李萌萌，郝娜，周京，周希亞，蔣宇林，戚慶煒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院產(chǎn)科中心，國(guó)家婦產(chǎn)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100730)

胎兒頸后透明層(nuchal translucency，NT)增厚與胎兒染色體異常以及致病性拷貝數(shù)變異(pathogenic copy number variants，pCNV)風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[1-3]，當(dāng)NT增厚時(shí)應(yīng)建議孕婦進(jìn)行包含染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis，CMA)檢測(cè)在內(nèi)的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)。目前臨床上對(duì)于NT增厚切割值的選取尚未取得普遍的共識(shí)。國(guó)外的大多數(shù)研究以3.5 mm作為NT增厚的固定切割值[4-6]，但也有少量研究顯示當(dāng)NT在3.0～3.4 mm之間時(shí)，胎兒pCNV風(fēng)險(xiǎn)增加，建議應(yīng)對(duì)其進(jìn)行包含CMA檢測(cè)在內(nèi)的遺傳學(xué)檢測(cè)[7-8]。國(guó)內(nèi)的研究基本以3.0 mm作為NT增厚的切割值。但國(guó)內(nèi)外對(duì)于NT厚度位于其分布的第95百分位數(shù)(P95)至2.9 mm之間時(shí)胎兒染色體異常和pCNV的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估則基本缺乏。本研究通過(guò)對(duì)115例胎兒NT厚度在其分布的P95至2.9 mm之間患者的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，探討是否可將NT厚度在其分布的P95作為產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)的切割值。

資料和方法

一、研究對(duì)象

選取2017年1月1日至2021年8月31日在北京協(xié)和醫(yī)院就診、妊娠11～13+6周行超聲檢查提示胎兒NT厚度介于其分布的P95至2.9 mm之間的孕婦共115例，包括在本院產(chǎn)檢的孕婦以及外院高危轉(zhuǎn)診的孕婦。根據(jù)當(dāng)時(shí)或中孕期的超聲檢查是否同時(shí)合并其他異常，將病例分為孤立性NT增厚和非孤立性NT增厚兩組。孤立性NT增厚指在妊娠11～13+6周的超聲以及之后的超聲檢查中均未發(fā)現(xiàn)其他異常；反之則為非孤立性NT增厚。所有患者均接受產(chǎn)前遺傳學(xué)咨詢，以及產(chǎn)前染色體核型分析和CMA檢測(cè)，并根據(jù)檢測(cè)后咨詢決定是否繼續(xù)妊娠。

二、研究方法

1.G顯帶染色體核型分析：胎兒的絨毛、羊水標(biāo)本均于本院產(chǎn)前診斷中心實(shí)驗(yàn)室分揀處理，進(jìn)行原位法細(xì)胞培養(yǎng)。絨毛標(biāo)本經(jīng)酶解后于37℃水浴，離心后加入培養(yǎng)液，在37℃、 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，至細(xì)胞貼壁并形成多個(gè)集落后收獲。羊水經(jīng)離心后加入培養(yǎng)液，取 0.5 ml細(xì)胞懸液接種，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)后收獲。制片后行G顯帶染色和染色體核型分析，染色體顯帶水平為400條帶。每例計(jì)數(shù)20個(gè)核型，分析5個(gè)核型。

2.CMA檢測(cè)：絨毛、羊水基因組DNA通過(guò)Qiagen DNA Mini試劑盒(Valencia，美國(guó))提取，DNA樣本濃度經(jīng)NanoDrop 2000儀(Thermo Fisher Scientific Inc，美國(guó))進(jìn)行測(cè)定，取吸光度A 260/280 nm在1.8～2.1之間的樣本，轉(zhuǎn)移至-20℃冰箱保存以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。CMA檢測(cè)使用CytoScan 750K芯片(Affymetrix Inc，美國(guó))，數(shù)據(jù)分析使用ChAS 4.2(chromosome analysis suit)版本。

