張麗娟，吳宇碧*，曾定元，劉坤友

(柳州市婦幼保健院 廣西婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 1.產(chǎn)科；2.質(zhì)量辦，柳州 545001)

妊娠期糖尿病(Gestational diabetes mellitus，GDM)是妊娠期最常見的并發(fā)癥之一，是指妊娠期間首次確認(rèn)的糖代謝異常(不包含孕前已經(jīng)存在的1型糖尿病和2型糖尿病)。其可能導(dǎo)致嚴(yán)重的新生兒疾病如巨大兒、新生兒低血糖癥，或?qū)е履阁w先兆子癇等短期并發(fā)癥，以及母親及其后代患2型糖尿病、肥胖和心血管疾病的長(zhǎng)期風(fēng)險(xiǎn)[1]。GDM的發(fā)生是由于胰腺β細(xì)胞功能下降和胰島素抵抗增加所導(dǎo)致，它是一種代謝并發(fā)癥，尤其好發(fā)于與胰島素抵抗相關(guān)的肥胖女性中[2]。

瘦素和脂聯(lián)素是調(diào)節(jié)胰島素分泌、胰島素敏感性以及葡萄糖和脂質(zhì)代謝的脂肪因子。瘦素是ob基因的產(chǎn)物，由脂肪細(xì)胞分泌，可調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。有研究表明，血清瘦素水平升高與糖尿病、脂質(zhì)紊亂有關(guān)，并且其是心血管疾病的危險(xiǎn)因素[3]。其合成具有遺傳背景，受瘦素基因遺傳多態(tài)性的調(diào)控。脂聯(lián)素在脂肪組織中產(chǎn)生并調(diào)節(jié)各種代謝過程，包括葡萄糖和脂質(zhì)代謝以及脂肪酸氧化。脂聯(lián)素具有降低胰島素抵抗、改善脂質(zhì)代謝及抗炎的作用。在代謝綜合征、糖尿病、血脂異常和肥胖癥患者中已觀察到血漿脂聯(lián)素水平降低[4]。之前有研究表明，脂聯(lián)素和瘦素單核苷酸多態(tài)性(SNP)基因分型與糖尿病、代謝綜合征和肥胖癥之間存在顯著關(guān)聯(lián)[5-6]。但尚未見多個(gè)SNP的聯(lián)合研究報(bào)道。因此，本研究對(duì)GDM孕婦外周血脂聯(lián)素和瘦素及其受體基因的7個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析，旨在探討脂聯(lián)素和瘦素及其受體基因的SNP位點(diǎn)多態(tài)性與GDM發(fā)生的可能關(guān)系。

資料與方法

一、研究對(duì)象

本研究為病例對(duì)照研究。

按照GDM篩查和診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，孕婦在孕24～28周時(shí)進(jìn)行75 g葡萄糖耐量試驗(yàn)(OGTT)，出現(xiàn)空腹血糖≥5.1 mmol/L、服糖后1 h血糖≥10.0 mmol/L、2 h后血糖≥8.5 mmol/L三項(xiàng)中任何一項(xiàng)者，即可診斷為GDM，納入病例組；OGTT結(jié)果正常者視為葡萄糖耐量正常(NGT)，納入對(duì)照組。

病例組的排除標(biāo)準(zhǔn)：孕前患有1型和2型糖尿病、自身免疫性和炎癥性疾病、腫瘤疾病和慢性感染以及拒絕參加本研究的患者。

對(duì)照組排除標(biāo)準(zhǔn)：孕前患有1型和2型糖尿病、既往妊娠GDM、自身免疫性和炎癥性疾病、腫瘤性疾病和慢性感染以及拒絕參加本研究的患者。

根據(jù)病例組和對(duì)照組的納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共收集2019年1—12月在我院常規(guī)產(chǎn)檢的156例NGT孕婦為對(duì)照組，162例GDM孕婦為病例組。

本研究中所有樣本監(jiān)測(cè)和采集過程均獲得我院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)(批文號(hào)20170010)。

二、脂聯(lián)素和瘦素及其受體多態(tài)性基因位點(diǎn)的確定

進(jìn)行外周血DNA檢測(cè)。選擇脂聯(lián)素ADIPOQ1基因SNP位點(diǎn)rs266729、rs17300539，ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)rs1501299、rs2241766，脂聯(lián)素受體ADIPOQR1基因SNP位點(diǎn)rs1539355，瘦素OGDH基因SNP位點(diǎn)rs12112075和瘦素受體LEPR基因SNP位點(diǎn)rs1137101共7個(gè)SNP位點(diǎn)多態(tài)性(表1)。

