王雪瑩，安卓，姚冠峰，郭曉麗，王樹(shù)松，謝聰聰*

(1.河北省生殖健康科學(xué)技術(shù)研究院 河北省生殖醫(yī)院 國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)計(jì)劃生育與優(yōu)生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河北省生殖醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，石家莊 050071；2.河北醫(yī)科大學(xué)研究生院，石家莊 050017)

卵巢儲(chǔ)備功能減退(DOR)是指卵巢內(nèi)可募集卵泡數(shù)量減少，常伴有卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，是女性生育能力下降的主要原因[1-2]。卵丘顆粒細(xì)胞是與卵母細(xì)胞直接接觸的唯一體細(xì)胞，兩者之間存在廣泛細(xì)胞間的連接，在卵母細(xì)胞發(fā)育、成熟和代謝過(guò)程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，是評(píng)估卵母細(xì)胞或胚胎質(zhì)量的最佳非侵入性方法[3]。

線粒體是顆粒細(xì)胞中含量豐富的細(xì)胞器之一，為細(xì)胞的正常發(fā)育提供ATP，并且可以調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的代謝、細(xì)胞周期和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。線粒體DNA(mtDNA)的拷貝數(shù)及完整性會(huì)影響顆粒細(xì)胞的功能和卵母細(xì)胞的發(fā)育[4]，如mtDNA 4977 bp缺失會(huì)通過(guò)干擾氧化磷酸化過(guò)程造成線粒體能量代謝障礙[5]。此外，孔令紅等[6]研究發(fā)現(xiàn)自體顆粒細(xì)胞線粒體移植到發(fā)育潛能低下的卵母細(xì)胞中，可以改善卵母細(xì)胞質(zhì)量和胚胎發(fā)育潛能。因此，檢測(cè)卵丘顆粒細(xì)胞的mtDNA拷貝數(shù)及4977 bp片段缺失率不僅對(duì)評(píng)估DOR患者卵母細(xì)胞質(zhì)量有參考意義，也可能對(duì)線粒體自體移植有更多的指導(dǎo)作用。

資料與方法

一、研究對(duì)象及分組

本研究經(jīng)河北省生殖醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者知情同意并簽署《河北省生殖醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心科研捐贈(zèng)知情同意書》。選取2019年4月至2020年10月在河北省生殖醫(yī)院行IVF/ICSI-ET治療的不孕癥患者33例，ICSI患者指征排除男方少弱畸精子癥。根據(jù)卵巢儲(chǔ)備功能情況分為DOR組和卵巢儲(chǔ)備功能正常(NOR)組，其中DOR組17例，NOR組16例。

DOR患者的納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：抗苗勒管激素(AMH)<1.1 ng/ml；雙側(cè)基礎(chǔ)竇卵泡計(jì)數(shù)(AFC)≤5～7枚；年齡30～45歲，體質(zhì)量指數(shù)(BMI)19～30 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：感染、免疫、手術(shù)等導(dǎo)致DOR者；染色體異常者；患性傳播疾病者。

NOR患者的納入標(biāo)準(zhǔn)：月經(jīng)周期規(guī)律(25～35 d)；基礎(chǔ)激素水平正常：卵泡刺激素(FSH)<8 U/L，黃體生成素(LH)<6 U/L，73.4 pmol/L<雌二醇(E2)<183.5 pmol/L；3枚<每側(cè)AFC<10枚；單純輸卵管因素、男方因素者，選擇供精者；年齡25～40歲，BMI 19～30 kg/m2。排除標(biāo)準(zhǔn)：染色體異常者；排卵障礙(多囊卵巢綜合征等)者；子宮內(nèi)膜異位癥者；卵巢囊腫、卵巢腫瘤者；患性傳播疾病者。

二、主要儀器及試劑

實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增儀(ABI 7500 Fast，Life，美國(guó))，線粒體分離試劑盒(北京Invent)，2×SYBR qPCR Mix(北京莊盟生物)，通用基因組DNA小量提取試劑盒(北京天漠生物)。