拷貝數(shù)變異(CNV)的分類解析參考國(guó)際公共數(shù)據(jù)庫(kù)及發(fā)表文獻(xiàn)，包括OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(Online Mendelian Inheritance in Man，http：//www.omim.org/)、DECIPHER數(shù)據(jù)庫(kù)(Database of Chromosomal Imbalance and Phenotype in Humans using Ensembl Resources，https：//decipher.sanger.ac.uk/)、ClinVar數(shù)據(jù)庫(kù)(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar/)、ClinGen劑量敏感數(shù)據(jù)庫(kù)(ClinGen Dosage Sensitivity Map，https：//www.clinicalgenome.org)、UCSC(http：//genome.ucsc.edu/)及Pubmed。按照美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)(American College of Medical Genetics，ACMG)的相關(guān)指南對(duì)CNV進(jìn)行分類。

3.病例資料收集：回顧性分析患者的臨床資料，包括年齡、孕產(chǎn)次、孕中期胎兒超聲檢查、產(chǎn)前遺傳學(xué)診斷結(jié)果等。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、臨床特點(diǎn)

115例患者平均年齡為(32.3±3.9)歲，其中高齡孕婦30例，占26.1%。孤立性NT增厚99例，占86.1%(99/115)；非孤立性NT增厚16例，占13.9%(16/115)，其中2例合并側(cè)腦室增寬，6例合并頸背皮膚褶皺增厚，5例合并心臟異常，1例合并鼻骨發(fā)育不良，2例合并胎兒水腫。

二、介入性產(chǎn)前診斷情況

115例NT增厚患者均行產(chǎn)前診斷，其中絨毛活檢(chorionic villus sampling，CVS)17例，羊膜腔穿刺98例。

三、產(chǎn)前遺傳性診斷結(jié)果

1.孤立性NT增厚胎兒產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果：在99例孤立性NT增厚胎兒中，有89例染色體核型分析及CMA檢測(cè)結(jié)果均未見(jiàn)異常。對(duì)孕婦及其家屬進(jìn)行相應(yīng)遺傳咨詢后，所有孕婦均選擇繼續(xù)妊娠，后續(xù)產(chǎn)前檢查未見(jiàn)異常。

3例染色體核型分析和CMA檢測(cè)結(jié)果均異常，占孤立性NT增厚病例的3.03%(3/99)，其中2例21三體，對(duì)孕婦及其家屬進(jìn)行相應(yīng)遺傳咨詢后，孕婦選擇終止妊娠；另有1例47，XXX，對(duì)孕婦及其家屬進(jìn)行相應(yīng)遺傳咨詢后，孕婦選擇繼續(xù)妊娠，后續(xù)產(chǎn)前檢查未見(jiàn)異常。

7例染色體核型分析結(jié)果正常，但CMA檢出臨床意義不明確的CNV，占孤立性NT增厚病例的7.07%(7/99)。對(duì)孕婦及其家屬進(jìn)行相應(yīng)遺傳咨詢后，孕婦選擇繼續(xù)妊娠，后續(xù)產(chǎn)前檢查未見(jiàn)異常。

2.非孤立性NT增厚胎兒產(chǎn)前診斷結(jié)果：16例非孤立性NT增厚胎兒中，3例染色體核型分析與CMA檢測(cè)結(jié)果均異常，均為18三體，對(duì)孕婦及其家屬進(jìn)行相應(yīng)遺傳咨詢后，孕婦選擇終止妊娠。1例CMA檢測(cè)結(jié)果為arr[hg19]18p11.32p11.21(136，227_12，441，861)×1，18q22.2q23(68，292，152_78，013，728)×1，提示胎兒在18p11.32p11.21區(qū)段存在12.3 Mb片段的缺失，在18q22.2q23區(qū)段存在9.7 Mb片段的缺失，均為pCNV；根據(jù)CMA結(jié)果回顧染色體核型，考慮胎兒核型為46，XN，r(18)(p11.31→q21)；對(duì)孕婦及其家屬進(jìn)行遺傳咨詢后，孕婦及其家屬?zèng)Q定終止妊娠，遂于孕27周引產(chǎn)；對(duì)引產(chǎn)胎兒進(jìn)行尸檢發(fā)現(xiàn)胎兒眼距寬、人中短、全腭裂、左耳耳道閉鎖、隱性脊柱裂、右足內(nèi)翻和腦室部分狹窄，進(jìn)一步病理檢查提示雙側(cè)大腦神經(jīng)元分布紊亂。其他12例病例染色體核型分析與CMA檢測(cè)結(jié)果均正常。在非孤立性NT增厚患者中，共檢出4例pCNV，占25.00%(4/16)，其中僅通過(guò)CMA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)的pCNV有1例，占6.25%(1/16)；此例雖然通過(guò)核型分析可以判斷為18號(hào)的環(huán)狀染色體，但其斷裂點(diǎn)的判斷依然需要通過(guò)CMA來(lái)確認(rèn)，因此將其劃分為僅通過(guò)CMA才能檢出的pCNV。

