王朝君，李 樂，張旭梅，葉 超，毛加寧※

（1.樂山師范學(xué)院 a.教育科學(xué)學(xué)院；b.生命科學(xué)學(xué)院，四川 樂山 614004；2.西安市雁塔區(qū)第二小學(xué)，陜西 西安 710000）

0 引言

水稻種植有著非常悠久的歷史，它是全世界播種面積僅次于小麥的第二大糧食作物。保證水稻的產(chǎn)量以及水稻品種的質(zhì)量對我國乃至全世界的糧食安全都具有極其巨大的意義。就目前而言，提高水稻產(chǎn)量和改良水稻品質(zhì)的主要手段有水稻雜交技術(shù)和化肥農(nóng)藥的施用。除此之外，探求更加科學(xué)的水稻增產(chǎn)方法顯得尤為重要。

與宿主植物和諧共生的一類微生物我們稱之為植物內(nèi)生菌[1]。伴隨著植物微生態(tài)學(xué)的深入研究,植物內(nèi)生菌在植物生長過程中的重要性逐漸顯現(xiàn)[2]。經(jīng)由大量實驗證實，植物種子的表面及內(nèi)部均有豐富的微生物群落[3]。內(nèi)生細(xì)菌對水稻具有固氮、抗病、促生等作用，我國率先在2006年采用內(nèi)生菌技術(shù)培育出了優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻，創(chuàng)新了通過微生物提高水稻增產(chǎn)的新方法和新研究領(lǐng)域。眾所周知，想要通過研磨方法分離植物內(nèi)生細(xì)菌，一定要消除表面微生物的影響[4]。目前常見的消毒方法較多，但是考慮到對水稻種子活性的影響，對水稻種子內(nèi)生菌分離的影響以及消毒試劑的可獲得性，仍趨向采用常見的消毒試劑對其進行表面消毒。然而，水稻內(nèi)生菌的分離研究才剛剛起步，當(dāng)前何種消毒方式既能高效滅菌又能減少對水稻內(nèi)生菌的影響尚不清楚。因此，本研究通過比較水稻種子不同表面消毒方法對內(nèi)生菌的影響，以尋找適合水稻種子表面消毒的最佳消毒試劑以及其濃度和消毒時間的最適范圍。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 水稻種子的采集

試驗樣品為四川省樂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供的水稻種子中的不育系樂3A，取材時期為成熟期（2016 年9 月）。

1.1.2 藥品及試劑

牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂、蒸餾水、無菌水、0.1%升汞（氯化汞）、0.1%硫酸銅、5%雙氧水、70%無水乙醇、5%高錳酸鉀、活性氯10%的次氯酸鈉溶液。

1.1.3 實驗器材

LDZX-50FA 立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）、電子天平、HPX-9082 MBE 數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱（上海博訊實驗有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、SW-CJ-2FD 雙人單面垂直凈化工作臺（南京艾賽特科技發(fā)展有限公司）、電子萬用爐。500 mL 燒杯和1000 mL 燒杯、1000 mL 錐形瓶（帶塞子）、500 mL 量筒、1000 mL 量筒、玻璃棒、培養(yǎng)皿（若干套）、酒精燈、涂布器棒、鑷子、移液槍0.01 mL (含槍頭)。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備和實驗器具消毒

a）培養(yǎng)基的制備。參照沈萍和陳向東主編的《微生物學(xué)實驗》教材第四版中培養(yǎng)基的制備方法，選擇牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA）。

b）實驗用具消毒。參照微生物學(xué)實驗手冊對實驗工具和培養(yǎng)基做如下滅菌處理，將清洗干凈的培養(yǎng)皿晾干后每十套為一組用報紙包裹并進行包扎，再將實驗過程中使用到的所有玻璃器皿、移液槍的槍頭、裝有培養(yǎng)基的錐形瓶用報紙包裹包扎，后置于高壓蒸汽滅菌鍋中高溫滅菌處理。

c）實驗儀器消毒。使用前對超凈工作臺也要進行消毒，用75%的酒精擦拭后再在紫外燈下光照10 min 進行超凈工作臺的消毒處理。將消毒后的所有實驗器材放置在經(jīng)過消毒處理的超凈工作臺上備用。