三、研究方法

1.促排卵方案：根據(jù)卵巢儲(chǔ)備功能及血清激素水平選擇采用高孕激素狀態(tài)下促排卵(PPOS)方案或拮抗劑方案。結(jié)合B超監(jiān)測(cè)卵泡發(fā)育情況，當(dāng)1～2個(gè)卵泡直徑≥18 mm或者3個(gè)及以上卵泡直徑≥17 mm時(shí)，進(jìn)行扳機(jī)，扳機(jī)后36 h行陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)。拮抗劑方案自取卵日開(kāi)始進(jìn)行黃體支持。

2.胚胎發(fā)育：常規(guī)上游法或密度梯度離心法處理精液，根據(jù)精液情況選擇受精方式；IVF受精5 h后拆除卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，置于G1TMPLUS培養(yǎng)液(Vitrolife，瑞典)中放入Timelapse延時(shí)攝像培養(yǎng)箱(Vitrolife，瑞典)中觀察卵母細(xì)胞成熟度及第二極體的排出情況。若受精方式為 ICSI，取卵后2 h將卵丘復(fù)合物放入7%透明質(zhì)酸酶(Vitrolife，瑞典)中吹打剝除顆粒細(xì)胞，對(duì)所有處于第二次減數(shù)分裂中期(MⅡ)的卵母細(xì)胞行ICSI。受精后18～20 h觀察原核(PN)，出現(xiàn)2PN且兩個(gè)極體為正常受精。受精后第3天根據(jù)卵裂球均勻度、碎片比例、卵裂過(guò)程中異常發(fā)育現(xiàn)象和各個(gè)卵裂時(shí)期的分裂時(shí)間點(diǎn)等進(jìn)行胚胎質(zhì)量評(píng)估[8]。Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)為優(yōu)質(zhì)胚胎；Ⅰ～Ⅲ級(jí)為可利用胚胎。

3.觀察指標(biāo)：BMI，平均獲卵數(shù)；胚胎質(zhì)量指標(biāo)：受精率(受精率=受精數(shù)/MⅡ數(shù)×100%)、卵裂率(卵裂率=卵裂數(shù)/受精數(shù)×100%)、優(yōu)質(zhì)胚胎率(優(yōu)質(zhì)胚胎率=優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)/受精數(shù)×100%)、可利用胚胎率(可利用胚胎率=可利用胚胎數(shù)/受精數(shù)×100%)；臨床妊娠指標(biāo)：臨床妊娠率(臨床妊娠率=臨床妊娠周期數(shù)/總移植周期數(shù)×100%)、種植率(種植率=種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)×100%)。

4.卵丘顆粒細(xì)胞收集：在陰道超聲探頭引導(dǎo)下，通過(guò)陰道穿刺抽吸卵泡，將卵泡液倒入組織培養(yǎng)皿中，在解剖顯微鏡下挑選卵丘復(fù)合物后，將顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)移到G-MOPSTMPLUS培養(yǎng)液中。機(jī)械法小心剝離卵母細(xì)胞周圍的卵丘顆粒細(xì)胞。

5.卵丘顆粒細(xì)胞計(jì)數(shù)：加入7%透明質(zhì)酸酶消化卵丘顆粒細(xì)胞，用巴氏德吸管反復(fù)吹打卵丘顆粒細(xì)胞(時(shí)間≤1 min)，置于顯微鏡下觀察，如果卵丘顆粒細(xì)胞分散均勻，沒(méi)有成團(tuán)的細(xì)胞，加入G-MOPSTMPLUS培養(yǎng)液，終止消化，室溫下400g離心5 min，棄上清，重復(fù)2次，加入1 ml G-MOPSTMPLUS培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液。吸取上述單細(xì)胞懸液10 μl，采用細(xì)胞計(jì)數(shù)板于光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)，細(xì)胞密度(個(gè)/ml)=(細(xì)胞計(jì)數(shù)板四角4個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù)/4)×104。

6.mtDNA的提取：根據(jù)MinuteTM線粒體分離試劑盒說(shuō)明書提取線粒體；提取出來(lái)的線粒體根據(jù)通用基因組DNA小量提取試劑盒說(shuō)明書提取mtDNA。