對(duì)于胎兒NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間的病例通過(guò)CMA檢出pCNV情況見(jiàn)表1。

表1 胎兒NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間時(shí)CMA檢出pCNV情況(%)

討 論

一、NT增厚與胎兒染色體異常和pCNV的關(guān)系

早孕期超聲測(cè)量NT厚度已被廣泛用于篩查胎兒染色體異常、pCNV、胎兒結(jié)構(gòu)異常(主要是胎兒先天性心臟異常)[1，9-11]。約20%的NT增厚胎兒存在染色體異常[12]，文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)NT厚度在其分布的P95以上時(shí)，胎兒罹患染色體異常的幾率為20%～30%[12-13]，其發(fā)生率隨NT厚度的增加而增加；NT厚度在其分布的P95和P99之間時(shí)，胎兒染色體異常的發(fā)生率為7%；NT厚度在3.5～4.4 mm時(shí)，胎兒染色體異常的發(fā)生率為20%；NT厚度在5.5～6.4 mm時(shí)，胎兒染色體異常的發(fā)生率為50%；NT厚度在8.5 mm以上時(shí)，胎兒染色體異常的發(fā)生率為75%[12]。Yang等[14]對(duì)296例NT>3 mm的病例進(jìn)行核型分析，發(fā)現(xiàn)19.9%(59/296)的病例存在染色體異常。Scott等[15]對(duì)120例NT>6.5 mm的胎兒進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)74%的胎兒存在染色體異常。

大量研究證明NT的增厚也與胎兒pCNV有關(guān)[1-3，9，16-20]。Grande等[2]對(duì)NT增厚、胎兒染色體核型正常病例進(jìn)行CMA檢測(cè)的文獻(xiàn)進(jìn)行系統(tǒng)回顧和薈萃分析，結(jié)果顯示有額外5%的病例可通過(guò)CMA檢測(cè)獲得遺傳學(xué)診斷(95%CI：2.0-8.0)；對(duì)于孤立性NT增厚的病例，有額外4%的病例可通過(guò)CMA檢測(cè)獲得遺傳學(xué)診斷(95%CI：2.0-7.0)；對(duì)于非孤立性NT增厚的病例，則有額外7%的病例可通過(guò)CMA檢測(cè)獲得遺傳學(xué)診斷(95%CI：2.0-12)。最常見(jiàn)的pCNV是22q11.2缺失、22q11.2重復(fù)、10q26.3缺失和12q21q22缺失。Bornstein等[3]對(duì)3 314例染色體核型正常胎兒的高危指標(biāo)進(jìn)行評(píng)估，這些高危指標(biāo)包括：(1)NT異常(>3 mm)；(2)有主要結(jié)構(gòu)畸形；(3)超聲軟指標(biāo)異常，研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)NT超過(guò)3 mm時(shí)pCNV的發(fā)生率為4.3%。上述研究結(jié)果提示，應(yīng)對(duì)NT增厚胎兒進(jìn)行產(chǎn)前染色體核型分析和CMA檢測(cè)，并給予相應(yīng)遺傳咨詢。

二、不同NT增厚切割值的胎兒染色體異常和pCNV檢出情況

NT是指胎兒頸后的皮下液體積聚，通常在妊娠11～13+6周時(shí)可經(jīng)超聲觀察到。NT的厚度受孕周影響，這也是胎兒正常發(fā)育的一部分。僅當(dāng)NT的厚度超過(guò)一定切割值時(shí)才考慮其為異常[21]。以往的文獻(xiàn)中對(duì)于NT增厚的定義存在很多不同的意見(jiàn)，也有多種關(guān)于NT增厚切割值的定義。究竟是以單一的切割值(如3 mm或3.5 mm)，還是以NT分布的P95或P99作為切割值，仍然存在較多爭(zhēng)論。對(duì)于NT的分布而言，胎兒不同頭臀長(zhǎng)(crown-rump length，CRL)所對(duì)應(yīng)的NT值的分布范圍是不同的。研究表明，當(dāng)胎兒CRL為45 mm時(shí)，其NT分布的P95對(duì)應(yīng)的厚度為2.1～2.2 mm，NT分布的P99對(duì)應(yīng)的厚度為2.8 mm；當(dāng)胎兒CRL為84 mm時(shí)，其NT分布的P95對(duì)應(yīng)的厚度為2.7～2.8 mm，NT分布的P99對(duì)應(yīng)的厚度為3.4 mm[6]。