三、脂聯(lián)素和瘦素及其受體位點(diǎn)的引物信息

針對(duì)上述7個(gè)SNP位點(diǎn)，設(shè)計(jì)了擴(kuò)增引物和延伸引物(表2)。

續(xù)表

表2 脂聯(lián)素和瘦素及其受體位點(diǎn)的引物信息

四、單堿基末端延伸(SNaPshot)PCR擴(kuò)增流程

根據(jù)DNA抽提試劑盒的流程，提取研究對(duì)象的DNA，經(jīng)過多重PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增引物1∶1混合)后，將PCR產(chǎn)物分裝，進(jìn)一步經(jīng)SNaPshot PCR擴(kuò)增，按比例混合延伸引物，加入消化完的模板DNA 1.0 μl混勻，設(shè)定反應(yīng)程序：96℃，10 s；96℃ 10 s，50℃ 5 s，60℃ 30 s；25個(gè)循環(huán)。保存于4℃。讀取研究結(jié)果。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、兩組研究對(duì)象人口學(xué)信息和臨床特征

本研究共納入318例孕婦，其中156例NGT孕婦(對(duì)照組)，162例GDM孕婦(病例組)。兩組比較，病例組的分娩孕周顯著小于對(duì)照組，孕前體質(zhì)量指數(shù)(BMI)和孕前體重、空腹血糖和糖化血紅蛋白及剖宮產(chǎn)率顯著高于對(duì)照組(P均<0.05)(表3)。

表3 兩組研究對(duì)象人口學(xué)信息和臨床特征分析[(-±s)，n(%)]

二、兩組研究對(duì)象脂聯(lián)素/脂聯(lián)素受體、瘦素/瘦素受體基因檢測(cè)位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率

1.脂聯(lián)素ADIPOQ1基因SNP位點(diǎn)：rs266729的GG基因型、等位基因G在病例組的分布頻率較對(duì)照組顯著降低(P<0.001)(表4)。

2.脂聯(lián)素ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)：rs1501299的TT基因型、等位基因T在病例組的分布頻率較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)；rs2241766的GG基因型、等位基因G在病例組的分布頻率較對(duì)照組顯著升高(P<0.001)(表5)。

表4 脂聯(lián)素ADIPOQ1基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率[n(%)]

表5 脂聯(lián)素ADIPOQ2基因兩個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率[n(%)]

3.脂聯(lián)素受體ADIPOQR1基因SNP位點(diǎn)：rs1539355基因型分布及等位基因頻率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表6)。

4.瘦素及瘦素受體基因：瘦素基因OGDH及瘦素受體基因LEPRSNP位點(diǎn)的基因型分布及頻率在兩組間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(表7)。

表6 脂聯(lián)素受體ADIPOQR1基因SNP位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率[n(%)]

表7 瘦素及瘦素受體基因SNP位點(diǎn)基因型分布和等位基因頻率[n(%)]

三、脂聯(lián)素基因多態(tài)性與GDM患病風(fēng)險(xiǎn)的單因素和多因素分析

1.單因素分析：將結(jié)果變量NGT定義為0、GDM定義為1，將自變量中每一個(gè)SNP位點(diǎn)的野生純合子定義為0、雜合子和突變純合子定義為1，納入上述基因型頻率差異分布的3個(gè)SNP位點(diǎn)rs266729、rs1501299和rs2241766基因型分布數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素分析。結(jié)果顯示：病例組SNP位點(diǎn)rs266729與rs1501299、rs2241766的基因頻率分布與對(duì)照組均存在顯著差異性(P均<0.05)(表8)。

2.多因素分析：將3個(gè)位點(diǎn)的基因型分布納入到多因素Logistic回歸分析，選擇向后LR模式，結(jié)果顯示：rs266729與rs2241766位點(diǎn)突變可致GDM患病風(fēng)險(xiǎn)增加，其OR(95%CI)分別為4.09(2.08，8.06)和2.77(1.63，4.74)(P<0.001)(表9)。