7.mtDNA拷貝數(shù)序列引物設(shè)計(jì)與合成：NADH脫氫酶亞基1(ND1)片段是mtDNA高度保守序列，可以反映DNA模板中mtDNA的總量，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為110 bp；β-微球蛋白引物擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為88 bp。ND1上游引物序列為5′-GTCAACCTCGCTTCCCCACCCT-3′，結(jié)合位點(diǎn)為6527.4，Tm為66.48℃，下游引物序列為5′-TCCTGCGAATAGGCTTCCGGCT-3′，結(jié)合位點(diǎn)為6702.4，Tm為66.06℃；β-微球蛋白上游引物序列為5′-TGCTGTCTCCATGTTTGATGTATCT-3′，結(jié)合位點(diǎn)為7629，Tm為60.34℃，下游引物序列為5′-TCTCTGCTCCCCACCTCTAAGT-3′，結(jié)合位點(diǎn)為6557.4，Tm為61.98℃。

8.mtDNA 4977 bp缺失的檢測(cè)引物設(shè)計(jì)與合成：mtDNA 4977 bp缺失位于基因組8 469～13 447 bp，上游引物1序列為5′-CCCTTCGCTGACGCCATA-3′，結(jié)合位點(diǎn)為5395.6，Tm為59.50℃，下游引物1序列為5′-AGTAGAAGAGCGATGGTGAGAGC-3′，結(jié)合位點(diǎn)為7226.6，Tm為61.80℃；上游引物2序列為5′-CACCATAATTACCCCCATACTCCTTA-3′，結(jié)合位點(diǎn)為7754.2，Tm為59.73℃，下游引物2序列為5′-CACCATAATTACCCCCATACTCCTTA-3′，結(jié)合位點(diǎn)為7416.8，Tm為59.73℃。

9. 實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)體系：模板2 μl，2×SYBR qPCR Mix 10 μl，50×Dye ROX 0.1 μl，上游引物和下游引物各0.2 μl，加ddH2O至20 μl。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性3 min，94℃變性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)周期，72℃孵育5～10 min。陰性對(duì)照以 ddH2O代替待測(cè)模板，每例樣品及陰性對(duì)照均設(shè)3個(gè)平行復(fù)孔，取平均值。

10. 瓊脂糖凝膠電泳：1×TAE溶液(Thermo，美國(guó))配制0.75%的瓊脂糖凝膠(Vivantis，美國(guó))；取4 μl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與1 μl的6×Loading buffer(北京普利萊)混勻，加入上樣孔；電泳150 V恒壓35 min；觀察紫外分析儀(Acuronbio，美國(guó))下的目的條帶。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組患者一般情況比較

兩組患者的BMI、不孕年限、基礎(chǔ)FSH(bFSH)、bE2和bLH無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；DOR組的女方年齡顯著高于NOR組(P<0.05)，DOR組AFC顯著低于NOR組(P<0.05)(表1)。

二、兩組患者實(shí)驗(yàn)室參數(shù)及妊娠結(jié)局比較

兩組患者卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎率、可利用胚胎率、臨床妊娠率、種植率均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)；DOR組促性腺激素(Gn)天數(shù)、Gn用量、平均獲卵數(shù)和受精率顯著低于NOR組(P<0.05)(表2)。

表1 兩組患者一般情況比較(-±s)

表2 兩組患者實(shí)驗(yàn)室參數(shù)及妊娠結(jié)局比較[(-±s)，%]

三、兩組患者顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)PCR反應(yīng)的熔解曲線

β-微球蛋白和ND1的熔解曲線見(jiàn)圖1，熔解曲線顯示，β-微球蛋白PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Tm為82.17℃，ND1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Tm為82.18℃，熔解溫度均一，峰的形狀銳利，無(wú)雜峰，提示PCR產(chǎn)物單一，無(wú)副產(chǎn)物。