國(guó)外絕大多數(shù)研究都以3.5 mm作為固定的切割值，即當(dāng)胎兒CRL在45～84 mm之間時(shí)，如果NT厚度≥3.5 mm，需要對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)[20，22-25]；而針對(duì)3.5 mm以下NT厚度病例的研究則很少。Petersen等[8]對(duì)丹麥中央?yún)^(qū)和荷蘭鹿特丹地區(qū)胎兒NT厚度在3.0～3.4 mm之間的兩個(gè)隊(duì)列的病例進(jìn)行回顧性研究，一共有552例病例被納入研究。結(jié)果顯示，胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)為1∶7.4(13.5%，95%CI：8.2%-21.5%)，其中69.1%的病例為胎兒13、18、21三體，可以通過(guò)無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前檢測(cè)(non-invasive prenatal testing，NIPT)被篩查出來(lái)；但有16.2%的病例為性染色體異常或>10 Mb的染色體不平衡性重排，有14.7%的病例只能通過(guò)CMA被檢出CNV(其中90%為pCNV)，這些病例是無(wú)法通過(guò)NIPT被篩查出來(lái)的。作者提出，對(duì)于NT厚度在3.0～3.4 mm之間時(shí)，胎兒染色體異常的風(fēng)險(xiǎn)大于1∶10。按照目前國(guó)際婦產(chǎn)科超聲協(xié)會(huì)(ISUOG)關(guān)于NIPT的共識(shí)意見(jiàn)，對(duì)于染色體異常風(fēng)險(xiǎn)大于1∶10的高風(fēng)險(xiǎn)孕婦，不應(yīng)對(duì)其進(jìn)行NIPT檢測(cè)，應(yīng)對(duì)這部分病例進(jìn)行包含CMA檢測(cè)在內(nèi)的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)[26]。

對(duì)于胎兒NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間的病例則鮮有研究。Maya等[7]對(duì)2011年11月到2015年11月期間以色列的數(shù)個(gè)醫(yī)學(xué)中心對(duì)孤立性NT增厚病例的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，其研究目的是評(píng)估NT厚度在3.0～3.4 mm之間是否可以作為產(chǎn)前CMA檢測(cè)的適應(yīng)證。一共有770例病例被納入研究，作者將其分為3組：A組為NT≤2.9 mm的病例，作為正常對(duì)照組，共462例；B組為NT厚度在3.0～3.4 mm之間的病例，共170例；C組為NT≥3.5 mm的病例，共138例。所有病例均進(jìn)行產(chǎn)前染色體核型分析和CMA檢測(cè)，3組中pCNV的檢出率分別為1.7%、6.5%和13.8%。在這項(xiàng)研究中，作者是將所有NT≤2.9 mm的病例作為正常對(duì)照組，其pCNV的檢出率為1.7%，和其他文獻(xiàn)[27]報(bào)道的超聲正常胎兒的pCNV檢出率相似，但作者并沒(méi)有針對(duì)NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間的病例進(jìn)行分析。