四、脂聯(lián)素基因-基因多態(tài)性的交互作用分析

為了確定孕婦體內(nèi)的脂聯(lián)素基因是否存在交互作用導(dǎo)致GDM發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)增高，對(duì)兩組研究對(duì)象有頻率分布差異的3個(gè)基因位點(diǎn)進(jìn)行了基因-基因間的交互作用分析，結(jié)果顯示，脂聯(lián)素ADIPOQ1基因SNP位點(diǎn)rs266729與ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)rs2241766的分布之間存在交互作用，二者的聯(lián)合作用導(dǎo)致GDM患病風(fēng)險(xiǎn)增加[OR(95%CI)為4.83(1.57，11.42)，P<0.001](表10)。

表8 脂聯(lián)素基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性的單因素分析

表9 脂聯(lián)素基因SNP位點(diǎn)多態(tài)性的多因素分析

表10 脂聯(lián)素基因-基因多態(tài)性的交互作用單因素分析

討 論

全球GDM的患病率在過去幾十年中呈持續(xù)上升趨勢(shì)。根據(jù)國(guó)際糖尿病聯(lián)合會(huì)(IDF)的數(shù)據(jù)，2017年全球GDM的患病率為14%，其中非洲為9%、北美為12.6%、亞洲為21%[8]。一項(xiàng)調(diào)查東亞和東南亞地區(qū)GDM患病率的薈萃分析顯示，中國(guó)GDM的發(fā)病率為11.91%，遠(yuǎn)高于日本、韓國(guó)和泰國(guó)的8.0%[9]。由于經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平提高及生活方式的改變，以飲食模式的變化和缺乏身體活動(dòng)為特征，加之對(duì)GDM篩查的重視，中國(guó)GDM患病率急劇上升。包括25項(xiàng)橫斷面研究或回顧性研究在內(nèi)的涉及79 064名中國(guó)孕婦的一項(xiàng)薈萃分析表明，根據(jù)國(guó)際糖尿病協(xié)會(huì)和妊娠研究組(IADPSG)診斷標(biāo)準(zhǔn)，中國(guó)GDM的總患病率為14.8%[95%CI(12.8%，16.7%)][10]。

作為糖尿病前期狀態(tài)，GDM通常與高胰島素血癥和胰島素抵抗有關(guān)，但GDM的病理生理學(xué)尚不明確。脂聯(lián)素和瘦素是研究較多的與糖尿病及GDM相關(guān)的脂肪因子，其中脂聯(lián)素及瘦素基因多態(tài)性的研究尤為廣泛。體內(nèi)脂聯(lián)素水平受遺傳的調(diào)控[11]。脂聯(lián)素是ADIPOQ基因的產(chǎn)物，該基因長(zhǎng)度約15.8 kb，包含3個(gè)外顯子，位于染色體3q27上，該染色體與代謝綜合征、2型糖尿病和心血管疾病的易感位點(diǎn)相關(guān)[11]。ADIPOQ基因常呈多態(tài)性，其常見遺傳變異對(duì)血漿脂聯(lián)素水平的影響及其與不同代謝特征的關(guān)聯(lián)受到越來越多的關(guān)注。研究結(jié)果顯示，ADIPOQ1基因SNP位點(diǎn)rs266729的小G等位基因與白種人和亞洲人的脂聯(lián)素水平降低、空腹血糖升高、胰島素抵抗、肥胖、2型糖尿病、糖尿病腎病和代謝綜合征有關(guān)[12]。已有較多的文獻(xiàn)報(bào)道了rs266729位點(diǎn)多態(tài)性與GDM患病的相關(guān)性。如一項(xiàng)薈萃分析結(jié)果顯示，rs266729位點(diǎn)的GG/GC基因型可增加亞洲人和歐洲人患GDM的風(fēng)險(xiǎn)，其OR(95%CI)分別為2.08(1.01，4.27)和1.52(1.03，2.25)[13]。本研究結(jié)果與上述的研究相反，GDM患者攜帶GG/GC基因型和G等位基因的頻率低于非GDM患者，我們分析認(rèn)為不排除人種差異的關(guān)系，并且有文獻(xiàn)報(bào)道在GDM患者中發(fā)現(xiàn)罕見基因G起了一定的保護(hù)作用，而常見的C等位基因與GDM患病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)[12]。已有研究發(fā)現(xiàn)妊娠特異性β1糖蛋白與脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子相關(guān)，其過表達(dá)增強(qiáng)了基因啟動(dòng)子的活性。rs266729位點(diǎn)的G等位基因改變了轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)的DNA序列，導(dǎo)致脂聯(lián)素基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性降低[14]。此外，根據(jù)基因組序列中DNA甲基化的位置，其結(jié)果會(huì)產(chǎn)生不同的遺傳效應(yīng)。如基因啟動(dòng)子和基因間區(qū)域會(huì)發(fā)生甲基化并導(dǎo)致基因沉默，最終影響基因在發(fā)育過程中的表達(dá)。rs266729啟動(dòng)子區(qū)域的DNA甲基化與多態(tài)性相互作用可能導(dǎo)致ADIPOQ1基因表達(dá)受到抑制[15]。另一方面，脂聯(lián)素基因的轉(zhuǎn)錄活性在妊娠期間根據(jù)新發(fā)育胚胎的需要而改變，這可能涉及相應(yīng)調(diào)節(jié)因子的活性和/或結(jié)合的變化；由rs266729改變的序列可能在孕婦和非孕婦的脂肪細(xì)胞中發(fā)揮不同的作用。因此，G等位基因會(huì)降低非妊娠個(gè)體中ADIPOQ的表達(dá)，它可能會(huì)使啟動(dòng)子對(duì)與妊娠相關(guān)的抑制反應(yīng)減弱[12]。以上兩點(diǎn)可能可以部分地解釋GDM患者的G等位基因的保護(hù)作用。本研究未發(fā)現(xiàn)瘦素及其受體與GDM發(fā)生之間的關(guān)系，這與既往報(bào)道[16-17]不一致，可通過更大樣本的研究進(jìn)一步探討。