圖1 β-微球蛋白和ND1蛋白的PCR熔解曲線

四、兩組的mtDNA拷貝數(shù)比較

mtDNA拷貝數(shù)與細(xì)胞內(nèi)線粒體的數(shù)量相關(guān)，mtDNA拷貝數(shù)已成為一種可靠的、無(wú)創(chuàng)的線粒體平均數(shù)目計(jì)算方法。ND1片段是mtDNA高度保守序列，可以反映DNA模板中mtDNA的總量。通過(guò)計(jì)數(shù)顆粒細(xì)胞的數(shù)量，對(duì)兩組的顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)做了相對(duì)于1×104顆粒細(xì)胞的定量。

卵丘顆粒細(xì)胞采用MinuteTM線粒體分離試劑盒提取線粒體然后提取mtDNA。通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀自帶軟件計(jì)算出CT值，采用2-△△CT的計(jì)算法，分別算出DOR組和NOR組顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)相對(duì)于1×104顆粒細(xì)胞的定量。β-微球蛋白和ND1蛋白的擴(kuò)增曲線見(jiàn)圖2。統(tǒng)計(jì)兩組患者卵丘顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)后結(jié)果顯示，DOR組mtDNA拷貝數(shù)(1.04±0.48)略低于NOR組的mtDNA拷貝數(shù)(1.13±0.52)，但兩者尚無(wú)顯著性差異(P>0.05)(圖3)。

圖2 β-微球蛋白和ND1蛋白的擴(kuò)增曲線圖

圖3 兩組mtDNA拷貝數(shù)相對(duì)定量比較

五、兩組患者卵丘顆粒細(xì)胞mtDNA 4977 bp缺失情況比較

實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞mtDNA 4977 bp缺失情況。mtDNA 4977 bp缺失引物1位于缺失片段內(nèi)部，對(duì)于正常mtDNA，可擴(kuò)增60 bp片段；而對(duì)于片段缺失的mtDNA，無(wú)法擴(kuò)增。引物2位于缺失片段的外側(cè)，對(duì)于發(fā)生4977 bp缺失的mtDNA，其可擴(kuò)增出173 bp片段；而對(duì)于正常mtDNA而言，由于上游引物2和下游引物2間隔距離太遠(yuǎn)，在這個(gè)擴(kuò)增條件下沒(méi)有擴(kuò)增產(chǎn)物，表現(xiàn)出陰性結(jié)果。PCR反應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物行瓊脂糖電泳檢測(cè)，DOR組和NOR組的卵丘顆粒細(xì)胞mtDNA均未檢測(cè)到4977 bp缺失(圖4)。

M：DNA marker；泳道1～3及7～9為DOR組，泳道4～6及10～12為NOR組；泳道1～6為mtDNA 4977 bp缺失引物2擴(kuò)增情況，泳道7～12為引物1擴(kuò)增情況。圖4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)顆粒細(xì)胞mtDNA 4977 bp缺失電泳圖

討 論

在卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的過(guò)程中，胞質(zhì)內(nèi)線粒體和mtDNA經(jīng)歷階段性的空間再分布，調(diào)節(jié)ATP生成，從而迅速、有效地為細(xì)胞“定點(diǎn)”提供能量[9]。mtDNA拷貝數(shù)變化情況與卵母細(xì)胞成熟所需能量變化情況一致[10-11]。mtDNA拷貝數(shù)及完整性是決定卵母細(xì)胞形態(tài)和功能是否正常的關(guān)鍵因素，是卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要標(biāo)志。其中4977 bp片段缺失是最常見(jiàn)的mtDNA突變類型，如果顆粒細(xì)胞內(nèi)存在4977 bp缺失，則不能編碼合成細(xì)胞色素氧化酶，導(dǎo)致ATP合成減少，膜電位喪失，從而產(chǎn)生大量的活性氧，活化凋亡信號(hào)，引起卵母細(xì)胞的凋亡[12-13]。