滅菌后的培養(yǎng)基倒入在培養(yǎng)皿上，待其冷凝為固體后用標(biāo)簽紙標(biāo)上序號待用。

1.2.2 樣品表面消毒方法

以不育系稻種樂3A 為實驗材料，用電子天平稱取若干組種子，每組種子各1 g，取一組稱量好的水稻種子放在滅菌后的培養(yǎng)皿中用無菌水沖洗干凈，洗去表面灰塵，用吸水紙擦干（取第一次淋洗水稻種子的淋洗液0.1 mL 涂布于NA 固體培養(yǎng)基平板上，在28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，經(jīng)過一段時間（48～72 h）后觀察消毒水稻種子表面細(xì)菌及其數(shù)量）。然后依次在70%乙醇、0.1%升汞、0.1%硫酸銅、5%雙氧水、5%高猛酸鉀、10%的次氯酸鈉溶液中浸泡3 min，最后用無菌水漂洗，洗滌大約5 次，從最后一次淋洗種子的無菌水中用移液槍吸取0.1 mL，涂布于NA 固體培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)箱中溫度設(shè)置28 ℃，培養(yǎng)一段時間（48～72 h），檢測樣品表面消毒效果，每半天進行觀察記錄。

選擇水稻種子表面消毒效果最好的一組消毒試劑，設(shè)置濃度梯度，在不同濃度梯度下分別浸泡水稻種子一定時間（15 s、45 s、5 min、25 min），再用無菌水淋洗5 次，用移液槍吸取最后一次淋洗液0.1 mL 涂布平板，培養(yǎng)箱中溫度約28 ℃，培養(yǎng)一段時間（48～72 h）后檢測水稻種子表面消毒效果。

以上兩組實驗均設(shè)2 組對照，以此檢驗表面消毒效果。（a）超凈工作臺對照。在每組實驗過程中，將NA 固體培養(yǎng)基敞開蓋子放置，實驗結(jié)束后將該對照培養(yǎng)基在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時間（48～72 h）。（b）淋洗液無菌檢測對照。取0.1 mL 無菌水涂布于NA 固體培養(yǎng)基上，然后放置在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)一段時間（48～72 h）檢測消毒效果。（c）種子無菌檢測對照。在NA 固體培養(yǎng)基上壓入經(jīng)上述表面消毒后的完整種子，讓NA 固體培養(yǎng)基與表面消毒的水稻種子接觸3 min，移去表面消毒的水稻種子，在28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，一段時間（48～72 h）后。2 組對照中不長菌或長菌數(shù)目最少，其最低消毒強度為最優(yōu)條件。2 組對照處理可以保證水稻種子表面消毒的準(zhǔn)確性和操作過程的無菌環(huán)境。通過對比采用了不同的消毒方法后水稻種子表面細(xì)菌的數(shù)量，從而得出最適消毒方法。

1.2.3 水稻種子表面消毒效果的檢查

將在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一段時間（48～72 h）后的培養(yǎng)基取出，在超凈臺上觀察NA 固體培養(yǎng)基表面是否出現(xiàn)菌落以及菌落的種類、數(shù)量進行統(tǒng)計和比較，優(yōu)選后得到水稻種子表面消毒的最優(yōu)方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同化學(xué)試劑的表面消毒效果

利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法將水稻種子的漂洗液涂布于NA 固體培養(yǎng)基中，每組平行重復(fù)2次，放入數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中(28 ℃)培養(yǎng)一段時間（48～72 h），進行比較觀察，若放在超凈臺上的NA 固體培養(yǎng)基和淋洗種子的無菌水的NA固體培養(yǎng)基沒有生長菌落，說明實驗試劑以及實驗操作環(huán)境符合標(biāo)準(zhǔn)，實驗過程中不受環(huán)境中細(xì)菌的沾染影響；若最后一次漂洗液和消毒后的種子的NA 固體培養(yǎng)基沒有生長菌落，說明水稻種子表面消毒完整。不同消毒試劑的表面消毒效果如表1 所示，通過統(tǒng)計培養(yǎng)基雜菌數(shù)量和雜菌密度發(fā)現(xiàn)，使用了10%的次氯酸鈉溶液處理后的水稻種子雜菌數(shù)量最少為0，其次是0.1%的升汞，雜菌數(shù)量為1。5%雙氧水消毒效果最差，雜菌數(shù)為3，而0.1% 硫酸銅、5%高錳酸鉀及70%乙醇消毒效果相當(dāng)，雜菌數(shù)都為2。因此，濃度為10% 的次氯酸鈉對水稻種子表面消毒效果最佳。