本研究對(duì)115例NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間的病例進(jìn)行包含CMA檢測(cè)在內(nèi)的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)。在孤立性NT增厚的99例病例中，共檢出3例異常病例，均為染色體非整倍體，其中2例為21三體，1例為47，XXX，胎兒染色體非整倍體的發(fā)生率為3.03%(3/99)，高于背景人群發(fā)生率[28]。結(jié)果顯示在該組人群中，胎兒染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)增加，但僅通過(guò)CMA才可以檢測(cè)到的pCNV風(fēng)險(xiǎn)并不增加。在非孤立性NT增厚的16例病例中，共檢出4例異常病例，其中3例為18三體，通過(guò)染色體核型分析和CMA均可檢出；1例pCNV僅通過(guò)CMA檢出，胎兒在18p11.32p11.21區(qū)段存在12.3 Mb片段的缺失，在18q22.2q23區(qū)段存在9.7 Mb片段的缺失，均為pCNV，最終根據(jù)CMA結(jié)果回顧染色體核型，考慮胎兒核型為46，XN，r(18)(p11.31→q21)。此例雖然通過(guò)核型分析可以判斷為18號(hào)的環(huán)狀染色體，但其斷裂點(diǎn)的判斷依然需要通過(guò)CMA檢測(cè)來(lái)確認(rèn)，因此將其劃分為僅通過(guò)CMA檢測(cè)才能檢出的pCNV。在非孤立性NT增厚的病例中，染色體異?？傮w發(fā)生率為25%，而僅通過(guò)CMA檢測(cè)檢出的pCNV發(fā)生率為6.25%，提示在非孤立性NT增厚的病例中，胎兒染色體非整倍體和pCNV的風(fēng)險(xiǎn)均增加。

有研究表明胎兒pCNV的發(fā)生率與孕婦年齡無(wú)關(guān)，為1/270[29-30]。在Wapner等[27]的前瞻性研究中，不合并超聲異常的胎兒pCNV發(fā)生率為1.7%。Callaway等[31]對(duì)12 362例產(chǎn)前CMA檢測(cè)的病例進(jìn)行回顧性分析，對(duì)于不合并超聲異常的病例，包括孕婦高齡、血清學(xué)篩查高風(fēng)險(xiǎn)人群中或者是孕婦焦慮要求進(jìn)行產(chǎn)前CMA檢測(cè)群體中，pCNV發(fā)生率分別為1.0%和1.1%。綜合以上研究，不合并超聲異常的胎兒pCNV的發(fā)生率在1.0%到1.7%之間。本研究中非孤立性NT增厚組的pCNV檢出率明顯高于不合并超聲異常的胎兒pCNV的發(fā)生率。

本研究結(jié)果顯示，對(duì)于NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間的病例，孤立性NT增厚時(shí)胎兒染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)增加，而在非孤立性NT增厚病例中，胎兒染色體非整倍體和pCNV的風(fēng)險(xiǎn)均增加。建議以NT厚度在其分布的P95作為NT增厚的切割值，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)，尤其是對(duì)于非孤立性NT增厚的病例，建議進(jìn)行包含CMA檢測(cè)在內(nèi)的產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)。而對(duì)于孤立性NT增厚的病例，胎兒染色體非整倍體風(fēng)險(xiǎn)增加，但非整倍體類型除了21三體之外，也包括性染色體異常，因此不宜采用NIPT進(jìn)行篩查，建議對(duì)其進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)，至少進(jìn)行染色體核型分析，是否需要對(duì)此類病例進(jìn)行產(chǎn)前CMA檢測(cè)，尚需進(jìn)一步積累病例進(jìn)行研究。

三、本研究的不足之處

本研究的數(shù)據(jù)來(lái)源于單個(gè)產(chǎn)前診斷中心，且其中部分病例來(lái)自于外院高危轉(zhuǎn)診。一方面由于病例樣本數(shù)較少；另一方面，涉及的人群較為混雜，不是背景人群，因此本研究并沒(méi)有計(jì)算NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間的發(fā)生率。

雖然病例數(shù)有限，但研究結(jié)果顯示，當(dāng)NT厚度在其分布的P95到2.9 mm之間時(shí)，胎兒染色體異常風(fēng)險(xiǎn)增加，建議將NT厚度在其分布的P95作為NT增厚的切割值，對(duì)胎兒進(jìn)行產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)。當(dāng)NT增厚為非孤立性表現(xiàn)時(shí)，胎兒染色體非整倍體及pCNV風(fēng)險(xiǎn)均升高，產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)的方案應(yīng)包含CMA檢測(cè)；當(dāng)NT增厚為孤立性表現(xiàn)時(shí)，胎兒染色體非整倍體異常風(fēng)險(xiǎn)增加，但pCNV風(fēng)險(xiǎn)并不增加，產(chǎn)前遺傳學(xué)檢測(cè)方案至少應(yīng)包含產(chǎn)前染色體核型分析，是否需要進(jìn)行CMA檢測(cè)尚需進(jìn)一步積累病例進(jìn)行研究。