本研究數(shù)據(jù)表明DOR組Gn天數(shù)及用量顯著低于NOR組，獲卵數(shù)及受精率亦顯著低于NOR組(P<0.05)，妊娠率及種植率僅略低于NOR組，優(yōu)質(zhì)胚胎率及可利用胚胎率與NOR組無(wú)顯著性差異(P>0.05)。出現(xiàn)這種情況的原因可能是雖然DOR患者卵母細(xì)胞對(duì)Gn反應(yīng)下降，但此類患者AFC較少，所以Gn天數(shù)及用量均降低。由于卵母細(xì)胞對(duì)Gn反應(yīng)下降導(dǎo)致成熟卵母細(xì)胞數(shù)量減少，從而獲卵數(shù)較少。DOR患者卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，影響其受精及后期胚胎發(fā)育潛能。在本研究中，DOR組受精率下降，但優(yōu)質(zhì)胚胎率及可利用胚胎率與NOR組相比無(wú)顯著差異，可能是因?yàn)閮?yōu)質(zhì)胚胎率及可利用胚胎率的計(jì)算公式中分母為受精數(shù)，DOR組受精數(shù)少，所以相對(duì)胚胎質(zhì)量無(wú)明顯差異。臨床妊娠率及種植率略低于NOR組，但尚無(wú)顯著性差異，可能是因?yàn)镈OR組移植的總周期數(shù)太少，存在偶然性因素。此結(jié)果與趙紅翠等[14]的研究結(jié)論一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)DOR組和NOR組的mtDNA拷貝數(shù)無(wú)顯著性差異(P>0.05)，且均不存在4977 bp片段缺失。出現(xiàn)這種情況的原因可能是：(1)顆粒細(xì)胞是不穩(wěn)定細(xì)胞，不斷分裂模式以取代功能受到破壞的細(xì)胞，從而維持mtDNA正?？截悢?shù)。(2)排卵前顆粒細(xì)胞內(nèi)線粒體急劇增加，如果某些mtDNA發(fā)生突變或缺失時(shí)，其它mtDNA分子可以彌補(bǔ)由此造成的功能異常。(3)本次實(shí)驗(yàn)樣本量少，未能收集到更多樣本，研究結(jié)論存在偶然性。本研究結(jié)果和之前文獻(xiàn)[15-17]報(bào)道的結(jié)果一致。本研究中，DOR患者的顆粒細(xì)胞中均未檢測(cè)到4977 bp片段缺失，說(shuō)明本研究中DOR組的DNA結(jié)構(gòu)是基本完整的，該類患者的臨床結(jié)局可能與線粒體DNA結(jié)構(gòu)無(wú)關(guān)。線粒體是半自主細(xì)胞器，受細(xì)胞核基因組與線粒體基因組的共同調(diào)控。由于mtDNA沒(méi)有組蛋白和染色體結(jié)構(gòu)的保護(hù)而極易損傷，mtDNA突變率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于核DNA突變率[16]。目前為止，線粒體DNA中有超過(guò)300個(gè)核基因的突變已經(jīng)被證明是導(dǎo)致線粒體疾病的重要因素，其中許多在卵巢功能不全、卵巢早衰、DOR中起著重要作用[18-21]。

本研究也有自己的特色：第一，之前研究顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)和mtDNA 4977 bp缺失都是直接提取顆粒細(xì)胞的mtDNA，而本研究是先提取顆粒細(xì)胞有活性的線粒體，然后再提取mtDNA。這樣操作后mtDNA沒(méi)有摻雜顆粒細(xì)胞的基因組DNA，因此提取的mtDNA更純。第二，本研究對(duì)顆粒細(xì)胞進(jìn)行了計(jì)數(shù)，對(duì)兩組的顆粒細(xì)胞mtDNA拷貝數(shù)做了相對(duì)于1×104顆粒細(xì)胞的定量。但樣本量較小也是本研究的一個(gè)局限性，后續(xù)需要繼續(xù)進(jìn)行數(shù)據(jù)追蹤加以深入探討。

綜上，本研究中DOR患者的線粒體4977 bp片段未發(fā)現(xiàn)缺失，mtDNA拷貝數(shù)也未見(jiàn)減少。本研究結(jié)果為DOR患者的自體顆粒細(xì)胞線粒體移植的實(shí)現(xiàn)提供了進(jìn)一步的理論依據(jù)。