表1 不同化學(xué)試劑對不育系水稻種子樂3A 的表面消毒效果

2.2 不同濃度的次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒效果

同樣利用傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法將水稻種子不同濃度梯度試驗組的漂洗液涂布于NA 培養(yǎng)基中，每組平行重復(fù)2 次，放入數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱中(28 ℃)培養(yǎng)一段時間（48～72 h），進行比較觀察，若放在超凈臺上的NA 固體培養(yǎng)基和接種無菌水的NA 固體培養(yǎng)基沒有生長菌落，說明實驗試劑以及實驗操作環(huán)境符合標(biāo)準(zhǔn)，實驗過程中不受環(huán)境中細(xì)菌的沾染影響；若消毒后的水稻種子的NA 固體培養(yǎng)基沒有生長菌落，說明水稻種子表面消毒完整，沒有染菌。水稻種子內(nèi)生菌分離前，不同濃度梯度次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒效果如表2所示，可以看出，濃度較高為5.5%和10%的次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒，時間最短，僅需15 s。而較低濃度的次氯酸鈉溶液對水稻種子消毒則需要花費較長時間，次氯酸鈉濃度為1.5%和2.5%時，消毒時間分別為5 min 和45 s。次氯酸鈉溶液能滅殺水稻種子表面細(xì)菌，同樣能殺滅其內(nèi)生菌，由于活性氯含量越高，其越不利于內(nèi)生菌的生長，因此需要選擇的最佳的表面殺菌強度即是能完全殺滅表面細(xì)菌的最低殺菌強度的試驗組。水稻種子表面殺菌強度分別是：活性氯濃度1.5%消毒5 min、2.5%消毒45 s、5.5% 消毒15 s、10% 消毒10 s。對NA固體培養(yǎng)基上菌落數(shù)進行統(tǒng)計，通過比對得出次氯酸鈉溶液的最佳消毒濃度和最佳消毒時間。

表2 樂3A 稻種在次氯酸鈉不同濃度和浸泡時間下的表面消毒效果

2.3 不同消毒強度的影響

由表3 可以看出：用較高濃度的次氯酸鈉溶液對水稻種子進行消毒，較短時間就可以完成其表面的消毒，而且對水稻種子內(nèi)生菌傷害較小。而當(dāng)次氯酸鈉溶液濃度較低時，需要用相對較長的時間才能完成消毒，并會殺滅部分水稻種子內(nèi)生菌。從表中的數(shù)據(jù)可以得出，活性氯含量為5.5%的次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒時間為15 s 時，內(nèi)生菌落數(shù)目為5，而其他三種給消毒方式內(nèi)生菌落的數(shù)目分別為2、3、4。因此用5.5%的次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒時間為15 s 時對內(nèi)生菌影響最小。

表3 活性氯含量不同時水稻種子表面消毒后內(nèi)生菌分離效果

3 討論

3.1 關(guān)于常見的表面消毒試劑的討論

當(dāng)前，對于植物種子的消毒方法并不是很多，且消毒效果各異。在研究水稻內(nèi)生菌時，為了在達(dá)到消毒效果的同時保證植物種子活力以及內(nèi)部細(xì)菌活性，主要使用化學(xué)試劑對其表面進行消毒。而對于水稻種子的表面消毒常見的化學(xué)試劑包括0.1%的升汞（氯化汞）、0.1%的硫酸銅溶液、5%的雙氧水、70%的乙醇、5%的高猛酸鉀溶液，10%的次氯酸鈉溶液[5]，除此之外還可以用石灰水、漂白粉、402（一種抗菌劑）、強氯精（一種抗菌劑）和福爾馬林等。為了保證種子在進行表面消毒后，不僅有利于種子內(nèi)部內(nèi)生菌的分離，還要保證不能使種子失去活性，也不能殺滅水稻種子內(nèi)生細(xì)菌，保證其能完整萌發(fā)出幼芽，通常不會用到石灰水、漂白粉、402（一種抗菌劑）、強氯精（一種抗菌劑）和福爾馬林。因此，在本次實驗過程中沒有涉及到這五種化學(xué)試劑。通過對水稻種子常見消毒試劑的比較，發(fā)現(xiàn)適于分離水稻種子內(nèi)生細(xì)菌實驗的表面消毒試劑有升汞、乙醇、次氯酸鈉溶液、雙氧水、硫酸銅和高猛酸鉀溶液。

