成留出生長空間[7]。在前期實(shí)驗(yàn)中，含hASCs 的海藻酸鈉/ 明膠水凝膠支架強(qiáng)度較低，進(jìn)行大尺寸或多層打印時(shí)容易發(fā)生塌陷。打印完成后通過CaCl2交聯(lián)形成海藻酸鈣，可在短時(shí)間后獲得穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)體，但在體外培養(yǎng)14 天時(shí)，部分海藻酸鈉/ 明膠結(jié)構(gòu)體出現(xiàn)了解體現(xiàn)象。高分子量的PCL 具有良好的生物相容性，同時(shí)因?yàn)榉肿又麈溨械腃-O 鍵和C-C 鍵可旋轉(zhuǎn)，具有一定的柔性，冷卻成形后不需要有機(jī)試劑洗滌等后處理[8]。因此本研究提出了將PCL 與含細(xì)胞的水凝膠協(xié)同打印的方法。在力學(xué)強(qiáng)度測試中，AGP 組三維支架的彈性模量明顯大于AG 組，說明雙組分支架在抗壓強(qiáng)度上較水凝膠支架有所提高，并且AGP 組彈性模量(10.34±0.24MPa)與松質(zhì)骨(4～12.5MPa)接近[9]，為應(yīng)用于骨缺損修復(fù)提供了可能。

CCK-8 檢測及CAM/ PI 染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)在本研究參數(shù)條件下熔融PCL 對hASCs 增殖與存活率無明顯影響，兩組支架的細(xì)胞存活率在第7 天時(shí)明顯高于第1 天(P＜0.05)，原因可能是擠出式印機(jī)噴頭對細(xì)胞擠壓，影響細(xì)胞活性。有研究報(bào)道，PCL在80℃熔融時(shí)打印，細(xì)絲在20℃環(huán)境溫度中與打印平臺(tái)接觸時(shí)的最高溫度為42.4℃[10]。本研究在15℃環(huán)境溫度及較慢的打印速度下，熔融PCL 落入培養(yǎng)皿中可以快速降溫，減少溫度變化對hASCs活性的影響。分子量48000～80000 的PCL 在60℃時(shí)可熔融[11]，考慮到升高溫度可提高熔融PCL 的流動(dòng)性，更容易擠出成絲，本研究選取80℃作為實(shí)驗(yàn)溫度。

羥基磷灰石作為天然骨骼的成分之一，具有良好的生物相容性，并且可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和遷移，在納米級狀態(tài)下可表現(xiàn)出新的性能[12]，將納米羥基磷灰石與有機(jī)材料混合是目前的主要研究方向，如：將納米羥基磷灰石與聚乳酸-羥基乙酸共聚物(PLGA)共混，可打印具有彈性的骨組織支架[13]；納米羥基磷灰石/ 膠原復(fù)合材料對骨髓單核細(xì)胞表現(xiàn)出良好的生物相容性[14]。以往報(bào)道已經(jīng)證實(shí)納米羥基磷灰石在水凝膠體系中對hASCs 的增殖無明顯影響[15]，但納米羥基磷灰石在熔融PCL與水凝膠體系中對hASCs 成骨分化影響鮮有報(bào)道。本研究PCR 結(jié)果表明，成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后各組基因表達(dá)均有所升高，增殖培養(yǎng)基中AG PM 組、AGP PM 組明顯高于ag PM 組，說明即使沒有成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基的輔助，將納米羥基磷灰石添加到水凝膠中，與熔融PCL 協(xié)同打印后的三維支架仍然可以促進(jìn)hASCs 成骨向分化。納米羥基磷灰石對成骨向分化的影響機(jī)制目前說法不一，有研究顯示納米羥基磷灰石可以促進(jìn)分化程度較低的細(xì)胞DNA 甲基化[16]，但將細(xì)胞與納米羥基磷灰石短時(shí)間共混，堿性磷酸酶相關(guān)基因(Alpl)表達(dá)會(huì)受到抑制，此作用對分化程度較高的細(xì)胞影響不明顯。這一機(jī)制可能能解釋AG 組、AGP 中成骨相關(guān)基因表達(dá)量較高的現(xiàn)象，細(xì)胞與納米羥基磷灰石共混，DNA 甲基化影響成骨細(xì)胞形成，分裂增殖后子細(xì)胞發(fā)生相同的改變。

綜上，本實(shí)驗(yàn)成功制備了熔融PCL 與水凝膠協(xié)同打印的支架結(jié)構(gòu)體，一方面提高了傳統(tǒng)水凝膠支架的力學(xué)強(qiáng)度，另一方面證實(shí)熔融PCL 對hASCs增殖活性不會(huì)造成明顯影響，納米羥基磷灰石加入水凝膠體系中可促進(jìn)hASCs 的成骨相關(guān)基因表達(dá)。今后本課題組還將對三維支架植入動(dòng)物體內(nèi)的情況進(jìn)一步研究，深入揭示復(fù)合支架在骨組織工程中的應(yīng)用價(jià)值。