已有的文獻(xiàn)證據(jù)提示ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)rs2241766多態(tài)性與個(gè)體糖尿病、肥胖和代謝綜合征的易感性有關(guān)[11，18]。一項(xiàng)研究表明，ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)rs2241766的GG位點(diǎn)和等位基因G的高頻率分布是導(dǎo)致糖尿病腎病患病的主要危險(xiǎn)因素，其OR(95%CI)為1.51(1.16，1.95)[15]。本研究結(jié)果表明，ADIPOQ2基因SNP rs2241766的GT/GG基因型和G等位基因更常見于GDM孕婦。此結(jié)果與既往的研究報(bào)道[19-20]一致。一項(xiàng)在伊朗的孕產(chǎn)婦人群中的研究顯示，與TT基因型相比，GT/GG基因型發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)高2.5倍，在調(diào)整了包括孕齡、胰島素抵抗指數(shù)和糖化血紅蛋白在內(nèi)的混雜因素后，這種關(guān)聯(lián)仍然存在[19]。另一項(xiàng)納入了22項(xiàng)研究，包括1 461名GDM孕婦和1 592名非GDM孕婦的薈萃分析結(jié)果顯示，與TT基因型相比，GT/GG基因型發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)升高[OR(95%CI)為1.43(1.23，1.67)]；攜帶G等位基因發(fā)生GDM的風(fēng)險(xiǎn)是攜帶T等位基因的1.41倍[95%CI(1.25，1.56)][20]。

由于復(fù)雜的疾病往往由多重因素相互作用引起，基因與基因、基因與環(huán)境間的交互作用分析將會(huì)提高檢測(cè)因果關(guān)系的能力，從而有可能增加對(duì)疾病遺傳學(xué)的了解。已有研究揭示，脂聯(lián)素基因與其他基因的SNP位點(diǎn)交互作用可導(dǎo)致疾病的發(fā)生，如有文獻(xiàn)報(bào)道了ADIPOQ1 rs266729與脂聯(lián)素基因的其他SNP位點(diǎn)存在基因-基因交互作用可增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[21]。此外，也有研究報(bào)道了ADIPOQ2 rs2241766位點(diǎn)與其他基因的SNP位點(diǎn)存在基因-基因交互作用可增加結(jié)直腸癌的患病風(fēng)險(xiǎn)[22]。但目前尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于ADIPOQ1基因rs266729與ADIPOQ2基因rs2241766的基因-基因交互作用對(duì)疾病影響情況的報(bào)道。本研究報(bào)道了ADIPOQ1基因SNP位點(diǎn)rs266729與ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)rs2241766的基因-基因交互作用可增加GDM的患病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上，脂聯(lián)素ADIPOQ1基因SNP位點(diǎn)rs266729和ADIPOQ2基因SNP位點(diǎn)rs2241766突變可能增加GDM的患病風(fēng)險(xiǎn)，兩個(gè)SNP位點(diǎn)之間的交互作用與GDM的發(fā)生有關(guān)。