3.2 關(guān)于常見的幾種適合水稻種子表面消毒試劑性質(zhì)的討論

低濃度高錳酸鉀具有很強的氧化作用，可促使細(xì)菌或其他有機物立即放出新生態(tài)氧,通過氧化細(xì)菌體內(nèi)的活性基因而發(fā)揮殺滅細(xì)菌作用[6]；過氧化氫通過復(fù)雜的化學(xué)反應(yīng)解離具有高活性的羥基作用于細(xì)胞膜,其強氧化性破壞組成細(xì)菌的蛋白質(zhì),使之死亡（與高錳酸鉀溶液殺菌原理相似）[7]；硫酸銅中Cu2-離子是重金屬離子,病毒由蛋白質(zhì)組成，蛋白質(zhì)遇重金屬離子會失活死亡，所以它能殺毒[8]；乙醇滲入細(xì)菌體內(nèi)，讓細(xì)菌的蛋白質(zhì)凝固變性，它是實驗室中常見的消毒殺菌劑。較高濃度的乙醇會增加蛋白質(zhì)的凝固作用。當(dāng)細(xì)菌接觸到較高濃度的乙醇后表面就會立刻凝固成一層薄膜來阻止乙醇繼續(xù)滲透，細(xì)菌不會完全失活。一些細(xì)菌一旦接觸到較高濃度的乙醇，便會馬上產(chǎn)生反應(yīng)并形成有堅硬外殼的孢子來減少乙醇的傷害。在一定條件下，細(xì)菌又會重新復(fù)活。所以，乙醇濃度過高是不能用作殺菌消毒的。通常70%～75%濃度的乙醇在數(shù)秒之內(nèi)就能殺滅細(xì)菌（約30 s）。用它給物體表面消毒時若結(jié)合其它藥劑會提高它的消毒效果。實驗選用了70%的乙醇進行第一次的水稻種子表面殺菌處理，但不能完全殺滅芽孢。

升汞毒性大，是一種重金屬殺菌劑。0.1%的升汞浸泡稻種10 分鐘，水稻種子表面的細(xì)菌及真菌芽孢就能有效滅殺。但經(jīng)過升汞消毒的水稻種子要用無菌水?dāng)?shù)次洗滌（至少5 次），才可將殘留汞洗凈。又因升汞的使用會引起污染，一般消毒不提倡用升汞。次氯酸鈉溶液消毒用途很廣，不僅可殺菌，且沒有殘留、很容易分解，對人體無毒無害[8-10]。同時，次氯酸鈉殺滅細(xì)菌后易于除去且沒有殘余，不會損傷水稻種子。結(jié)合表1 數(shù)據(jù)可以看出，在幾種消毒試劑中，經(jīng)過次氯酸鈉消毒的水稻種子的表面沒有長菌，說明通過優(yōu)選法可以得出消毒效果最好的化學(xué)試劑是次氯酸鈉。

3.3 關(guān)于實驗環(huán)境無菌的討論

在實際操作過程中,想要做到絕對的表面無菌很難，為了保證消毒效果的可靠性，對消毒過程必須進行嚴(yán)格的檢查。前文檢測淋洗液法、消毒水稻種子印跡法、超凈工作臺檢測法都是為了這個目的。設(shè)置超凈臺無菌檢測對照，是因內(nèi)生細(xì)菌的分離步驟多，無菌操作時間長，操作中所用的培養(yǎng)基和試劑暴露在空氣中的時間久，所以保證超凈工作臺內(nèi)環(huán)境處于無菌狀態(tài)很重要。

3.4 關(guān)于實驗數(shù)據(jù)的討論

比較幾種化學(xué)試劑對水稻種子表面的消毒效果，經(jīng)對平板表面的細(xì)菌種類和數(shù)量對比，得出水稻種子的最優(yōu)消毒試劑。

從表1 中我們可以發(fā)現(xiàn)，未經(jīng)消毒的水稻種子的表面有著大量的細(xì)菌，且種類繁多。水稻內(nèi)生菌分離過程中，為了保證水稻內(nèi)生細(xì)菌分離的準(zhǔn)確性，就必須將水稻種子表面的細(xì)菌殺滅。經(jīng)由升汞、乙醇、次氯酸鈉溶液、雙氧水、硫酸銅和高猛酸鉀溶液浸泡后的水稻種子表面的細(xì)菌明顯減少甚至被殺滅，說明這幾種消毒試劑都有著較為良好的消毒效果，表面的大部分細(xì)菌會被滅殺，可以作為水稻種子表面消毒試劑。通過分析經(jīng)過這六種消毒試劑消毒后水稻種子表面的細(xì)菌種類和細(xì)菌數(shù)量，不難發(fā)現(xiàn)消毒效果良好的消毒試劑就是升汞和次氯酸鈉溶液了，而次氯酸鈉溶液對水稻種子表面的消毒效果較升汞來說更為徹底，所有經(jīng)過優(yōu)選法，最終選擇次氯酸鈉溶液作為水稻種子表面消毒的最佳試劑。

將水稻種子分別浸泡于活性氯含量濃度梯度為1.5%、2.5%和5.5%、10%的次氯酸鈉溶液中15 s、45 s、5 min、25 min，從表2 中的數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)：當(dāng)活性氯含量為1.5%時，浸泡稻種5 min 后能殺滅水表面細(xì)菌；當(dāng)活性氯含量為2.5%時，浸泡稻種45 s便殺滅了表面的細(xì)菌；當(dāng)活性氯含量為5.5%時，浸泡15 s 后即殺死了表面的細(xì)菌，通過這些數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)水稻種子經(jīng)過高濃度活性氯的次氯酸鈉溶液短時間處理和低濃度的次氯酸鈉溶液長時間處理，都可以達(dá)到徹底消毒的效果。

從表3 的數(shù)據(jù)中我們可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)活性氯含量為5.5%的次氯酸鈉溶液處理水稻種子15 s 后，水稻種子內(nèi)生菌落在12 個小時之內(nèi)便產(chǎn)生了，而且菌種數(shù)量最多；當(dāng)用活性氯含量為2.5%的次氯酸鈉溶液處理水稻種子45 s 后，水稻種子內(nèi)生菌落在36 個小時之內(nèi)長出，數(shù)量較少；當(dāng)用活性氯含量為1.5%的次氯酸鈉溶液處理水稻5 min 后，內(nèi)生菌落在48 個小時之內(nèi)長出，而且菌落數(shù)量少?；谝陨蠑?shù)據(jù)分析，我們發(fā)現(xiàn)5.5%次氯酸鈉對水稻種子進行消毒處理15 s，既能保證水稻種子表面較為徹底的消毒，同時又能保持水稻部分內(nèi)生菌活力，是本研究中最適的水稻種子消毒方法。

3.5 關(guān)于實驗結(jié)果的討論

本研究中將10%的次氯酸鈉溶液稀釋成四種活性氯含量不同的次氯酸鈉溶液后，相比之下發(fā)現(xiàn)較高濃度次氯酸鈉溶液對水稻種子短時間消毒效果要比低濃度較長時間消毒更好，且較大程度保證水稻種子內(nèi)生菌數(shù)量種類的完整性。據(jù)此猜測，次氯酸鈉溶液對水稻種子表面消毒過程中，浸泡水稻種子時間較長時，溶液會滲入水稻種子內(nèi)部從而殺滅部分種子內(nèi)生菌。

4 結(jié)論

相比較而言，5.5%濃度的次氯酸鈉溶液對水稻種子進行約15 s 的消毒處理，不僅能達(dá)到高效的消毒效果，又能保證內(nèi)生菌的活力，是幾種方法中最佳的消毒方法。實驗過程中的超凈工作臺內(nèi)環(huán)境無菌檢測、淋洗液無菌檢測，消毒后水稻種子印跡無菌檢測這幾步是為了保證內(nèi)生菌分離不被外界環(huán)境影響或影響最小。

基于此，設(shè)計的水稻種子表面消毒的最佳方案如下：先用無菌水淋洗水稻種子2 遍，去除稻種表面灰塵和雜質(zhì)；再用70%的乙醇浸泡稻種約3 min，用無菌水洗滌1 遍，再用5.5%的次氯酸鈉溶液浸泡稻種約15 s，最后用無菌水淋洗稻種，洗滌次數(shù)5～7 次。這樣，就不僅能極大的確保水稻種子表面消毒的徹底性，且最大程度保證水稻及水稻內(nèi)生細(xì)菌的活性。